CN105267564A - 萆薢总皂苷在制备防治糖尿病肾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种萆薢总皂苷有效部位的制备方法和应用，该有效部位由原薯蓣皂苷、甲基原薯蓣皂苷、纤细皂苷、原纤细皂苷、薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元组成，可单独或与药学上可接受载体混合，用于制备治疗糖尿病肾病的药物。药效实验表明，萆薢总皂苷有效部位能够明显的降低血糖、降低肾脏肥大程度、减少尿蛋白的排泄量、延缓蛋白尿的形成，具有修复糖尿病引起的肾损伤的作用。

Description

萆薢总皂苷在制备防治糖尿病肾病药物中的应用

技术领域：

本发明属于中药技术领域，具体涉及萆薢总皂苷在制备防治糖尿病肾病药物中的应用。

背景技术：

糖尿病肾病(diabeticnephropathy)是指糖尿病微血管病变导致的肾小球硬化，又称糖尿病肾小球硬化症，糖尿病肾病是糖尿病微血管并发症之一。糖尿病肾病是糖尿病最常见的并发症，其发病率随着糖尿病的快速增长而逐年上升，我国2001年2型糖尿病并发肾病患病率为34.7％，且过去20年糖尿病肾病发病率一直在增加，糖尿病肾病已经成为引起终末期肾病的主要原因之一。目前，临床上治疗糖尿病肾病的药物主要有降糖药物、降血压药物、降血脂药物和降尿蛋白药物，这些药物治疗糖尿病肾病的针对性不强，而且不能修复已经损伤的肾脏，因此药效不明显。中药具有多成分、多靶点的优势，因此从中药中开发成分明确、安全有效的治疗糖尿病肾病的药物具有重要的社会意义和经济意义。

萆薢为薯蓣科植物绵萆薢DioscoreaseptemlobaThunb.、福州薯蓣DioscoreafutchauensisUlineexR.和粉背薯蓣DioscoreahypoglaucaPalibin的干燥根茎。萆薢始载于《神农本草经》，其味苦、平，归肾、胃经。萆薢具有利湿去浊之功效，传统上多用于治疗膏淋、白浊。

研究表明皂苷是萆薢的主要成分之一，其具有降低尿酸、治疗痛风的作用。目前，未发现关于萆薢总皂苷治疗糖尿病肾病的文献报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供萆薢总皂苷在制备防治糖尿病肾病药物方面的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

萆薢总皂苷在制备降糖药物中的应用。

萆薢总皂苷在制备防治糖尿病肾病药物中的应用。

所述的萆薢总皂苷中原薯蓣皂苷、甲基原薯蓣皂苷、纤细皂苷、原纤细皂苷、薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元的含量之和大于50％。

所述的萆薢总皂苷是由如下方法制备得到的：取萆薢药材，加入萆薢6-12倍量的50％-80％的乙醇回流提取2-3小时，过滤，得到滤液；滤渣再用50％-80％的乙醇回流提取1-2次，每次2-3小时，过滤，合并滤液，滤液减压回收至无醇味，加水配制成含0.1-0.5g药材/ml的药液，上AB-8大孔树脂柱，依次用50％的乙醇和70％的乙醇洗脱，弃去50％的乙醇洗脱液，合并70％的乙醇洗脱液，回收溶剂至近干，减压干燥得到萆薢总皂苷。

所述的降糖药物包括萆薢总皂苷和药学上可以接受的载体或常规食用辅料。

所述的防治糖尿病肾病药物包括萆薢总皂苷和药学上可以接受的载体或常规食用辅料。

与现有技术相比，本发明有以下有益的技术效果：

萆薢总皂苷具有明显的降低血糖的作用；萆薢总皂苷还能够明显降低高血糖导致的肾脏肥大和肾脏纤维化程度。萆薢总皂苷能够减少糖尿病导致的尿蛋白排泄量增加，延缓蛋白尿的形成。萆薢总皂苷能够降低糖尿病引起的血清肌酐和尿素氮的升高，改善肾功能。萆薢总皂苷能够降低肾脏炎症因子的表达，这是其防治糖尿病肾病的途径之一。萆薢总皂苷在防治糖尿病肾病方面效果显著，具有可观的开发和应用价值。

具体实施方式：

实施例1

萆薢总皂苷的制备方法：

取1kg萆薢药材，加入10L70％的乙醇回流提取2小时，过滤，得到滤液；滤渣再用70％的乙醇回流提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，滤液减压回收至无醇味，加水配制成含0.1g药材/ml的药液，以2BV/h的流速上AB-8大孔树脂柱，依次用50％的乙醇和70％的乙醇以2BV/h的流速洗脱，弃去50％的乙醇洗脱液，收集70％的乙醇洗脱液，回收溶剂至近干，减压干燥得到萆薢总皂苷63g。

实施例2

萆薢总皂苷治疗糖尿病肾病的实验研究

1.实验材料：

1.1试药：盐酸二甲双胍片(京丰制药有限公司)；消渴丸(广州白云山中一药业有限公司)；STZ(Sigma-Aldrich公司；批号：876232)；尿蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；尿素氮测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；肌酐测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；葡萄糖测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)测定试剂盒(MerckMilliporeInc)；大鼠白介素1β(IL-1β)测定试剂盒(MerckMilliporeInc)；大鼠白介素6(IL-6)测定试剂盒(MerckMilliporeInc)。

1.2动物：成年雄性SD大鼠(180-220g，动物质量证书编号SCKX2008-0010)，购于南通大学实验动物中心；喂养环境维持12h光/暗周期并保持恒定温度23±2℃，使其自由饮食饮水。本研究所有程序均依照实验动物保护原则进行。

1.3仪器：MultiskanFC型酶标仪(赛默飞世尔公司)；750-2型紫外可见分光光度计(浙江菁华有限公司)；BSA124S型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；OneTouchUltraEasy型血糖仪及配套试纸(强生医疗器材有限公司)；PH-1型酸度计(赛多利斯科学仪器有限公司)。

2.实验方法：

2.1糖尿病模型大鼠的制备

大鼠适应性喂养一周后，将实验大鼠随机分为空白对照组和模型组。空白对照组大鼠进行正常喂养，模型组大鼠腹腔注射60mg/kgSTZ(溶解于pH4.4、0.01M的柠檬酸钠缓冲液中)，空白对照组大鼠则腹腔注射柠檬酸钠缓冲液。一周后测定大鼠的血糖值。血糖值大于16.7mmol/L者被认定为糖尿病大鼠，用于开展进一步的药理研究。

2.2分组及给药

将糖尿病大鼠进行随机分为6组，每组8只。糖尿病模型组：按20mL/kg给予生理盐水；二甲双胍组：每天按200mg/kg的剂量给药二甲双胍治疗糖尿病大鼠；消渴丸组组：每天按800mg/kg的剂量给药消渴丸治疗糖尿病大鼠；萆薢低剂量组：每天按40mg/kg的剂量给药萆薢总皂苷治疗糖尿病大鼠；萆薢高剂量组：每天按80mg/kg的剂量给药萆薢总皂苷治疗糖尿病大鼠；萆薢高剂量组：每天按160mg/kg的剂量给药萆薢总皂苷治疗糖尿病大鼠。另外选取8只正常大鼠，给予20mL/kg的生理盐水作为空白对照组。所有药物的给药方法均为灌胃给药，给药周期为12周。

2.3样本的采集和处理

给药结束前1天将大鼠单独置于代谢笼中，收集大鼠24h的尿液，测量体积，以4000rmp离心10min，取上清液备用；最后一次给药结束后，采用眼底静脉丛法取血，以4000rmp离心10min，取大鼠血清备用；取血后处死大鼠，分离大鼠肾脏，称重，分离大鼠肾脏皮质部，加9倍量生理盐水，匀浆，以4000rmp离心10min，取上清液备用。

2.4指标的测定

血糖值的测定：取大鼠血清，采用葡糖糖氧化酶法，按照试剂盒说明书的要求测定血糖值。

肾脏系数的测定：称量大鼠体重和肾脏重量，按如下公式计算肾脏系数。肾脏系数＝肾脏重量÷大鼠体重。

血清尿素氮和肌酐含量的测定：取大鼠血清，采用脲酶法，按照试剂盒说明书的要求测定血清尿素氮含量；采用苦味酸法，按照试剂盒说明书的要求测定血清肌酐含量。

24h尿蛋白排泄量的测定：取大鼠尿样，按照试剂盒说明书的要求测定尿液中蛋白含量，按如下公式计算24h尿蛋白排泄量。24h尿蛋白排泄量＝尿液中蛋白含量×24h尿液体积÷大鼠体重。

肾脏TNF-α、IL-1β和IL-6含量的测定：取大鼠肾脏皮质，称量，加入9倍量冰生理盐水匀浆匀浆，在4℃下以4000rpm转速离心10min，取上清液，按照试剂盒说明书的要求测定上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量和蛋白含量，以蛋白含量标定TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

肾脏转化生长因(TGF-β)和结缔组织生长因子(CTGF)含量的测定：取大鼠肾脏皮质，称量，加入9倍量冰生理盐水匀浆，在4℃下以4000rpm转速离心10min，取上清液，按照试剂盒说明书的要求测定上清液中TGF-β和CTGF含量和蛋白含量，以蛋白含量标定TGF-β和CTGF含量。

3.实验结果

3.1萆薢总皂苷对大鼠血糖值的影响

表1.萆薢总皂苷对糖尿病大鼠血糖值的影响(n＝8)

注：与空白组比较，^ΔΔp＜0.01；与模型组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01。

由表1可知，萆薢总皂苷能够显著降低糖尿病大鼠的血糖值，其降血糖程度优于消渴丸。

3.2萆薢总皂苷对糖尿病大鼠肾脏系数、血清尿素氮值和肌酐值的影响

表2.萆薢总皂苷对大鼠肾脏系数、血清尿素氮值和肌酐值的影响(n＝8)

注：与空白组比较，^ΔΔp＜0.01；与模型组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01。

实验和临床研究表明，长期的糖尿病会导致患者肾脏肥大。由表2可知，糖尿病肾病大鼠的肾脏系数显著性高于空白组，说明模型制备成功；萆薢总皂苷治疗可以显著降低糖尿病大鼠的肾脏系数，说明萆薢总皂苷能够改善高血糖导致的肾脏肥大。肌酐和尿素氮升高也是临床判断糖尿病肾病的主要指标之一。本实验结果显示，糖尿病肾病大鼠的血清肌酐值和尿素氮值均显著性高于空白组大鼠；连续灌胃给予萆薢总皂苷，可以显著降低糖尿病大鼠血清肌酐值和尿素氮值。上述结果表明萆薢总皂苷能够改善糖尿病大鼠肾脏功能，减少高糖对肾脏的损伤。

3.3萆薢总皂苷对糖尿病大鼠24h尿蛋白排泄量的影响

表3.萆薢总皂苷对糖尿病大鼠24h尿蛋白排泄量的影响(n＝8)

注：与空白组比较，^ΔΔp＜0.01；与模型组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01。

尿蛋白排泄量是评价肾小球和肾小管损伤的重要指标。由表3可知，糖尿病肾病组的尿蛋白排泄率显著性高于空白组；说明糖尿病大鼠的肾小球和肾小管产生了明显的损伤，而给予萆薢总皂苷治疗后，可以剂量依赖性地降低糖尿病肾病大鼠的尿蛋白排泄率，说明萆薢总皂苷能够修复高血糖对大鼠肾小球和肾小管的损伤。

3.4萆薢总皂苷对糖尿病大鼠肾脏炎症因子表达的影响

表4.萆薢总皂苷对糖尿病大鼠肾脏炎症因子表达的影响(n＝8)

注：与空白组比较，^ΔΔp＜0.01；与模型组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01。

实验和临床研究表明，炎症因子同样在糖尿病肾病发病过程中起到重要的作用。模型组大鼠肾脏的TNF-α、IL-1β和IL-6显著升高，而萆薢总皂苷低、中、高剂量组大鼠肾脏的肾脏TNF-α、IL-1β和IL-6显著性低于模型对照组，这说明萆薢总皂苷能够减少糖尿病大鼠肾脏TNF-α、IL-1β和IL-6的生成，减少炎症因子对肾脏的损伤，这是萆薢总皂苷修复肾损伤的可能途径。

3.5萆薢总皂苷对糖尿病大鼠肾脏TGF-β1和CTGF表达的影响

表5.萆薢总皂苷对糖尿病大鼠肾脏TGF-β1和CTGF表达的影响(n＝8)

与空白组比较，^ΔΔp＜0.01；与模型组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01。

TGF-β1被认为是重要的炎症和纤维化因子，而且在细胞外基质聚集和肾脏纤维化的过程中发挥了重要的作用。CTGF是TGF-β1重要的下游因子，CTGF不仅能够增加肾脏胶原蛋白的表达，而且能够抑制细胞外基质的降解，从而导致细胞外基质聚集和纤维化。TGF-β1和CTGF是高血糖导致肾脏纤维化的主要影响因子。由表5可知，模型组大鼠的TGF-β1和CTGF均显著升高；萆薢总皂苷各组大鼠肾脏的TGF-β1和CTGF显著性低于模型对照组，说明萆薢总皂苷能够减少糖尿病大鼠肾脏TGF-β1和CTGF的生成，从而减缓糖尿病大鼠肾脏纤维化的形成。

4.结论

萆薢总皂苷能够降低糖尿病大鼠血糖值，降低糖尿病大鼠肾脏系数、血清肌酐和尿素氮值值，减少尿蛋白排泄量，修复肾损伤。萆薢总皂苷能还够降低糖尿病大鼠肾脏TNF-α、IL-1β和IL-6的生成，降低GF-β1和CTGF的表达。

Claims (5)

1.萆薢总皂苷作为活性成分在制备降糖药物中的应用，所述的萆薢总皂苷由原薯蓣皂苷、甲基原薯蓣皂苷、纤细皂苷、原纤细皂苷、薯蓣皂苷、薯蓣皂苷元及其他皂苷组成，是由如下方法制备得到的：取萆薢药材，加入萆薢6-12倍量的50％-80％的乙醇回流提取2-3小时，过滤，得到滤液；滤渣再用50％-80％的乙醇回流提取1-2次，每次2-3小时，过滤，合并滤液，滤液减压回收至无醇味，加水配制成含0.1-0.5g药材/ml的药液，上AB-8大孔树脂柱，依次用50％的乙醇和70％的乙醇洗脱，弃去50％的乙醇洗脱液，合并70％的乙醇洗脱液，回收溶剂至近干，减压干燥得到萆薢总皂苷。

2.萆薢总皂苷作为活性成分在制备防治糖尿病肾病药物中的应用，所述的萆薢总皂苷由原薯蓣皂苷、甲基原薯蓣皂苷、纤细皂苷、原纤细皂苷、薯蓣皂苷、薯蓣皂苷元及其他皂苷组成，是由如下方法制备得到的：取萆薢药材，加入萆薢6-12倍量的50％-80％的乙醇回流提取2-3小时，过滤，得到滤液；滤渣再用50％-80％的乙醇回流提取1-2次，每次2-3小时，过滤，合并滤液，滤液减压回收至无醇味，加水配制成含0.1-0.5g药材/ml的药液，上AB-8大孔树脂柱，依次用50％的乙醇和70％的乙醇洗脱，弃去50％的乙醇洗脱液，合并70％的乙醇洗脱液，回收溶剂至近干，减压干燥得到萆薢总皂苷。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的应用，其特征在于所述的萆薢总皂苷中原薯蓣皂苷、甲基原薯蓣皂苷、纤细皂苷、原纤细皂苷、薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元的含量之和大于50％。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的降糖药物包括萆薢总皂苷和药学上可以接受的载体或常规食用辅料。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的防治糖尿病肾病药物包括萆薢总皂苷和药学上可以接受的载体或常规食用辅料。