CN105274052B - 细胞的回收方法及用于该方法的加工骨 - Google Patents

Abstract

本发明提供细胞的回收方法，其包括：制备骨的外表面被紧密附着于骨的外表面的包被剂包被，并且有贯通上述包被剂及骨的外表面而到达骨的内部的第1及第2孔的加工骨的工序；从上述第1孔向加工骨内导入液体的工序；及从上述第2孔回收含细胞的液体的工序。

Description

细胞的回收方法及用于该方法的加工骨

【技术领域】

本发明涉及使用骨的外表面被包被剂包被的加工骨的细胞的回收方法及该加工骨。

【背景技术】

骨，一般而言，其表面被骨膜覆盖。骨膜的内侧由骨质(致密质及海绵质)构成，在骨质的内侧有被称为髓腔的被骨髓填满的内腔。在骨髓中存在各种类的细胞，这些细胞被总称为骨髓细胞。

骨髓被作为造血器官为人所知，在骨髓细胞中含成熟及未成熟的血液细胞、以及造血干细胞。所以，为免疫学研究或毒性试验等的目的，进行着从实验动物的骨采集骨髓。

在狗及猴等的大动物的情况中，可在麻醉下由骨髓穿刺针从骨直接采集骨髓。另一方面，在大鼠及小鼠等的小动物的情况中，可摘出大腿骨而切除骨的两端部(骨端)，通过使用带注射针的注射器从截面向骨内注入胎牛血清(FBS)等的液体，使骨髓流出而采集(参照例如，Kakiuchi S.等人，J.Toxicol.Sci.，vol.29，No.2，p.101-111,2004)。

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

本发明人将通过向骨的内部注入液体而回收骨内的细胞的上述方法应用于从大动物摘出的骨。即，本发明人，从猪摘出的大腿骨中，纵向隔开间隔而开2个孔，从一个孔导入生理盐水，试着从另一孔回收含细胞的液体。结果，令人惊讶地，从孔不太回收得到含细胞的液体，其几乎全部自骨的表面漏出。如此，本发明人新发现，在由向骨内的液体的导入的细胞的回收方法中，由于液体自骨的表面漏出，无法以高收率回收骨内的细胞。

【解决课题的技术方案】

本发明人经锐意研究的结果发现，由向在骨的内部的液体的导入回收骨内的细胞的方法中，通过用包被剂覆盖骨的外表面，可抑制含细胞的液体从骨的外表面漏出，从而完成本发明。

本发明提供细胞的回收方法。此方法包括以下的工序。

(1)通过加工自活体采集的骨，制备加工骨的工序、

其中上述加工骨的上述骨的外表面由紧密附着于骨的外表面的包被剂包被，并且有贯通上述包被剂及上述骨的外表面而到达上述骨的内部的第1及第2孔，

(2)从上述第1孔向加工骨内导入液体的工序、及

(3)从上述第2孔回收含细胞的液体的工序。

另外，本发明提供上述的方法中使用的加工骨。此加工骨是，

(1)上述加工骨由从活体摘出的骨制备，

(2)上述骨的外表面由上述紧密附着于骨的外表面的包被剂包被，

(3)具有用于向骨内导入液体的第1孔和用于回收含细胞的液体的第2孔，

(4)上述第1及第2孔贯通上述包被剂及骨的外表面而到达骨的内部。

【发明效果】

由本发明，在由向骨的内部导入液体的回收骨内的细胞的方法中，使抑制含细胞的液体从骨的表面漏出，有效回收细胞成为可能。

【附图说明】

【图1】是对本实施方式的细胞的回收方法适宜的灌流系统的模式图。

【图2】是在实施例1中，向用聚二甲基硅氧烷(PDMS)包被的加工骨导入生理盐水时的照片。

【图3】是在比较例1中，向未包被的猪大腿骨导入生理盐水时的照片。

【图4】是在实施例2中，向用PDMS包被的加工骨导入生理盐水时的照片。

【图5】是在比较例2中，向未包被的猪大腿骨导入生理盐水时的照片。

【图6】是在实施例3中，向用环氧油灰包被的加工骨导入生理盐水时的照片。

【实施方式】

以下参照附图描述本发明的优选的实施方式。

本实施方式的细胞的回收方法(以下，也简称为“方法”)是从上述的加工骨的第1孔导入液体，从第2孔回收含细胞的液体的方法。本实施方式的方法可用手动方法实施，也可由使用送液泵等的灌流系统实施。适宜于本实施方式的方法的灌流系统之一例示于图1。图1所示的灌流系统主要由用包被剂102包被的骨101(加工骨)、灌流液瓶201、送液泵202、回收瓶301、连接它们的管401～407、以及三通活塞501及502构成。在图1中，箭头示作为灌流液的液体流的方向。

在图1所示的灌流系统中，可从导入口A经管404将任意的成分添加到液体。例如，可将细胞添加到液体而向骨内导入，观察回收后的该细胞的变化等。从而，在用本实施方式的方法回收的细胞中，不仅骨髓细胞，也含自外部添加的细胞。自回收口B可采样回收瓶301中回收的含细胞的液体。以下，对本实施方式的方法的各工序进行说明。

在本实施方式的方法中，首先进行制备骨的外表面由紧密附着于骨的外表面的包被剂包被，并且有贯通包被剂及骨的外表面而到达骨的内部的第1及第2孔的加工骨的工序。

制备成加工骨的骨也可为鱼类、两栖类、虫类、鸟类及哺乳类之任何的动物的骨，在它们之中，特别优选除人之外的哺乳类的骨。作为那样的哺乳类的动物，优选为用于动物实验的动物或家畜，例如，可举出猪、牛、马、山羊、绵羊、猴、狗、猫、兔、猪鼠、大鼠、小鼠等。

骨的种类不特别限定，如果是硬骨，则也可使用长骨、短骨、扁平骨及不规则骨的任何的种类的骨。作为长骨，例如，可举出上腕骨、桡骨、尺骨、中手骨、大腿骨、胫骨、腓骨、中足骨等。作为短骨，例如，可举出手根骨、足根骨等。作为扁平骨，例如，可举出头顶骨、胸骨、肋骨、肠骨等。作为不规则骨，例如，可举出椎骨、肩甲骨等。

在本实施方式的方法中，制备成加工骨的骨优选使用刚从动物摘出之后的骨。骨的摘出后不立即实施本实施方式的方法时，也可冷藏摘出的骨。冷藏温度可为一般温度、例如可为4℃。摘出后立即冷藏保存时，优选在摘出后1天以内使用。从动物摘出骨的方法本身是现有技术中公知的。

加工骨的制备工序包括将骨用包被剂包被的工序，及向骨开第1及第2孔的工序。在本实施方式中，进行包被骨的工序和向骨开第1及第2孔的工序的顺序不特别限定。例如，也可将骨用包被剂包被之后，贯通该包被剂及骨的外表面而向骨开到达骨的内部的孔。或者，也可在骨上开到达内部的孔之后，不堵塞该孔而用包被剂包被该骨。首先在骨上开孔时，将该骨用包被剂包被之前，例如，可通过将与孔有相同的直径的管或棒、优选注射针插入各孔，确保孔不被包被剂堵塞。

加工骨的第1及第2孔是贯通包被剂及骨的外表面而到达骨的内部的孔。在本实施方式中，骨上的孔的位置不特别限定。例如，向长骨的骨干等被骨膜覆盖的部分开孔时，第1及第2孔成为贯通包被剂及作为骨的外表面的骨膜而到达骨的内部的孔。另一方面，在骨的关节面无骨膜，关节面被关节软骨覆盖。从而，向骨的关节面开孔时，第1及第2孔成贯通包被剂及作为骨的外表面的关节软骨而到达骨的内部的孔。再有，向骨开孔的手段不特别限定，使用针或钻等的工具即可。

在本实施方式中，第1孔的深度优选为自此孔导入的后述的液体与骨髓接触成为可能的深度。另外，第2孔的深度优选为从此孔回收后述的含细胞的液体成为可能的深度。作为那样的第1及第2孔的深度，例如，是达骨质的深度，优选为达海绵质的深度，更优选为达髓腔的深度。

第1及第2孔的大小只要是液体的导入及含细胞的液体的回收是可能的大小就不特别限定。例如，第1及第2孔的直径是，为了液体的导入及含细胞的液体的回收而是与使用的管或注射针相同的直径即可，可将直径在0.3mm以上2.1mm以下的范围内适宜设定。

在本实施方式的方法中，由于向骨的内部导入液体而回收细胞，在第1孔和第2孔之间优选有一定的距离。第1孔和第2孔之间的距离根据骨的大小适宜决定即可。例如，在大腿骨等的长骨的情况中，可在接近一侧骨端的骨干部分开第1孔，在接近反对侧的骨端的骨干部分开第2孔。

在本实施方式中，第1及第2孔可为各自各1个，也可为多个。第1及第2孔的数可互相相同，也可不同。

在本发明中，包被剂通过紧密附着于骨的外表面，为了抑制要从第2孔回收的液体及细胞自骨的外表面漏出而使用。从而，包被剂只要是共具可紧密附着于骨的外表面、且可抑制从骨的外表面的液体及细胞的漏出的2个性质的物质、材料或制品，就不特别限定。作为那样的包被剂，例示有现有技术中公知的树脂、粘接剂、高分子膜、凝胶、石膏等。在本发明中，从这些包被剂之中可使用1种或2种以上。

在本实施方式中，骨内的细胞与后述的液体一同回收，所以包被剂优选有不透过水的性质。另外，骨干燥，则骨内的细胞有损伤的可能性，所以包被剂优选在骨的外表面湿的状态下也可紧密附着于骨。

在本实施方式中，只要包被剂和骨的外表面无隙间相接，则包被剂和紧密附着于骨的外表面的原理或形态等不特别限定。即，包被剂和骨的外表面可仅简单密接，也可机械结合，也可物理或化学地相互作用。作为机械结合，可举出通过包被剂流入骨的外表面的微小的凹部而固化的锚定效果。作为物理的相互作用，可举出由范德华力的结合及静电相互作用等。作为化学相互作用，可举出形成共价键或离子键的化学相互作用等。另外，在骨的外表面部分附着肉片等时，也可抑制从骨的外表面的液体漏出，则也可不完全地除去肉片等而用包被剂包被。在本说明书中包括，将一部分附着肉片等的骨的外表面用包被剂包被时，包被剂也“紧密附着于骨的外表面”。

作为包被剂的树脂，可使用固化性树脂、可塑性树脂等。作为固化性树脂，例示热固化性树脂、光固化性树脂等。作为可塑性树脂，例示热可塑性树脂等。作为热固化性树脂，可举出环氧树脂、硅酮树脂、苯酚树脂、尿素树脂、蜜胺树脂、不饱和聚酯树脂、苯氧基树脂、乙烯基酯树脂、呋喃树脂、二烯丙基酞酸酯树脂等。

作为热可塑性树脂，可举出聚氯乙烯、聚氯化亚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯－丙烯腈共聚物、高密度聚乙烯、中密度聚乙烯、低密度聚乙烯、亚乙基－醋酸乙烯酯共聚物、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯－苯乙烯共聚物、醋酸纤维素、聚对苯二甲酸乙二酯、氟化亚乙烯等。

作为光固化性树脂，可举出氨基甲酸丙烯酸酯、环氧丙烯酸酯、聚酯丙烯酸酯、聚丁二烯丙烯酸酯、丙烯酸硅、氨基树脂丙烯酸酯、脂环式环氧树脂、缩水甘油基醚环氧树脂、氨基甲酸酯乙烯基醚、聚酯乙烯基醚等。

在热固化性树脂及热可塑性树脂之中，有于常温固化的性质的树脂。作为那样的常温固化性树脂，可举出硅酮树脂、环氧树脂、苯酚树脂及聚甲基丙烯酸甲酯等，这些树脂特别适宜作为本实施方式的方法的包被剂。

作为包被剂的粘接剂可从无机系粘接剂、天然系粘接剂及合成粘接剂适宜选择。作为无机粘接剂，可举出硅酸钠、水泥、灰泥等。

作为天然系统粘接剂，可举出天然橡胶粘接剂、酪蛋白粘接剂、耐水性淀粉粘接剂、动物胶、白蛋白等。

作为合成粘接剂，可举出环氧树脂系统粘接剂、丙烯酸类树脂树脂系粘接剂、α烯烃树脂系粘接剂、聚乙烯树脂系统粘接剂、醋酸乙烯基树脂系粘接剂、氯乙烯树脂系粘接剂、亚乙基-醋酸乙烯基树脂系粘接剂、氰基丙烯酸系粘接剂、水性高分子-异氰酸酯系统粘接剂、氯丁二烯橡胶系粘接剂、苯乙烯-丁二烯橡胶系粘接剂、腈橡胶系粘接剂、聚硫化物系粘接剂、丁基橡胶系粘接剂、硅酮橡胶系粘接剂、聚苯乙烯系粘接剂、聚醋酸乙烯基系粘接剂、变性硅酮系粘接剂、聚烯烃系粘接剂、聚氨基甲酸酯系粘接剂、聚甲基丙烯酸酯树脂系粘接剂、苯酚树脂系粘接剂、尿素树脂系粘接剂、蜜胺树脂系粘接剂、间苯二酚系粘接剂、聚酯系粘接剂、聚亚胺系统粘接剂、硝酸纤维素粘接剂、甲基纤维素、羧甲基纤维素等。这些的合成粘接剂可是液体，也可为乳液。另外，如丙烯酸类树脂树脂系感压型粘着带一样，也可使用向适当的基材涂布粘接剂的带。

作为包被剂的高分子膜，可从活体高分子的膜及合成高分子的膜适宜选择。作为活体高分子的膜，例如，可举出壳聚糖、藻酸盐及果胶等的多糖类的膜、以及再生纤维素及纤维素三乙酸酯等的植物来源的纤维素膜等。另外，壳聚糖及藻酸盐交替积层而成的膜也适宜作为包被剂。作为合成高分子的膜，可举出聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、聚砜、聚醚砜、聚氯化亚乙烯、聚氯乙烯、中密度聚乙烯、低密度聚乙烯、聚丙烯、乙烯乙烯基醇共聚物等的膜。高分子膜的形状不特别限定，根据骨的形状，可从带、膜、片等的形状适宜选择。

作为包被剂的凝胶，可从以水作为溶剂包含的凝胶适宜选择，例如，可举出琼脂、明胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、聚羟乙基甲基丙烯酸酯凝胶等。

作为包被剂的石膏以硫酸钙作为主成分。在本实施方式的方法中，可使用半水石膏、二水石膏、无水石膏等。也可使用如Gips石膏一样的含烧石膏粉末和绵布的包被剂。

在本实施方式的方法中，导入的液体的优选的回收率是50％以上、再优选的回收率是80％以上。如果是此回收率，则可将从第2孔回收的液体中含的细胞在免疫学研究或毒性试验等中适宜地使用。从而，在本实施方式中使用的包被剂优选可以此回收率从第2孔回收液体，可抑制从骨的外表面的液体漏出。

上述的包被剂紧密附着于骨的外表面的方法可根据包被剂的种类或形态适宜选择。例如，可举出使用自液体的状态固化而成固体的状态的包被剂时，向在液体的状态的包被剂浸骨或将处于液体的状态的包被剂涂布于骨的外表面等，将骨全体用包被剂覆盖，在该状态下使包被剂固化。使用自油灰等的有可塑性的状态固化的包被剂时，可举出以有可塑性的状态的包被剂覆盖骨全体，在该状态下使包被剂固化。使用呈薄膜状的形态的包被剂时，可举出通过将该包被剂贴附于骨的外表面或用包被剂包被骨来覆盖骨全体。

在本实施方式的方法中，加工骨的制备工序之后，进行从第1孔向加工骨内导入液体的工序。在此工序中，导入的液体旨在与相比骨的骨膜或关节软骨更内侧的部分接触。例如，可举出使液体与骨质、优选为海绵质、更优选为骨髓接触。在本实施方式中，导入液体的手段不特别限定，可由带注射针的注射器等以手动方法导入液体，也可由使用送液泵的灌流系统导入液体。

液体的流速只要是含细胞的液体可从第2孔回收的流速，就不特别限定。作为那样的流速，器官等的灌流实验中一般地设定的流速即可，例如在0.01mL/min以上100mL/min以下，优选为0.1mL/min以上20mL/min以下的范围适宜设定即可。液体的量不特别限定，例如自0.01mL以上6000mL以下的范围适宜确定即可。

导入的液体的种类只要是不给细胞的生存产生影响的液体，就不特别限定，例如，可举出细胞培养中通常使用的液体培养基(例如，RPMI培养基(Roswell Park MemorialInstitute medium)、MEM培养基(Minimum Essential Media)、DMEM培养基(Dulbecco'sModified Eagle Medium)、Ham's F-12培养基等)、生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、器官保存液(UW液(University of Wisconsin solution)、ET-Kyoto液等)、血浆、血清或它们的混合物等。导入的液体的温度不特别限定，例如是4℃以上50℃以下，优选为20℃以上42℃以下，更优选为35℃以上38℃以下。

在液体中，也可添加任意的成分、例如，药剂、细胞、核酸、蛋白质、这些的混合物等。这些可预先添加到液体，也可自液体的导入途中添加。例如，图1所示的灌流系统可将这些成分从导入口A添加到液体。

药剂的种类不特别限定，例如，可举出对于细胞的生存或维持有用的药剂、给细胞的行为、活性或性质等带来变化的药剂等。作为对细胞的生存或维持有用的药剂，例如，可举出维生素、氨基酸、抗生物质、抗真菌剂等。作为给细胞的行为、活性或性质等带来变化的药剂，例如，可举出使脱甲基化剂及组蛋白脱乙酰化酶抑制剂等的细胞的后成的(表现遗传)状态变化的药剂、氯化锂等的与细胞的信号传递相关的药剂等。另外，药剂也可为用于将后述的核酸导入细胞的转染用试剂。

核酸的种类不特别限定，也可为DNA、RNA及它们的杂交体之任何。核酸也可是双链及单链之任何。核酸也可用染料、酶及放射性物质等的现有技术中公知的物质修饰。作为核酸，例如，可举出兴趣对象的基因、以及以该基因作为目标的探针、siRNA、shRNA及吗啉代寡核苷酸等。

蛋白质的种类不特别限定，例如，可举出给细胞的行为、活性或性质等带来变化的蛋白质等。作为那样的蛋白质，例如，可举出细胞因子、趋化因子、细胞生长因子、抗体及它们的混合物等。

细胞的种类不特别限定，也可为未分化细胞、前体细胞、及分化的细胞之任何。未分化的细胞只要是在活体内的发生学细胞谱系上未达最终分化的细胞，就不特别限制。作为那样的未分化细胞，例如，可举出干细胞及前体细胞。作为干细胞，可举出ES细胞(胚胎干细胞)、克隆ES细胞、iPS细胞(诱导性多能干细胞)、MUSE细胞(多系统分化应激耐受细胞)、间质干细胞、神经干细胞、上皮干细胞、肝干细胞、生殖干细胞、造血干细胞、骨骼肌干细胞等。

作为前体细胞，可举出血小板前体细胞、肝脏前体细胞、心脏前体细胞、神经前体细胞等。作为血小板前体细胞，可举出巨核细胞前体细胞、成巨核细胞、前巨核细胞等。作为肝脏前体细胞，可举出成肝细胞、肝前体细胞、肝星状细胞前体细胞、肝干细胞前体细胞、肝脏的血管内皮前体细胞、肝脏的间皮细胞前体细胞等。作为心脏前体细胞，可举出心肌前体细胞、心脏的血管内皮前体细胞等。作为神经前体细胞，可举出神经元前体细胞、神经胶质前体细胞、脑神经系统的血管内皮前体细胞等。

分化的细胞只要是在活体内的发生学细胞谱系上达最终分化的细胞，就不特别限定。作为那样的分化的细胞，例如，可举出成熟巨核细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞、肝间皮细胞、胆管上皮细胞、肝星状细胞、肝血窦内皮细胞、肝巨噬细胞、隐窝细胞、血管内皮细胞、胰腺管上皮细胞、胰腺导管细胞、腺泡中心细胞、腺泡细胞、朗格汉斯岛、心肌细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、1型肺胞上皮细胞、2型肺胞上皮细胞、苦参细胞、线毛上皮细胞、基底细胞、杯细胞、神经内分泌细胞、库尔奇茨基细胞、尿细管上皮细胞、尿路上皮细胞、柱状上皮细胞、肾小球上皮细胞、肾小球内皮细胞、足细胞、血管系膜细胞、神经细胞、星形胶质细胞、小神经胶质、少突胶质细胞等。

在本实施方式的方法中，进行从第2孔回收含细胞的液体的工序。在本实施方式中，回收液体的手段不特别限定，可由带注射针的注射器等以手动方法回收含细胞的液体，也可由如图1所示的灌流系统回收含细胞的液体。

在本实施方式中，导入一定量的液体之后，也可将回收含细胞的液体作为一系列的循环而重复此循环。使用如图1所示的灌流系统时，液体导入后，含细胞的液体的回收一旦开始，则可同时进行导入工序及回收工序。

在本实施方式中，回收的液体中含的细胞不限于骨髓细胞。即，向导入的液体添加上述的细胞时，此添加的细胞成为回收的对象。另外，这样的添加的细胞是未分化细胞或前体细胞时，来源于此细胞的细胞(例如，通过经过加工骨内部而分化的细胞等)也作为回收的对象。

在本实施方式中，上述的加工骨的制备工序、液体的导入工序及含细胞的液体的回收工序优选均在4℃以上50℃以下的温度范围的环境下进行。更优选的温度范围是15℃以上42℃以下，再优选的温度范围是20℃以上38℃以下。只要是此温度范围，就可最小限度抑制回收的细胞受的损伤。从而，包被剂优选在上述的温度范围紧密附着于骨。

在本实施方式中，从液体的导入开始至回收结束的时间依赖于流速及液体的量，但例如从30秒钟以上3000分钟以下，优选为1分钟以上1500分钟以下的范围适宜设定即可。

在本发明的范围，也包括用于上述的方法的加工骨。此加工骨是骨的外表面由紧密附着于骨的外表面的包被剂包被，有用于向骨内导入液体的第1孔和用于回收含细胞的液体的第2孔。此第1及第2孔贯通上述的包被剂及骨的外表面而达骨的内部。

用于本实施方式的加工骨的骨及包被剂等的材料、以及加工骨的制备方法及使用方法等与对本实施方式的细胞的回收方法描述的相同。

接下来，由实施例详细地说明本发明，本发明不限于这些实施例。

【实施例】

<实施例1>

在此实施例中，将用包被剂包被的猪大腿骨使用图1所示的灌流系统灌流生理盐水，确认导入的液体的回收效率。

【1.加工骨的制备】

【(1-1)大腿骨的摘出及孔的形成】

从用氯胺酮麻醉的猪(LWD系、体重30kg程度)摘出大腿骨，将得到的大腿骨于4℃储存。对大腿骨用电动钻在2处开直径1.2mm的孔，向这些孔插入注射针(18Gx1 1/2”、TERUMO株式会社制)。

【(1-2)骨的包被】

作为包被剂，使用硅酮树脂的聚二甲基硅氧烷(PDMS)。将SILPOT184(Toray DowCorning公司)和CATALYST SILPOT184(Toray Dow Corning公司)以10:1的比例混合，搅拌5分钟。搅拌后，将得到的混合液(PDMS溶液)用真空装置脱气处理15分钟。将向2个孔插入注射针的状态的大腿骨放入塑料箱，使脱气处理的PDMS溶液(600mL)流入塑料箱之中。将其放入烘箱，于40℃加热5小时而使PDMS固化，得到加工骨。

【2.细胞的回收】

【(2-1)灌流系统的构建】

本发明人为了向上述的加工骨导入液体而回收细胞，构建图1所示的灌流系统。此灌流培养系统由具备加工骨的灌流部100、用于将液体导入灌流部100的送液部200、用于回收从灌流部100排出的灌流培养液的回收部300、连接各构成要素的管401～407、以及，用于从外部导入任意成分的三通活塞501及用于采样的三通活塞502构成。以下，对灌流部100、送液部200及回收部300进行说明。

【(a)灌流部100】

在图1中，加工骨作为用包被剂102包被的骨101图示。向加工骨的各孔插入的2条注射针各自连接管403及405(Safeed延长管、TERUMO株式会社制)。将插入连接管403的注射针的孔作为用于导入液体的第1孔。将插入连接管405的注射针的孔作为用于回收导入含细胞的液体的第2孔。

【(b)送液部200】

将灌流液瓶201(2002-5000SD、5L、ASONE株式会社制)和送液泵202(MasterFlex送液泵07528-10、大和科学制)经管401(C-Flex泵管、制品编号6424-25、大和科学制)连结。向送液泵202连接管402(C-Flex泵管、制品编号6424-25、大和科学制)。将管402及403与三通活塞501(类型R型、旋塞规格360°、TS-TR2K、TERUMO株式会社制)连接。再者，向三通活塞501连接管404(C-Flex泵管、制品编号6424-25、大和科学制)。在本实施例中，进入灌流液瓶201的液体(生理盐水)由送液泵202从加工骨的第1孔向骨内导入。

【(c)回收部300】

将回收瓶301(2250-0020、Thermo Scientific公司制)和，三通活塞502(类型R型、旋塞规格360°、TS-TR2K、TERUMO株式会社制)经管406(C-Flex泵管、制品编号6424-25、大和科学制)连结。向此三通活塞502连接管405，再连接管407(C-Flex泵管、制品编号6424-25、大和科学制)。

【(2-2)灌流】

将生理盐水(100mL)以10mL/min的流速，从加工骨的第1孔向骨内导入。导入生理盐水时的照片示于图2。导入的生理盐水在骨髓中流动，可从第2孔回收含细胞的液体。回收的液体的量是99mL，回收率(回收的液体量/导入的液体量)是99％。

【3.考察】

可将导入的液体的几乎全部从第2孔回收，由此认为几乎无从骨的表面的液体的漏出。从而，通过用PDMS包被骨，抑制液体从骨的表面漏出，认为使用灌流系统的细胞回收是可能的。

<比较例1>

在此比较例中，不将猪大腿骨用包被剂包被，进行与实施例1同样的灌流实验。

【1.大腿骨的摘出及孔的形成】

与实施例1同样，向从猪(LWD系、体重30kg程度)摘出的大腿骨在2处开直径1.2mm的孔，向那些孔插入注射针(18Gx1 1/2”、TERUMO株式会社制)。将向各孔插入注射针的状态的大腿骨加载到敷纸巾的盘。

【2.细胞的回收】

【(2-1)灌流系统的构建】

向大腿骨的各孔插入的注射针连接管，构建与实施例1同样的灌流系统。此灌流系统换成实施例1的灌流部100的加工骨，除了使用本比较例的大腿骨以外，与实施例1的灌流系统相同。

【(2-2)灌流】

将生理盐水(100mL)以10mL/min的流速，从加工骨的第1孔向骨内导入。导入生理盐水之后，从大腿骨表面的各个位置发生漏液。漏液发生之时的照片示于图3。如图3所示，漏出的液体被敷在大腿骨的下的纸巾吸收。从第2孔回收的液体的量是9mL，回收率是9％。

【3.考察】

如果向骨灌流液体，则知导入的液体从骨的表面漏出。与实施例1的结果比较，则在使用未包被的骨的灌流系统中，导入的液体的回收率显著地降低，认为使用灌流系统的细胞回收是困难的。

<实施例2>

在此实施例中，用包被剂包被骨之后，开孔制备加工骨，确认向骨开孔的工序及包被骨的工序的顺序给液体的回收效率的影响的有无之外，由注射器的手动方法进行液体的导入及细胞的回收，确认液体的回收效率。

【1.加工骨的制备】

从用氯胺酮麻醉的猪(LWD系、体重30kg程度)摘出大腿骨，将得到的大腿骨于4℃储存。与实施例1同样，由SILPOT184(Toray Dow Corning公司)及CATALYST SILPOT184(Toray Dow Corning公司)制备脱气处理的PDMS溶液(600mL)。将大腿骨放入塑料箱，使PDMS溶液流入。将其于室温静置而使PDMS固化。由此，得到将猪大腿骨用PDMS包被的加工骨。向用PDMS包被的大腿骨用电动钻在2处开直径1.2mm的孔，向那些孔插入注射针(18Gx11/2”、TERUMO株式会社制)。

【2.细胞的回收】

向加工骨的各孔插入的2条的注射针的各自连接管(C-Flex泵管、制品编号6424-13、大和科学制)及注射器(20mL用、TERUMO株式会社制)。从一个注射器将生理盐水(25mL)导入骨内。导入生理盐水时的照片示于图4。将导入的液体回收到另一注射器。将此导入和回收的操作再重复3次，将计100mL的生理盐水导入骨内。回收的液体的量用量筒测定。回收的液体的量是99mL，回收率(回收的液体量/导入的液体量)是99％。

【3.考察】

可将导入的液体的几乎全部从第2孔回收，由此知进行包被骨的工序及向骨开孔的工序的顺序对回收的效率无影响。另外，通过用PDMS包被骨，认为以手动方法的细胞回收是可能的。

<比较例2>

在此比较例中，不将猪大腿骨用包被剂包被，进行与实施例2同样的实验。

【1.大腿骨的摘出及孔的形成】

与实施例1同样，向从猪(LWD系、体重30kg程度)摘出的大腿骨在2处开直径1.2mm的孔，向那些孔插入注射针(18Gx1 1/2”、TERUMO株式会社制)。将向各孔插入注射针的状态的大腿骨加载到敷纸巾的盘。

【2.细胞的回收】

向大腿骨的各孔插入的2条的注射针的各自连接管(C-Flex泵管、制品编号6424-13、大和科学制)及注射器(20mL用、TERUMO株式会社制)。从一个注射器将生理盐水(25mL)导入骨内。导入生理盐水之后，从大腿骨表面的各个位置发生漏液。发生漏液之时的照片示于图5。如图5所示，漏出的液体积存在盘中。将导入的液体从第2孔回收到另一注射器。将此操作再重复3次，将计100mL的生理盐水导入骨内。回收的液体的量是20mL，回收率(回收的液体量/导入的液体量)是20％。再有，漏出的液体的量是约74mL。

【3.考察】

与比较例1同样、知如果向骨导入液体，则导入的液体从骨的表面漏出。与实施例2的结果比较，则在未包被的骨中，导入的液体的回收率显著地降低，认为以手动方法的细胞回收是困难的。

<实施例3>

在此实施例中，用与实施例2不同的种类的包被剂包被骨之后，开孔，制备加工骨，探讨包被材的种类。另外，由注射器的手动方法进行液体的导入及细胞的回收，确认液体的回收效率。

【1.加工骨的制备】

【(1-1)大腿骨的摘出】

从用氯胺酮麻醉的猪(LWD系、体重30kg程度)摘出大腿骨，将得到的大腿骨于4℃储存。

【(1-2)骨的包被】

作为包被剂，使用环氧树脂系粘接剂的环氧油灰水中用(Cemedine株式会社制)。将环氧油灰(60g)搅拌混合至无色不均而成白色。用混合的环氧油灰覆盖大腿骨，将其于室温静置而使环氧油灰固化。由此，得到将猪大腿骨用环氧油灰包被的加工骨。向用环氧油灰包被的大腿骨用电动钻在2处开直径1.2mm的孔，向那些孔插入注射针(18Gx1 1/2”、TERUMO株式会社制)。

【2.细胞的回收】

向加工骨的各孔插入的2条的注射针的各自连接管(C-Flex泵管、制品编号6424-13、大和科学制)及注射器(20mL用、TERUMO株式会社制)。从一个注射器将生理盐水(25mL)导入骨内。导入生理盐水之时的照片示于图6。将导入的液体回收到另一注射器。将此导入和回收的操作再重复3次，将计100mL的生理盐水导入骨内。回收的液体的量用量筒测定。回收的液体的量是98.5mL，回收率(回收的液体量/导入的液体量)是98.5％。

【3.考察】

可将导入的液体的几乎全部从第2孔回收，由此认为几乎无从骨的表面的液体的漏出。从而，通过用环氧油灰包被骨，可抑制液体从骨的表面漏出，所以认为细胞回收是可能的。

<实施例4>

在此实施例中，向用实施例2的方法制备的加工骨导入液体，测定回收的液体中含的细胞的数。作为对照，使用未包被的骨。

【1.加工骨的制备】

与实施例2同样，得到将猪大腿骨用PDMS包被的加工骨。向用PDMS包被的大腿骨用电动钻在2处开直径1.2mm的孔，向那些孔插入注射针(18Gx1 1/2”、TERUMO株式会社制)。作为对照，向从猪(LWD系、体重30kg程度)摘出的大腿骨在2处开直径1.2mm的孔，向那些孔插入注射针(18Gx1 1/2”、TERUMO株式会社制)。

【2.细胞的回收】

【(2-1)从加工骨的细胞的回收】

向加工骨的各孔插入的2条注射针的各自连接管(C-Flex泵管、制品编号6424-13、大和科学制)及注射器(20mL用、TERUMO株式会社制)。从一个注射器将生理盐水(10mL)导入骨内。然后，将导入的液体回收到另一注射器。回收的液体的量是10mL，回收率是100％。

【(2-2)从未包被的大腿骨的细胞的回收】

向大腿骨的各孔插入的2条的注射针的各自连接管(C-Flex泵管、制品编号6424-13、大和科学制)及注射器(20mL用、TERUMO株式会社制)。从一个注射器将生理盐水(120mL)导入骨内。然后，将导入的液体回收到另一注射器。回收的液体的量是10mL，回收率是8.3％。

【3.细胞数的测定】

将从加工骨及未包被的大腿骨分别回收的液体用动物用血细胞分析装置XT-2000iv(Sysmex株式会社制)分析，测定细胞数。结果，作为有核细胞测定的细胞量，在从加工骨回收的液体中是32,335个细胞/μL，在从未包被的大腿骨回收的液体中是4,080个细胞/μL。

【4.考察】

在加工骨中，导入10mL的生理盐水，则可回收10mL的液体。与此相比，在未包被的骨中，为了回收10mL的液体，有导入12倍的120mL的生理盐水的必要。对于同量的回收液中含的细胞的数而言，自加工骨可回收未包被的骨的情况的约8倍的细胞。即，使用加工骨时的回收效率是使用未包被的骨时的回收效率的约96倍。如上所述，在使用加工骨的本实施方式的方法中，知含细胞的液体的漏出由包被剂抑制，可有效回收细胞。

【符号说明】

100：灌流部

101：骨

102：包被剂

200：送液部

201：灌流液瓶

202：送液泵

300：回收部

301：回收瓶

401～407：管

501及502：三通活塞A：导入口B：回收口箭头：灌流液的流

Claims (13)

1.细胞的回收方法，其包括：

通过加工从除人之外的活体采集的骨来制备加工骨的工序、

其中上述加工骨在上述骨的外表面由紧密附着于骨的外表面的不透过水的包被剂包被，并且有贯通上述包被剂及上述骨的外表面而到达上述骨的内部的第1及第2孔，

其中上述包被剂是选自树脂、粘接剂、高分子膜、凝胶及石膏的至少1种，

从上述第1孔向加工骨内导入液体的工序、及

从上述第2孔回收含细胞的液体的工序。

2.权利要求1所述的方法，其中向上述加工骨内导入的液体是液体培养基、生理盐水、器官保存液、血浆、血清或它们的混合物。

3.权利要求1所述的方法，其中向上述加工骨内导入的液体含选自细胞、核酸及蛋白质的至少1种。

4.权利要求1所述的方法，其中上述制备工序、上述导入工序及上述回收工序在4℃以上50℃以下的温度范围内进行。

5.权利要求4所述的方法，其中上述树脂是热固化性树脂、热可塑性树脂或光固化性树脂。

6.权利要求4所述的方法，其中上述树脂是选自硅酮树脂、环氧树脂、苯酚树脂及聚甲基丙烯酸甲酯的至少1种。

7.权利要求4所述的方法，其中上述高分子膜是选自活体高分子的膜及合成高分子的膜的至少1种。

8.权利要求7所述的方法，其中上述活体高分子的膜含选自壳聚糖、藻酸盐及果胶的至少1种多糖类。

9.权利要求4所述的方法，其中上述粘接剂是无机系粘接剂、天然系粘接剂或合成粘接剂。

10.权利要求1所述的方法，其中上述包被剂在4℃以上50℃以下紧密附着于上述骨。

11.权利要求1～10之任一项所述的方法，其中上述制备工序依次包括以下的工序：

(1)将上述骨的外表面用上述包被剂包被的工序；及

(2)形成贯通上述包被剂及上述骨的外表面而到达上述骨的内部的上述第1及第2孔的工序。

12.权利要求1～10之任一项所述的方法，其中上述制备工序依次包括以下的工序：

(1)形成贯通上述骨的外表面而到达上述骨的内部的上述第1及第2孔的工序；及

(2)将上述骨的外表面用上述包被剂包被的工序。

13.用于权利要求1所述的方法的加工骨，

其中上述加工骨由从活体摘出的骨制备，

上述骨的外表面由上述紧密附着于骨的外表面的不透过水的包被剂包被，

具有用于向骨内导入液体的第1孔和用于回收含细胞的液体的第2孔，

上述第1及第2孔贯通上述包被剂及骨的外表面而到达骨的内部，

其中上述包被剂是选自树脂、粘接剂、高分子膜、凝胶及石膏的至少1种。

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