CN1052868A - 利用天然神经节苷脂或其衍生物来稳定并维持神经生长因子的生物学活性 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由蛋白质和神经节苷脂生成的新的， 稳定的，并且具有生物学活性的络合物，即由神经生 长因子的β亚基(βNGF)和天然的神经节苷脂或它 的半合成类似物，如羧酸酯和酰胺生成的稳定而又具 有生物学活性的络合物，以及含有这种络合物的药物 组合物，它的治疗用途和生产方法。

Description

本发明涉及由蛋白质和神经节苷脂生成的新的，稳定而又具有生物学活性的络合物，即由神经生长因子的β亚基（βNGF）和天然神经节苷脂或其半合成类似物，如羧酸酯和酰胺或其生物学上可接受的盐生成的稳定而又具有生物学活性的络合物;以及含有这种络合物的药物组合物，它的治疗用途及其生产方法。
神经节苷脂，即含有唾液酸的糖鞘脂、通常存在哺乳动物的细胞膜中，还发现在神经组织中其浓度最高。在细胞膜外层神经节苷脂的定位表明，它们在细胞识别、生长和分化方面起着重要作用。已经知道，细胞表面的神经节苷脂和其他结合糖脂组分在分化期间和细胞成熟过程中会发生变化。在正常人的脑中，四种特殊的神经节苷脂，即GM1、GDla、GDlb和GTlb占所有神经节苷脂的近80-90%。
神经节苷脂由一个主要的、亲水的唾液酸低聚糖基团和由一个在其氮原子上被脂肪酸酰化的鞘氨醇构成的、疏水的神经酰胺部分组成。
神经节苷脂在引起神经元的塑性变化方面起作用，它能在细胞培养物中促进轴突生长和中枢及外周神经系统的轴突生长。
越来越明显，不仅神经系统的发育，而且神经系统的修复都是由作用于细胞表面的分子的胞外信号控制。
尽管对糖脂在神经元细胞表面上的表现和功能的详细研究才刚刚开始，神经节苷脂已经表现出在调节神经元发育和修复方面起着突出的作用。在神经元发育过程中，大脑神经节苷脂的特性会发生显著的量变和质变。
据报导，内服神经节苷脂能使得外周神经系统（PNS）在受损伤以后的神经再生和功能恢复变得容易（Ceccarell;B.etal.，Adv.Exp.Med.Biol.71∶275，Plenum Press，New York，1976;Gorio A.etal.Neuroscience 8∶417，1983）。另据报导，使用神经节苷脂，尤其是通常所说的GM1的单唾液神经节苷脂（根据Svennernolm命名法，J.Neurochemistry 10，613，1963），能改善因损害中枢神经系统（CNS）而产生的后果（Toffano G.et al.，BrainReS.261∶163，1983;Cuello A.C.et al.，Dev.Brain Res.376∶373，1986）。很多近期研究表明，神经节苷脂可能在调节神经营养因子的体外活性方面具有调节功能。例如，已经有报导说外源神经节苷脂GM1能增强PC-12（它是受神经生长因子NGF刺激的细胞）中轴突的生长（Matta S.G.et al.，Dev.Brain Res.，27∶243，1986），类似地，GM1能增强由NGF诱导的、起源于脊胚胎的神经节的神经元和由NGF诱导的交感神经节的神经突的生长（Skaper S.D.et al.，Imt.J.Dev.Neurosci.3∶187，1985;Skaper S.D.et al.，Dev.Brain Res.23∶19，1985）。
最近的评价GM1在体内影响NGF活性的可能性研究结果表明，神经营养因子NGF在中枢神经系统疾病之后维持细胞的成活方面也许起着主要作用（Cuello A.C.et al.，in∶A new intramembrane integrative mechanism62，Kjell Kuxe and L.Agnati Editors，1987）。有趣的是，有报导说用GM1治疗，不仅能使得多巴胺能的和去甲肾上腺素能的神经元里的神经元细胞易于存活，而且能使得已知对NGF有反应的胆碱能的神经元里的神经元细胞易于存活。
在发育期间NGF对交感神经元和靶神经支配的必要性，构成了该生长因子对其靶细胞的主要营养作用的重要的证据。
已观察到NGF含量与巨细胞胆碱能神经元分布之间的显著相关性。在这些被观察的已知靶-外周交感组织区域里的巨细胞胆碱能神经元的神经分布区和包含它们细胞体的区域，如海马里都观察到较高含量的NGF。基础前脑胆碱系统的完整性和认识的功能之间的这种关系也存在于人类。早老性痴呆的主要神经病理学特征之一就是巨细胞胆碱能神经元的大量损失，尽管其它传感系统也发生了各种形式的突变。因此，现在应该认真考虑NGF和机体病理学之间的可能联系以及早老性痴呆的潜在的疗法了。
通过重组DNA生物技术方法产生人类NGF的可能性，是实验研究的基础。至于治疗结果，在实验损害胆碱能系统以后观察到的好处表明，通过外源供给和内源产生刺激都能显著提高这些神经元的NGF的可用性。生物技术方法的发展，不断生产出越来越多的有潜在治疗作用的蛋白质及其肽。作为药物使用，这些大分子存在着特殊而又复杂的问题。目前，系统地使用这些具有药物学活性的肽的唯一方法是通过皮下、肌内或颅内注射，尤其是NGF。每天或每周需要注射几次的治疗方式有很多缺陷，包括病人不同意和令人不快的药物代谢动力学，蛋白质替换疗法尤其如此。
在本领域进行研究的目的之一是开发能提高蛋白质的稳定性而又不妨碍其生物学活性的化学方法。通过脂质体技术开发了多种生物学产品。然而，这些生物学产品存在着各种问题，如用来吸收蛋白质的化学物质的专一性较差，在体内同器官有特殊的相互作用，该络合物由一批再生出另一批的能力较差，以及用来吸收蛋白质的化合物的未知的药物代谢动力学。
一方面通过评价神经营养因子的问题和潜在的药物学用途，另一方面评价神经节苷脂在体内的生物学活性，有可能制备出具有生物学活性的两类化合物的合适络合物，并能满足上述专一性、稳定性和可选择的生物可用性要求。这些特性能在体外和体内实验模型中得到证实。
因此，本发明主要涉及由神经营养因子NGF的β亚基和天然的神经节苷脂或半合成的神经节苷脂类似物所形成的络合物，它是通过在室温和弱碱性条件下让溶解在水溶液里的这两种组份相互接触而得到的。
附图的简单说明如下：
图1表示GM1-NGF（β亚基）络合物在同亲和纯化的抗小鼠NGF（β亚基）免疫球蛋白反应之后的免疫吸印结果。
图2表示GM1-βNGF络合物在小鼠生命的第6天对由VNB诱导的心脏中NA下降的影响。
该络合的两种成份的重量比可以有很大的变化，不过，神经营养因子和神经节苷脂的比例最好在1∶100，000和1∶10之间。在该范围内，最重要的络合物是神经营养因子∶神经节苷脂的比例为1∶1000的那些络合物。
根据本发明，所用的神经生长因子β亚基（βNGF）可以用已知方法从人或动物的组织中分离;例如，从哺乳动物或细胞培养基中，应当采用通过重组DNA技术获得的人的βNGF：最好采用从人的胎盘组织或牛的精液中获取的制剂。
不过，βNGF也能通过分子生物学技术制备，例如，象EP-B-121，338所公开的重组DNA技术。
本发明的新的络合物具有与βNGF相同的生物学活性，正如在体外对PC-12细胞系进行实验所证实的。因此，可将其用于需要以βNGF为基础的制剂进行治疗的所有场合，例如，神经系统的老化。这种新络合物还能用于治疗药物或预防药物中，而神经节苷脂的特殊功效在新络合物中被保持下来是很有用的。例如，在βNGF与神经节苷脂GM1的络合物对抗GM1多克隆抗体的作用中所看到的免疫化学活性。
新的βNGF-神经节苷脂络合物及其衍生物的生物学活性可以在实验动物上得到证实，正如采用络合物βNGF-GM1的实施例1中所讲述的。
有用的半合成神经节苷类似物的例子是功能衍生物，如美国专利US  4，713，374中描述的唾液酸羧基酯或酰胺;美国专利US  4，593，091和欧洲专利EP-0072722中描述的内酯。美国专利US  4，713，374中描述的在唾液酸、糖类以及可能是神经酰胺羟基上过酰化的衍生物，也是功能衍生物。其它有用的半合成神经节苷脂类似物的例子是被称为溶原神经节苷脂的物质，即在鞘氨醇氮上脱酰化的神经节苷脂和/或脱-N-乙酰神经节苷脂和脱-N-乙酰-溶原神经节苷脂，其中，神经氨酸残基上的氮也是脱酰化的，还有具有超级脂肪酸如软脂酸或硬脂酸，或由任何其他脂族酸、芳族酸、脂环族酸或杂环族酸衍生出的酰基，也可能被其他功能基团，尤其是极性基团取代的神经节苷脂衍生类似物。在其他的半合成类似物中，除了这里提到的“非自然”酰基以外，还可能有与神经氨酸氮原子上的乙酰基不同的酰基存在。
用于本发明络合物中的半合成化合物及其功能衍生物，如酯、酰胺、内酯和过酰化衍生物是已知的和/或在美国专利US  4，593，091和US  4，713，374中公开的。
根据本发明，任何具有NANA基团，即N-乙酰神经氨酸的神经节苷脂都能与βNGF生成络合物。
络合物一词是指神经节苷脂的NANA基团与NGF的β亚基之间的缔合物。这种缔合物是两种化合物之间离子和氢相互作用的结果，这就是本发明的络合物同神经节苷脂和βNGF简单混合的区别。
作为制备新的络合物的基础的神经节苷脂最好是从前面所述包括大部分脑神经节苷脂，即GM1、GDla、GDlb、和GTlb以及上述功能衍生物和由它所产生的半合成类似物的神经节苷脂组中选择的那些神经节苷脂。
根据本发明，神经节苷脂盐也能被用于上述目的，例如，金属盐，象碱金属和碱土金属盐或铝和镁盐或者有机碱盐，最好是治疗上可以接受的含氮碱的盐，例如氨基醇盐，象乙醇胺盐。
而且，根据本发明，有可能获得由神经营养因子和神经节苷脂或它的上述衍生物的酸加成盐，例如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、甲磺酸盐和酒石酸盐生成的络合物。
有关βNGF因子和神经节苷脂或它的衍生物生成的新络合物的所有性质和用途也认为是上述盐类引起的，因此，这也是本发明特殊的方面。
应当特别强调由下述神经节苷脂GM1的酯和酰胺衍生出来的那些络合物：由碳原子数最多为8个的醇类，象甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、戊醇和己醇，还有正己醇和正辛醇衍生出来的脂肪酸酯和由碳原子数最多为8个的胺类，象甲胺、乙胺、丙胺、己胺或辛胺衍生出来的脂族酰胺。
在神经节苷脂的羟基上过酰化的衍生物包括，但不限于乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、戊酸酯、琥珀酸酯和丙二酸酯。
制备上述蛋白质和神经节苷脂或其衍生物或盐的新络合物的方法大体上包括：在存在和不存在有机溶剂，如低级脂族醇、低级酮、低级二烷基胺或亚砜的条件下，使产生络合物的两种组分在水溶液里相互接触;其他条件是在室温或稍高于室温的温度，如50℃和弱碱性介质中，例如，在无机或有机碱类，象氨或低级脂族胺、碱或碱土金属水合物或相关的碳酸盐或乙酸盐。在这些条件下，明显形成可溶于水的神经节苷脂盐，使得缩合反应容易进行。神经营养因子也能溶解于水溶液如碱性乙酸盐水溶液中，或者它也能悬浮于神经节苷脂溶液里。
反应可以持续几小时至几天，但通常持续12至24小时。
蛋白质-神经节苷脂衍生出来的络合物，可以通过已知方法，如实施例1中说明的方法，从反应混合物中分离，并能通过它的生物学活性和与该蛋白质专有的单克隆和多克隆抗体的免疫化学识别，或采用超离心沉降系统来进行鉴定。
本发明的另一个目的也是一种含有一种或一种以上NGF的β亚基和神经节苷脂的新络合物、一种它的上述衍生物或半合成类似物或它的盐，尤其是在上文详细讨论过的那些的络合物作为有效成份的药物组合物。这种药物组合物可以口服、直肠使用、肠外使用或局部使用。因此，可将其做成固体或半固体形式，例如，丸剂、片剂、胶状囊、胶囊、栓剂或软胶囊。对于肠外施用，有可能采用可用于肌内或皮下注射、输液、静脉注射或大脑内注射的形式。结果，它们可以以活性化合物的溶液形式出现，或者以活性化合物的冻干粉末与药物学上能接受的一种或一种以上适于上述用途而且其渗透性与生理液体相一致的赋形剂或稀释剂混合形式出现。
至于局部使用，制剂是喷雾剂的形式，例如吸入喷雾剂、乳脂或局部使用的软膏比较有用。
本发明的制剂可以对人或者动物使用。在溶液、喷雾剂、软膏和乳脂中活性成分的含量最好在0.01%和10%之间，而在固体制剂中活性成分的含量在1%和100%之间，最好在5%和50%之间。使用的剂量取决于个体的需求、要求的效果和所选择的用药方式。
本发明还包括神经节苷脂或其衍生物与神经生长因子NGF的β亚基的所有络合物对上述情形的治疗用途。
人的日用药量在0.01-100mg/kg体重之间变化。
人的日注射剂量（皮下、肌内或大脑内注射）在每公斤体重0.05-5mg活性物质的范围内变化。
下面的实施例说明新络合物如何制备，制备工艺，药物制剂及其用途。
实施例1
材料和方法
按照Ageletti  P.V.等在Natl.Acad.Sci.USA64，787，1969中所述的方法提纯小鼠NGF（β亚基）。按照Skaper  S.D.等在Exp.Neural，76∶655，1982中所述的方法，用从E8小鸡脊根神经节（DRGE-8）“解离的”胚胎细胞进行体外研究。对抗小鼠NGF以抑制NGF（β亚基）的生物学活性而产生的抗体的研究，采用前文所述的体外模式来评价。
GM1、NGF（β亚基）和GM1-NGF（β亚基）络合物的免疫活性通过免疫吸印技术来测定。
抗小鼠NGF（β亚基）的NGF多克隆抗体通过亲和色谱法来提纯，采用如K.Stoeckel等在J.Neurochem，26∶1207，1976中所述的与琼脂糖4B（Sepharose  4B）结合的2.5S小鼠NGF。
抗单唾液酸神经节苷脂GM1的GM1多克隆抗体是通过将GM1固定在Sepharose 4B上的亲和色谱法来提纯的。
NGF（β亚基）和神经节苷脂络合物的等密度沉降是按照Ulrich-Bott  B.等在Journal  of  Lipid  Research  25，1233，1984中所述的方法进行的。
将单唾液酸神经节苷脂GM1（例如5mg）溶解于CHCL3/MeOH（比例3∶1）中。溶剂在氮气保护下蒸发。单唾液酸神经节苷脂被再悬浮于pH8.5的50mM NH4OH中1小时。浓度臂如为10mg/ml的单唾液酸神经节苷脂GM1和高度纯化的小鼠NGF（β亚基）被溶解于pH5.0的50mM乙酸钠中，并保温，以获得重量比为1∶1000的βNGF-GM1。该混合物在pH8.5在搅拌下保温，例如，在室温下过夜。在4℃条件下获得同样的结果。
通过阴离子交换色谱将生物学络合物βNGF-GM1从未反应的βNGF中提纯出来，例如，在分析用的单Q柱上，用pH8.5的50mM NH4OH平衡。该βNGF-GM1络合物用在pH8.5的50mM NH4OH中梯度为0-1.0M的乙酸铵洗脱。流速为1ml/min。未反应的βNGF由外水体积洗脱。βNGF-GM络合物在第15-18分时间范围内被浓度为0.15-0.25M的乙酸铵洗脱。这些都是实验条件，在这些条件下有12μg的NGF（β亚基）与1mg的单唾液酸神经节苷脂GM1结合。
βNGF-GM1络合物的化学、免疫化学和生物学特性在体外评价如下：
a）提纯的βNGF-GM1络合物在免疫吸印技术中表现出保持其抗提纯的由抗小鼠NGF（β亚基）而产生的多克隆抗体的免疫活性（图1）。
b）提纯的βNGF-GM1络合物在DRG-E8上表现出生物学活性。
c）βNGF-GM1络合物的生物学活性能被浓度为60μg/ml的经亲和纯化的多克隆抗体和浓度为500μg/ml的单克隆抗体抑制。没有GM1的βNGF的生物学活性能被浓度为30μg/ml的经亲和纯化的多克隆抗体和浓度为100μg/ml的单克隆抗体抑制。
d）通过免疫吸印技术，与有生物学活性的βNGF-GM1络合物相关的同一个带表现出抗由抗NGF（β亚基）和抗单唾液酸神经节苷脂GM1而产生的多克隆抗体的反应性。
e）经DRG-E8评价的βNGF-GM1的生物学活性，在βNGF-GM1于低pH缓冲液中和在有二价离子（例如40mM CaCl2）存在条件下保温之后仍被保持下来。
f）βNGF-GM1络合物的稳定性在有人的血清存在时，在37℃下能维持96小时。
g）βNGF-GM1络合物的生物学活性在经蛋白酶消化（例如2%（W/W）的胃蛋白酶，pH2.0，室温，16小时）以后被保持。在相同条件下，蛋白酶能抑制没有GM1的βNGF的活性。
h）在不同温度条件下（例如4℃、37℃、45℃）保存之后，βNGF-GM1的生物学活性仍被保持。在相同保存条件下（指时间和蛋白质浓度），没有单唾液酸神经节苷脂GM1的βNGF完全丧失其生物学活性。
i）用等密度沉降试验时，βNGF-GM1络合物停留在密度为1.298g/cm3之处。
在与亲和纯化的抗小鼠NGF（β亚基）免疫球蛋白反应之后，GM1-NGF（β亚基）络合物的免疫吸印结果如图1所示。
A栏：色谱分离之前的GM1-NGF络合物。
B栏：asialo GM1-βNGF络合物。
C栏：小鼠NGFβ亚基是二聚体状态，GM1和βNGF按前述方法在室温下保温2小时。asialo GM1和NGF的保温是在相同条件下进行。
βNGF-GM1络合物在体内的生物学活性是在动物模型上试验的，试验中βNGF的生物学活性受到一种化合物的抑制。采用了两种性别的新生Sprague-Dawley小鼠。所有系统注射都是用浓度为0.01ml/g体重的络合物在皮下进行的。用盐水制备硫酸长春花碱（VNB）溶液，在其生命的第3天，每只小鼠按0.15mg/kg体重的剂量用药。用VNB处理过的小鼠再分成3组：第1组接受盐水溶液处理，第2组接受βNGF（例如，0.1mg/kg的βNGF）处理，第3组接受βNGF-GM1络合物（例如，0.1mg/kg的βNGF和30mg/kg的单唾液酸神经节苷脂GM1）。这些动物在其生命的第6天被杀死，迅速取出心脏，在干冰中冰冻并于-80℃贮存备用。
测定心脏里去甲肾上腺素（NA）的含量。如图2中所显示的，使用VNB导致了心脏中NA含量的明显下降（第1组），并对没有GM1的βNGF的使用（第2组）和βNGF-GM1络合物的使用（第3组）有明显的颉抗作用。
而且，这些结果表明，在体内βNGF-GM1对交感神经系统是有生物学活性的，其生物学活性比βNGF高。
实施例2
采用与实施例1所述完全相同的方法，通过重组DNA技术获得由单唾液酸神经节苷脂GM1和人的NGF（β亚基）生成的NGF-神经节苷脂络合物。其体外和体内的特性与实施例1中所述相同。
实施例3
由从颌下腺中提纯的神经节苷脂GDla和βNGF生成的络合物按照在实施例1中所述的实验条件下制备。
在用DRG-E8试验时，GDla-βNGF仍保持其生物学活性。该络合物用等密度沉降试验时停留在密度为1.3496g/cm3的地方。
实施例4
由从颌下腺中提纯的神经节苷脂GDlb和βNGF生成的络合物按照在实施例1中所述的实验条件下制备。
在用DRG-E8试验时，GDlb-βNGF仍保持其生物学活性，该络合物用等密度沉降试验时停留在密度为1.3596g/cm3之处。
实施例5
由从颌下腺中提纯的GTlb和βNGF生成的络合物是在实施例1中所述试验条件下获得的。
在用DRG-E8试验时，GTlb-βNGF仍保持其生物学活性。络合物用等密度沉降试验时停留在密度为1.3700g/cm3的地方。
实施例6
按照实施例1中所述试验条件制备由GM1的内酯和NGF的β亚基生成的络合物。
实施例7
按照实施例1中所述的试验条件制备由GM1的甲酯和NGF的β亚基生成的络合物。
实施例8
按照实施例1中所述的试验条件制备由GM1的乙酯和NGF的β亚基生成的络合物。
实施例9
按照实施例1中所述的试验条件制备由GM1的异丙基酯和NGF的β亚基生成的络合物。
实施例10
按照实施例1中所述的试验条件制备由GM1的叔丁基酯和NGF的β亚基生成的络合物。
实施例11
按照实施例1中所述的试验条件制备由GM1的苄基酯和NGF的β亚基生成的络合物。
实施例12
按照实施例1中所述的试验条件制备由GM1的甲酰胺衍生物和NGF的β亚基生成的络合物。
实施例13
在实施例1中所述的试验条件下制备由GM1的乙酰胺衍生物和NGF的β亚基生成的络合物。
实施例14
在实施例1中所述的试验条件下制备由GM1的苄酰胺衍生物和NGF的β亚基生成的络合物。
实施例15
在实施例1中的试验条件下制备由GM1的异丙基酰胺衍生物和NGF的β亚基生成的络合物。
由各种神经节苷脂衍生物和神经生长因子的β亚基生成的所有络合物，在用DRG-E8培养物试验时都表现出生物学活性。
药物制剂
含有神经节苷脂-βNGF络合物的药物制剂的配制，包括制备对病人使用的药物学上可接受的组合物的已知方法，而且，有可能将有效量的络合物与药物学上可接受的赋形剂混合。
适合的赋形剂和它的包括其他蛋白质的配方在“Remington′s  Pharmaceutical  Sciences”一书（Remington′S  Pharmaceutical  Sciences，Mack  Publishing  Company，Easton，Pa.，USA，1985）中有记载。这些赋形剂包括可以注射的“沉积配方”。
在此基础上，该药物组合物含有（但不排除其他可能）与一种或一种以上药物学上可接受的赋形剂或稀释剂相混合的GM1-βNGF络合物溶液或GM1-βNGF络合物的冻干的粉末，而且包含在一种PH适当，与生理体液等渗的缓冲介质中。含有GM1-βNGF络合物的各种配方可以当作神经节苷脂衍生物-βNGF络合物药用制剂的实例，该制剂取决于需要的生物学活性和用药方式。
表1是可以以溶液形式制备的用来治疗神经系统的机能障碍的制剂实施例，只是作为说明性的例证，而不局限于此。如果是冻干的制剂，可以采用（但不排除其他可能）甘露糖醇或甘氨酸作为载体赋形剂，并提供需要体积的合适的缓冲液，以便得到适当的PH理想的等渗缓冲溶液。类似的溶液可以用于在需要体积的等渗溶液里的GM1-βNGF络合物的药物制剂，还包括（但不排除其他可能）使用由磷酸或柠檬酸以适当浓度缓冲的盐水溶液，以便在任何时间都能得到理想PH的，例如中性的等渗药物制剂。
为了说明，表2和表3给出了用于神经系统机能障碍治疗的药物制剂的实施例。
表3中系统4和系统5给出了配成两瓶供一次使用的药物制剂。第一瓶含有组合物重量大约0.01%-50%的活性物质和药物学上可接受的赋形剂，如甘氨酸或甘露糖醇。第二瓶含有用适当体积的由磷酸或柠檬酸缓冲的盐水溶液配制的溶液。两只药瓶里的内容物在使用前立即混合，并将冻干的活性物质迅速溶于其中，形成可以注射的溶液。表3中还列出了用于皮下注射的药物制剂的可能的实施例（系统5）。
本发明络合物可以通过与适当的药物载体或稀释剂混合制成药物组合物，并能以常规的方法配制成用于口服或肠外使用的固体、半固体、液体或气体状态的制剂，如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、药膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、气雾剂。下述方法和赋形剂只是说明用的，而不受限制。
以吸入剂或气雾剂为例，本发明的液体或细末状态的络合物由气体或液体喷洒剂填满气雾剂罐，如有需要可采用常规的添加剂，如增湿剂。还可将其作为无压缩的药物制剂用于喷雾器或雾化器中。
药物制剂还包括，但不仅限于此，肠道使用的具有亲脂的赋形剂的栓剂，例如水溶性自乳化赋形剂，如糖胶或者类似的物质。在这些制剂中，GM1-βNGF络合物的含量在赋形剂总重量的0.001%-1%的范围内变化。该栓剂另外还可以含有适量的乙酰水扬酸盐。
表4仅是出于说明的目的列出了用于神经系统机能障碍治疗的栓剂形式的制剂。
GM1-βNGF络合物的药物制剂的剂量和使用次数取决于要求的效果（由临床试验决定）和使用方式，例如，剂量和使用次数可以与通常用于研究的其它神经营养剂类似。
表1.可注射溶液的药物实施例
制剂1.一支2ml安瓿含有：
GM1-βNGF络合物 2mg单唾液酸神经节苷脂GM1
1ug（8.000BU）βNGF
氯化钠  16mg
PH7的柠檬酸的  2ml
蒸馏水缓冲液
制剂2.一支2ml安瓿含有：
GM1-βNGF络合物 5mg单唾液酸神经节苷脂GM1
10μg（8.000BU）βNGF
氯化钠  16mg
PH7的柠檬酸的  2ml
蒸馏水缓冲液
生物学单位（BU）是由Fenton，E.L.在Expl  Cell  Res.59∶383，1970的文章中定义的。
表2.药物组合物系统的实施例
系统1.
a）一支2ml药瓶含有：
冻干的活性物质 1.5mg单唾液酸神经节苷脂GM1
4μg（32.000BU）βNGF
甘氨酸  30mg
b）一支2ml溶剂瓶含有：
氯化钠  16mg
柠檬酸的  2ml
蒸馏水缓冲液
系统2
a）一支2ml的安瓿含有
冻干的活性物质 1.5mg单唾液酸神经节苷脂GM1
4μg（32.000BU）βNGF
甘露糖醇  40mg
b）一支2ml溶剂瓶含有：
氯化钠  16mg
柠檬酸的蒸馏  2ml
水缓冲液
系统3
a）一支3ml安瓿含有：
冻干的活性物质 3mg单唾液酸神经节苷脂GM1
10μg（80.000BU）βNGF
甘氨酸  45mg
b）一支3ml溶剂瓶含有
氯化钠  24mg
柠檬酸的蒸馏  3ml
水缓冲液
表3.药物组合物系统的实施例
系统4.
a）一支3ml药瓶含有：
冻干的活性物质 3mg单唾液酸神经节苷脂GM1
10μg（80.000BU）βNGF
甘露糖醇  60mg
b）一支3ml溶剂瓶含有：
氯化钠  24mg
柠檬酸的蒸馏  3mg
水缓冲液
系统5（肌内注射实施例）
a）一支2ml安瓿含有：
冻干的活性物质 1.5mg单唾液酸神经节苷脂GM1
5μg（40.000BU）βNGF
甘氨酸  30mg
b）一支2ml溶剂瓶含有：
氯化钠  16mg
柠檬酸的蒸馏  2ml
水缓冲液
表4.直肠里使用的栓剂形式药物组合物的实施例
制剂1.
GM1-βNGF络合物 3mg单唾液酸神经节苷脂GM1
10μg（80.000BU）βNGF
可可油  2.5gr
制剂2.
GM1-βNGF络合物 3mg单唾液酸神经节苷脂GM1
10μg（80.000BU）βNGF
聚乙二醇1540  1.75gr
聚乙二醇6000  0.75g
制剂3.
GM1-βNGF络合物 3mg单唾液酸神经节苷脂GM1
10μg（80.000BU）βNGF
吐温61  2.125gr
羊毛脂  0.25gr
制剂4
GM1-βNGF络合物 3mg单唾液酸神经节苷脂GM1
10μg（80.000BU）βNGF
甘油  1.5gr
水  0.75gr
明胶  0.25gr
很显然，上述本发明中的这些方法能以各种方式进行改进。这些改进，不能认为是背离本发明的精神和范围的，对于本领域技术人员来说是显而易见的任何改进都落在本发明的范围之内。

Claims (29)

1、一种络合物，它主要由NGF的β亚基和从由天然的神经节苷脂或上述天然神经节苷脂半合成的类似物或由它产生的生理学上可接受的盐组成的组中选择的神经节苷脂生成的。
2、如权利要求1所述的络合物，其特征在于上述βNGF因子和神经节苷脂的重量比在1∶100，000和1∶10之间。
3、如权利要求2所述的络合物，其特征在于上述βNGF与神经节苷脂的重量比大约为1∶1000。
4、如权利要求1-3中任何一个所述的络合物，其特征在于上述神经节苷脂是从由GM1、GDla、GDlb和GTlb组成的一组物质中选择出来的一种天然的神经节苷脂。
5、如权利要求1-3中任何一个所述的络合物，其特征在于上述神经节苷脂是一种溶原神经节苷脂。
6、如权利要求1-3中任何一个所述的络合物，其特征在于上述神经节苷脂是一种脱N-乙酰-神经节苷脂或一种脱N-乙酰-溶原神经节苷脂。
7、如权利要求1-3中任何一个所述的络合物，其特征在于上述神经节苷脂具有一个鞘氨醇酰基，其中上述酰基是由除天然神经节苷脂中存在的酸以外的酸衍生的，这种酸是从由脂族酸、芳族酸、脂环族酸和杂环族酸组成的组中选择的，并可被至少一个功能基团任意取代。
8、如权利要求1-3中任何一个所述的络合物，其特征在于上述神经节苷脂是一种具有一个酰基的神经节苷脂衍生物，该酰基是由除天然神经节苷脂中存在的酸以外的酸衍生的，这种酸是从由脂族酸、芳族酸、脂环族酸或杂环族酸组成的组中选择的，并可被至少一个功能基团任意取代。
9、如权利要求1-3中任何一个所述的络合物，其特征在于上述神经节苷脂是一种既具有鞘氨醇基团又具有神经氨酸酰胺基团的神经节苷脂衍生物，其中一个或二个上述基团被除天然神经节苷脂中存在的酸以外的酸酰化，其中上述酸是从由脂族酸、芳族酸、脂环族酸和杂环族酸组成的组中选择的，并可被至少一个功能基团任意取代。
10、如权利要求1-3中任何一个所述的络合物，其特征在于上述神经节苷脂的半合成类似物是从由GM1、GDla、GDlb和GTlb的半合成类似物组成的组中选择的。
11、如权利要求1所述的络合物，其特征在于上述神经节苷脂是神经节苷脂GM1的脂族酯，该脂族酯最多具有8个碳原子。
12、如权利要求1所述的络合物，其特征在于上述神经节苷脂是GM1的脂族酰胺，该脂族酰胺最多具有8个碳原子。
13、如权利要求1所述的络合物，其特征在于上述神经节苷脂是神经节苷脂GM1的过乙酰化物、过丙酰化物、过丁酰化物、过戊酰化物、过琥珀酰化物或过丙二酰化物。
14、如权利要求1-13中任何一个所述的络合物，它是βNGF-GM1的络合物。
15、如权利要求1-13中任何一个所述的络合物，它是βNGF-GDla络合物。
16、如权利要求1-13中任何一个所述的络合物，它是βNGF-GDlb络合物。
17、如权利要求1-13中任何一个所述的络合物，它是βNGF-GTlb络合物。
18、如权利要求1-13中任何一个所述的络合物，它是βNGF-GM1内酯络合物。
19、一种制备如权利要求1中所述络合物的方法，包括在室温或略高于室温和碱性条件下让NGF的β亚基与神经节苷脂在有或没有其它有机溶剂的水溶液中接触，并收集所述络合物。
20、如权利要求19所述的方法，其特征在于上述有机溶剂是低级二烷基酰胺或二乙基亚砜。
21、在治疗应用中权利要求1-26中之一所述的由NGF神经营养因子的β亚基和天然的神经节苷脂或神经节苷脂的半合成类似物生成的络合物。
22、一种药物组合物它包括有效量的由NGF的β亚基和天然的神经节苷脂或神经节苷脂的半合成类似物或它的生理学上可接受的盐生成的络合物和药物学上可接受的载体。
23、如权利要求1-22中的一个所述的由NGF神经营养因子的β亚基和神经节苷脂生成的络合物的治疗用途。
24、如权利要求1所述的由NGF神经营养因子的β亚基和神经节苷脂生成的络合物用于神经病理学治疗的治疗用途，包括根据治疗需要给病人使用有效量的上述络合物。
25、如权利要求24所述的由神经营养因子NGF的β亚基和神经节苷脂生成的络合物用于治疗神经系统老化。
26、如权利要求24所述的由NGF神经营养因子的β亚基和神经节苷脂生成的络合物用于治疗困扰神经系统的慢性神经衰退疾病或慢性免疫性疾病。
27、如权利要求24所述的由神经营养因子NGF的β亚基和神经节苷脂生成的络合物用于制备治疗神经病理学疾病用的药物组合物。
28、如权利要求27所述的由NGF神经营养因子的β亚基和神经节苷脂生成的络合物用于由神经系统的老化引起的神经病理学病变或困扰神经系统的慢性神经衰退疾病或慢性免疫学疾病的治疗。
29、一种由NGF的β亚基和天然的神经节苷脂或上述天然神经节苷脂的半合成类似物或它的生理学上可接受的盐生成的络合物。
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