CN105274248A - 鸭短喙长舌综合征纳米pcr检测试剂盒及其检验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸭短喙长舌综合征纳米PCR检测试剂盒及其检验方法。所述试剂盒包括蛋白酶K，裂解液，醋酸钠，饱和酚?氯仿?异戊醇，无水乙醇，无菌蒸馏水，其特征在于所述试剂盒还包括2×NanoPCR？Mix、上游引物和下游引物，其中，上游引物的序列为SEQ？ID？No.1所示，下游引物的序列为SEQ？ID？No.2所示。该试剂盒可用于检测鸭短喙长舌综合征。本发明还提供了一种采用前述试剂盒进行鸭短喙长舌综合征检测的方法，能够快速、特异的检测鸭短喙长舌综合征，大大提高了鸭短喙长舌综合征的检测效率及鸭短喙长舌综合征病毒的特异性扩增产量。
Description
技术领域
本发明涉及鸭短喙长舌综合征的检测技术领域。
背景技术
2014年11月份以来，我国江苏、安徽、山东、江西、河南、河北等省份，商品肉鸭群发生了不明原因的以雏鸭发育迟缓，上下喙萎缩，舌头外伸、肿胀、向下弯曲为特征的疾病。根据其临床表现，该病暂定名为“鸭短喙长舌综合征”。该病的发病率为10-30%，严重时可达50%以上，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失。目前已证实，该病的病原为新型鸭源细小病毒，也称为鸭短喙长舌综合征病毒。
鸭短喙长舌综合征的检测方法主要包括病毒分离、聚合酶链式反应（PCR）等，这些方法在病毒检测中发挥了重要作用。其中PCR检测方法由于操作简单，灵敏性高、重复性好等优点被广泛应用。但在实际应用中，PCR技术存在诸多局限性，例如对复杂体系的扩增会出现非特异性产物扩增以及扩增效率不够高等问题。为解决以上问题，寻找可以提高 PCR 特异性和效率的添加剂显得极其重要。
纳米PCR技术是一种新型的PCR技术，其原理是把粒径为1nm～100nm的固相纳米金属颗粒悬浮在液体中形成纳米流体。由于纳米材料具有良好的热传导性，因此在添加了纳米金颗粒的PCR循环体系中，PCR反应会更快地达到目标温度，减少了在非目标温度的停留时间，进而缩短整个体系达到温度平衡所用的时间，减少非特性扩增，提高特异性扩增产量。因此，目前亟需建立一种能够快速、特异的检测鸭短喙长舌综合征的纳米PCR检测手段。
发明内容
本发明针对上述现有技术的不足，提供了一种用于鸭短喙长舌综合征检测的纳米PCR试剂盒及其应用，该试剂盒能够快速、特异的检测鸭短喙长舌综合征。
本发明所采取的技术方案是：一种用于鸭短喙长舌综合征检测的纳米PCR试剂盒，包括蛋白酶K，裂解液，醋酸钠，饱和酚׃氯仿׃异戊醇，无水乙醇，无菌蒸馏水，其特征在于所述试剂盒还包括2×NanoPCR
Mix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为SEQ ID No.1所示，所述下游引物的序列为SEQ ID No.2所示。
引物是根据GenBank公布的鸭短喙长舌综合征病毒序列，在其Rep与VP1基因保守序列区域设计的一对特异性引物。
优选的，2×NanoPCR Mix由 DNA聚合酶、2×NanoPCR buffer和dNTP
Mixture组成。
优选的，所述试剂盒还包括DNA提取试剂：蛋白酶K，裂解液，醋酸钠，饱和酚׃氯仿׃异戊醇，无水乙醇，无菌蒸馏水。
优选的，所述试剂盒还包括阳性对照。
其中，阳性对照可为将鸭短喙长舌综合征病毒接种9-11日龄鸭胚后，收集96～144小时感染鸭胚的尿囊液。
本发明还提出了所述的试剂盒在制备检测待测样品中是否含有鸭短喙长舌综合征病毒的产品中的应用。
应用所述试剂盒检测待测样品中是否含有鸭短喙长舌综合征病毒的方法，包括如下步骤：
1、病毒DNA的提取
取300 μL经过预处理的待测样品置于1.5 mL离心管中，加入10mg/ml蛋白酶K 10μL，裂解液300μL，50℃孵育2h后加入610μL tris饱和酚，充分震荡5min，12000 rpm离心10 min；将上清转移至新1.5mL离心管中加等体积酚：氯仿：异戊醇（1：24：25），充分混匀12000 rpm离心10 min；取上清，加酚：氯仿：异戊醇重复抽提一次；抽提后将上清转移至新1.5 mL离心管中，加入2倍体积冰浴后无水乙醇，1/10体积3 mol/L醋酸钠，-20℃沉淀45 min后12000 rpm离心10 min，弃上清，真空干燥箱干燥5min，用20μL无菌蒸馏水溶解沉淀，-20℃贮存备用。
待测样品可为鸭脾脏、肝脏等组织。其中，待测样品预处理的方法为：将待测样品剪碎后，按照1:5的质量体积比加入生理盐水并研磨均匀，3000～5000
rpm离心5～10
min后取上清，之后再进行DNA的提取。
2、纳米PCR反应
在反应管中加入10μL 2×NanoPCR Mix、1μL上述DNA溶液、0.5μL 10µM的上游引物（SEQ ID No.1） 、0.5μL
10µM的下游引物（SEQ ID No.2），最后加入无核酸酶水至总体积为20μL。
混匀后按如下反应程序进行：94℃ 3min，1个循环；94℃ 10s, 55℃ 40 s，72℃ 20 s，共30个循环；72℃ 5 min 1个循环。反应结束后，经1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物，若出现659 bp大小的条带则待测样品含有鸭短喙长舌综合征病毒。
本发明提供了一对检测鸭短喙长舌综合征病毒的特异性引物，利用其制成的纳米PCR试剂盒，能够快速、特异的检测鸭短喙长舌综合征病毒。本发明可使PCR反应更快地达到目标温度，减少了在非目标温度的停留时间，进而缩短整个体系达到温度平衡所用的时间，大大提高了鸭短喙长舌综合征的检测效率，并有效提高了鸭短喙长舌综合征病毒的特异性扩增产量，减少了非特异性扩增，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为鸭短喙长舌综合征纳米PCR检测结果；
M：DL2000 Marker； 1：阳性对照；2:阴性对照；
图2为鸭短喙长舌综合征纳米PCR敏感性检测结果；
M: DL2000 Marker；1～6依次为100～10-5倍比稀释病毒核酸的扩增产物；7:阴性对照；
图3为鸭短喙长舌综合征纳米PCR特异性检测结果。
M:DL2000
Marker；1: 鸭短喙长舌综合征病毒；2:鸭瘟病毒；3:鸭肝炎病毒；4：新城疫病毒；5：禽流感病毒; 6：阴性对照。
具体实施方式
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。 但是本发明不限于所给出的例子。下述实施例中所使用的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 一种检测鸭短喙长舌综合征的纳米PCR试剂盒最佳实施例
本实施例试剂盒包括：（1）鸭短喙长舌综合征DNA提取试剂：蛋白酶K，裂解液，醋酸钠，饱和酚׃氯仿׃异戊醇，无水乙醇，无菌蒸馏水。
（2）纳米PCR反应试剂： 2×NanoPCR Mix 、上游引物、下游引物；（4）其他：阳性对照和无核酸酶水。其中，2×NanoPCR Mix由 DNA聚合酶、2×NanoPCR buffer和dNTP Mixture组成，阳性对照为将鸭短喙长舌综合征病毒接种9-11日龄鸭胚后，收集96～144小时感染鸭胚的尿囊液，引物为冻干粉，HPLC纯。本实施例试剂盒包含的引物序列见表1。
表1引物序列
| 引物 | 序列 (5’-3’) |
| 上游引物（SEQ ID No.1） | AAACTTACTGAGCCCGTTCCTG |
| 下游引物（SEQ ID No.2） | GCGACGCTGTCTGCTTTATTGA |
实施例2 非诊断目的以纳米PCR法检测鸭短喙长舌综合征病毒的方法
本实施例检测方法采用实施例1中的试剂盒。取发病鸭脾脏、肝脏为待测样品。
本实施例检测方法包括以下步骤 ：
1、病毒DNA提取
具体步骤如下：（1）将待测样品剪碎后，按照1:5的质量体积比加入生理盐水并研磨均匀，3000～5000rpm离心5～10分钟后取上清，取上清。（2）分别取300μL上述处理后待测样品以及阳性对照，加入蛋白酶K 10μL，细胞裂解液300μL，50℃孵育2h后加入610μL tris-平衡酚，充分震荡5min，12000 rpm离心10 min。（3）将上清转移至新1.5mL离心管中加等体积酚：氯仿：异戊醇（1：24：25），充分混匀12000 rpm离心10 min。（4）取上清，加酚：氯仿：异戊醇重复抽提一次。（5）抽提后将上清转移至新1.5mL离心管中，加入2倍体积冰浴后无水乙醇，1/10体积3mol/L醋酸钠，-20℃沉淀45min后12000 rpm离心10 min，弃上清，真空干燥箱干燥5min，用20μL无菌蒸馏水溶解沉淀，-20℃贮存备用。
2、纳米PCR反应：分别在反应管中加入10μL 2×NanoPCR Mix、1μL 上述cDNA溶液、0.5μL 上游引物（10μM）、0.5μL 下游引物（10μM），最后加无核酸酶水至体积为20 μL，混匀。
反应程序如下：94℃ 3min，1个循环；94℃ 10s, 55℃ 30 s，72℃ 40 s，共30个循环；72℃ 5 min 1个循环。
3、电泳检测：反应结束后，经1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物，鸭短喙长舌综合征的阳性对照样本扩增产物的条带大小为659 bp，结果见图1。若待测样品电泳检测后出现659 bp大小的条带则含有鸭短喙长舌综合征病毒，反之则不含有鸭短喙长舌综合征病毒。
实施例3 鸭短喙长舌综合征纳米PCR检测方法的敏感性试验
通过超微量分光光度计测量，计算鸭短喙长舌综合征病毒总DNA浓度为225 ng/µL的核酸模板进行敏感性试验。同时采用纳米PCR与普通PCR方法对10倍稀释的鸭短喙长舌综合征核酸模板检测。
鸭短喙长舌综合征病毒的纳米PCR和普通PCR操作过程按照实施例2 进行，其中，普通PCR反应将步骤3中的2×NanoPCR Mix换成2×PCR反应液，其组成如下：DNA聚合酶、2×PCR buffer、dNTP Mixture，其余操作过程保持不变。
用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果如图2所示。可见，普通PCR最低能检测到22.5 ng/µL鸭短喙长舌综合征核酸模板，而纳米PCR最低能检测到2.25×10-1
ng/µL鸭短喙长舌综合征核酸模板。纳米PCR反应是普通PCR反应敏感性的100倍。
实施例4 鸭短喙长舌综合征纳米PCR检测方法的特异性试验
按照实施例2的方法，分别对鸭短喙长舌综合征病毒（duck
beak atrophy and dwarfish syndrome virus,DBADSV）、鸭瘟病毒（duck
plague virus,DPV), 鸭肝炎病毒（duck hepatitis virus,DHV),
禽流感病毒（avain influenza virus,AIV) 和新城疫病毒（newcastle disease virus,NDV)的标准参考毒株，以及灭菌超纯水的阴性对照进行纳米PCR反应，检测纳米PCR方法的特异性。以上扩增产物均用 1％的琼脂糖凝胶电泳进行分析。
结果如图3所示，鸭短喙长舌综合征核酸扩增出了与预期大小相符的659bp的条带，而阴性对照以及其他4种病毒核酸均未扩增出任何条带。上述结果表明本发明纳米PCR检测方法能特异性扩增鸭短喙长舌综合征核酸，而不与其它病毒核酸发生交叉反应，本发明纳米PCR检测方法具有很好的特异性。
本发明可使PCR反应更快地达到目标温度，减少了在非目标温度的停留时间，进而缩短整个体系达到温度平衡所用的时间，大大提高了鸭短喙长舌综合征的检测效率，并有效提高了鸭短喙长舌综合征病毒的特异性扩增产量，具有检测快速、特异性高的优点。
Claims (5)
1.一种用于鸭短喙长舌综合征检测的纳米PCR试剂盒，包括蛋白酶K，裂解液，醋酸钠，饱和酚׃氯仿׃异戊醇，无水乙醇，无菌蒸馏水，其特征在于所述试剂盒还包括2×NanoPCR Mix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为SEQ ID No.1所示，所述下游引物的序列为SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求１所述的用于鸭短喙长舌综合征检测的纳米PCR试剂盒，其特征在于所述2×NanoPCR Mix由 DNA聚合酶、2×NanoPCR
buffer和dNTP Mixture组成。
3.根据权利要求1所述的用于鸭短喙长舌综合征检测的纳米PCR试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括DNA提取试剂：蛋白酶K，裂解液，醋酸钠，饱和酚׃氯仿׃异戊醇，无水乙醇，无菌蒸馏水。
4.根据权利要求1所述的用于鸭短喙长舌综合征检测的纳米PCR试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括阳性对照。
5.如权利要求 1～4 任一项所述的试剂盒在制备检测待测样品中是否含有鸭短喙长舌综合征病毒的产品中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510827633.4A CN105274248A (zh) | 2015-11-25 | 2015-11-25 | 鸭短喙长舌综合征纳米pcr检测试剂盒及其检验方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN201510827633.4A CN105274248A (zh) | 2015-11-25 | 2015-11-25 | 鸭短喙长舌综合征纳米pcr检测试剂盒及其检验方法 |
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Family
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| Country | Link |
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| CN (1) | CN105274248A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108872580A (zh) * | 2018-06-19 | 2018-11-23 | 山东农业大学 | 一种检测新型鹅细小病毒的胶体金试纸条及其制备方法 |
-
2015
- 2015-11-25 CN CN201510827633.4A patent/CN105274248A/zh active Pending
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 刘清岱等: "纳米粒子PCR研究进展", 《生物学通报》 * |
| 陈浩等: ""鸭短喙长舌综合征"初步研究", 《山东农业大学学报（自然科学版）》 * |
| 陈浩等: "樱桃谷肉鸭短喙长舌综合征病原的分离鉴定", 《中国兽医学报》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN108872580A (zh) * | 2018-06-19 | 2018-11-23 | 山东农业大学 | 一种检测新型鹅细小病毒的胶体金试纸条及其制备方法 |
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