CN102048746A - 薯蓣皂苷预防和治疗糖尿病慢性并发症的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了薯蓣皂苷对大鼠晶状体AR具有一定的抑制活性；对半乳糖性及糖尿病性两种白内障均有一定的延缓作用；能够明显降低糖尿病性大鼠尿液白蛋白含量。说明薯蓣皂苷能预防、缓解和/或治疗糖尿病慢性并发症，特别是糖性白内障、糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病变以及糖尿病神经病变等。

Description

薯蓣皂苷预防和治疗糖尿病慢性并发症的用途

技术领域

本发明涉及薯蓣皂苷预防、缓解和\或治疗糖尿病慢性并发症，特别是糖性白内障、糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病变以及糖尿病神经病变的用途，属于医药技术领域。

背景技术

自上世纪末起，糖尿病已成为全球流行性疾病，发病率逐年增加，虽然目前有效的降糖药物种类繁多，但是很少有人能持之以恒的将血糖控制在安全范围内，10年之后慢性并发症应运而生，主要累及晶状体、肾脏、视网膜及外周神经等组织器官。不同的糖尿病慢性并发症虽各具特点，它们却具有类似的病理过程。

多元醇通路是糖尿病慢性并发症发生的重要环节，此通路涉及两个酶-醛糖还原酶(Aldose reductase，AR)和山梨醇脱氢酶，前者活性远大于后者，是糖尿病慢性并发症发生的关键酶，组织学分布与糖尿病慢性并发症的发生部位基本吻合。生理状态下，晶状体内80％以上葡萄糖进行无氧酵解提供能量，仅有极少量葡萄糖进入多元醇通路；而高糖情况下，尤其是当血糖水平超过200mg/dl时，己糖激酶活性已达饱和，30％以上葡萄糖涌入多元醇通路，生成大量高渗性物质-山梨醇。山梨醇是一种非脂溶性物质，既不易被山梨醇脱氢酶代谢，又难以透过细胞膜，在细胞内大量堆积，高度吸水膨胀，细胞膜通透性增加，大量还原性物质-GSH，肌醇等物质外漏，PKC被激活，诱发细胞氧化应激等病理过程，导致糖尿病性白内障(diabetic cataract，DC)的发生，相似的病理过程也发生在肾脏、视网膜的微血管内。在肾脏表现为肾小球滤过屏障严重受损，出现电荷选择性功能障碍，使尿液中带负电荷的大分子白蛋白透过此屏障，出现尿微量白蛋白。微量蛋白尿成为糖尿病性肾脏病变(diabetic nephropathy，DN)与糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)诊断和治疗的重要指标。

AR一直是糖尿病慢性并发症药物研发的主要靶点，化学合成的AR抑制剂主要有海因类(Sorbinil，SNK860等)和羧酸类(Epalrestat，Tolrestat等)两类，虽然先后有不少此类药物进入临床研究，但大都因为严重的毒副作用而被迫终止研发。目前唯一在日本上市的AR抑制剂是Epalrestat，主要用于糖尿病末梢神经障碍的预防及治疗。近来研究表明天然产物中部分黄酮类化合物具有较强的AR抑制活性，此类药物目前正在研究中。

在糖尿病患者中，慢性并发症的发病率高达60％以上，严重影响患者的生活质量。由于目前缺乏有效的治疗药物，绝大多数糖尿病肾病患者只能进行对症治疗；而白内障患者必须依靠手术带来光明，对于糖尿病患者来说，白内障与视网膜病变几乎同时存在，混浊的晶状体严重妨碍了视网膜病变的诊断及治疗，白内障术后压力的骤然降低，对已经增生肿胀而脆弱的视网膜血管来说是极其危险的，很可能会引起视网膜血管破裂。因此寻找高效低毒的AR抑制剂，对于DC、DR及DN等糖尿病慢性并发症的防治具有实际应用价值。

薯蓣皂苷(Diosgenin，DG)广泛存在于薯蓣科、百合科、豆科等植物中，其中在薯蓣科植物中含量丰富，如穿龙薯蓣、山药、质叶薯蓣等；薯蓣皂苷具有明确的化学结构，是甾体激素类药物重要的合成原料。临床多用于治疗冠心病心绞痛及高脂血症。其对于糖尿病慢性并发症的作用未见报道。为探讨薯蓣皂苷对糖尿病白内障及肾病的影响，我们进行了相关研究，现报告如下。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供薯蓣皂苷预防、缓解和治疗糖尿病慢性并发症的新用途。

本发明的发明人在AR抑制剂高通量筛选实验中发现薯蓣皂苷具有一定的AR抑制活性，且量效关系较好，其对正常大鼠晶状体AR抑制活性的IC₅₀为4.59×10^-6mol/L。因此薯蓣皂苷可以用于预防、缓解和治疗醛糖还原酶相关的疾病。

随后本发明的发明人对薯蓣皂苷的抗糖尿病慢性并发症(AR相关)作用展开系统研究。证实了薯蓣皂苷能用于制备预防、缓解和\或治疗糖尿病慢性并发症的药物。所述的糖尿病慢性并发症选自糖性白内障、糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病变或糖尿病神经病变。

所述预防、缓解和\或治疗预防、缓解和\或治疗糖性白内障是指延缓白内障的发生及发展过程、改善晶状体混浊度；改善晶状体渗透性膨胀、改善醛糖还原酶的过度激活、改善半乳糖醇的堆积。

所述预防、缓解和\或治疗预防、缓解和\或治疗糖尿病肾病是指降低尿白蛋白排泄量。

薯蓣皂苷抗糖性白内障研究主要从离体和整体两方面进行，主要考察晶状体形态学变化，AR活性及其代谢产物，晶状体混浊度相关指标-WSP和USP以及AR在mRNA水平的变化。在晶状体离体培养实验中，用50mM半乳糖诱导正常大鼠晶状体发生明显的渗透性膨胀，模拟糖尿病性白内障体内发生过程。结果显示，薯蓣皂苷(6μM)不仅明显抑制了晶状体的直径、重量的增加，而且AR的过度激活及半乳糖醇的大量堆积得到很好的改善，说明薯蓣皂苷对半乳糖诱导大鼠晶状体渗透性膨胀具有一定的抑制作用。随后在整体水平，采用半乳糖性大鼠白内障模型和糖尿病性大鼠白内障模型对薯蓣皂苷进行药效学评价。半乳糖性白内障实验中发现，持续饮用0.1％薯蓣皂苷能够很好的延缓白内障的发生及发展过程，这可能与模型建立方法密切相关；同时发现灌胃给予薯蓣皂苷(100-200mg/kg)对晶状体混浊度的进展也有一定的改善作用。糖尿病性白内障研究结果显示，持续灌胃给予薯蓣皂苷(50mg/kg)对STZ引起的大鼠糖尿病性白内障有一定的延缓作用，白内障级别进展明显减慢。综合体内外研究结果，薯蓣皂苷对大鼠半乳糖性及糖尿病性两种白内障均具有一定的缓解作用。

薯蓣皂苷抗DN研究中发现，持续灌胃给予薯蓣皂苷(400mg/kg)8周能够明显降低糖尿病大鼠尿白蛋白排泄量。白蛋白是血浆中含量最高的蛋白质，占血浆总蛋白量的60％，相对分子量69KD，半径约为3.6nm，正常状态下不易通过肾小球滤过屏障。尿微量白蛋白(microalbumin，MA)浓度增高是早期发现DN公认的敏感指标。高糖诱导的多元醇代谢通路异常激活、蛋白质非酶糖基化、DG-PKC系统活化、己糖胺代谢通路活性增强，继而通过活性氧簇和细胞因子等效应分子作用于肾小球滤过屏障，影响其结构与功能。在DN早期，由于肾小球内皮糖萼损伤及基底膜硫酸肝素生成减少，导致肾小球滤过屏障电荷选择性功能障碍，带负电荷的白蛋白透过屏障，出现尿微量白蛋白。DN后期，肾小球滤过屏障分子大小选择性功能缺陷，出现持续性大量非选择性蛋白尿。本研究提示薯蓣皂苷可能有预防、延缓DN的作用。白蛋白尿不仅提示肾脏损害，同时也是发现视网膜病变的重要线索。薯蓣皂苷可以明显降低糖尿病大鼠的尿白蛋白排泄量，也利于DR的防治。

术语和简称：

AR：醛糖还原酶

DG：薯蓣皂苷

WSP：晶状体水溶性蛋白

USP：脲溶性蛋白

DC：糖尿病性白内障

DN：糖尿病性肾脏病变

DR：糖尿病性视网膜病变

附图说明：

图1、薯蓣皂苷对正常大鼠晶状体中提取的AR的抑制作用

图2薯蓣皂苷对50mM半乳糖诱导的渗透性膨胀晶状体直径及重量的影响

图2-A、晶状体直径

图2-B、晶状体重量数据用

表示；每组中n＝10；.***P＜0.001vs正常组，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001vs模型对照组.，Nor为正常对照组；Con为模型对照组。

图3薯蓣皂苷对50mM半乳糖诱导的渗透性膨胀晶状体AR活性及半乳糖醇含量的影响

图3-A、AR活性

图3-B、半乳糖醇含量

数据用表示；每组中n＝10；.***P＜0.001vs正常对照组，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001vs模型对照组.，Nor为正常对照组；Con为模型对照组。

图4、薯蓣皂苷(口服)对半乳糖性白内障进程的影响。

DG-100，DG-200分别代表薯蓣皂苷100mg/kg和200mg/kg灌胃给药组。

DG-0.1％代表持续饮用0.1％薯蓣皂苷溶液组。Nor为正常对照组；Con为模型对照组。

数据用

表示；每组中n＝10。

图5、薯蓣皂苷(口服)对半乳糖性白内障晶状体重量及晶状体/体重比值的影响DG(100)，DG(200)分别代表薯蓣皂苷100mg/kg和200mg/kg灌胃给药组。DDG(0.1％)代表持续饮用0.1％薯蓣皂苷溶组。Nor为正常对照组；Con为模型对照组。

图5-A晶状体重量

图5-B晶状体/体重比值

数据用

表示；每组中n＝10；*P＜0.05，***P＜0.001vs正常对照组，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001vs模型对照组。

图6、薯蓣皂苷(口服)对半乳糖性白内障晶状体中AR活性及半乳糖醇含量的影响

DG(100)，DG(200)分别代表薯蓣皂苷100mg/kg和200mg/kg灌胃给药。

DG(0.1％)代表持续饮用0.1％薯蓣皂苷溶组。Nor为正常对照组；Con为模型对照组。

图6-A AR活性

图6-B半乳糖醇含量

数据用

表示；每组中n＝10；.***P＜0.001vs正常对照组，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001vs对照组.。

图7、薯蓣皂苷(口服)对半乳糖性大鼠白内障晶状体水溶性蛋白和脲溶性蛋白含量的影响

DG(100)，DG(200)分别代表薯蓣皂苷100mg/kg和200mg/kg灌胃给药组。

DG(0.1％)代表持续饮用0.1％薯蓣皂苷溶组。Nor为正常对照组；Con为模型对照组。

图7-A水溶性蛋白

图7-B脲溶性蛋白

数据用表示；每组中n＝10；.**P＜0.01vs正常对照组，#P＜0.05，vs模型对照组。

图8薯蓣皂苷对半乳糖性大鼠白内障晶状体中AR mRNA表达的影响β-actin在大鼠晶状体中是恒定表达的，目的基因的表达和β-actin相比较。比率用扩增倍数表示＝2^-ΔΔCt.

DG(100)，DG(200)分别代表薯蓣皂苷100mg/kg和200mg/kg灌胃给药。

DG(0.1％)代表持续饮用0.1％薯蓣皂苷溶液。Nor为正常对照组；Con为模型对照组。

每组中n＝10。

图9薯蓣皂苷(口服)对糖尿病糖性大鼠晶状体混浊级别的影响

DG-50分别代表薯蓣皂苷50mg/kg灌胃给药组。Nor为正常对照组；Con为模型对照组。

数据用

表示。

图10.薯蓣皂苷对糖尿病性大鼠晶状体重量及晶状体/体重比值的影响DG-50分别代表薯蓣皂苷50mg/kg灌胃给药组。Nor为正常对照组；Con为模型对照组。

图10-A晶状体重量

图10-B晶状体/体重比值

数据用

表示；每组中n＝10；.*P＜0.001，***P＜0.001vs正常对照组，#P＜0.05vs模型对照组.

图11薯蓣皂苷(口服)对糖尿病性大鼠白内障晶状体中AR活性及山梨醇含量的影响

DG-50分别代表薯蓣皂苷50mg/kg灌胃给药组。Nor为正常对照组；Con为模型对照组。

图11-A AR活性

图11-B山梨醇含量

数据用

表示；每组中n＝10；.***P＜0.001vs正常对照组，#P＜0.05，##P＜0.01vs对照组.。

图12、薯蓣皂苷(口服)对糖尿病性大鼠白内障晶状体水溶性蛋白和脲溶性蛋白水平的影响。

DG-50分别代表薯蓣皂苷500mg/kg灌胃给药组。Nor为正常对照组；Con为模型对照组。

图12-A水溶性蛋白

图12-B脲溶性蛋白

数据用表示；每组中n＝10；*P＜0.05，***P＜0.001vs正常对照组，#P＜0.05，##P＜0.01vs模型对照组。

图13薯蓣皂苷(口服)对糖尿病性大鼠白内障晶状体中ARmRNA表达的影响β-actin在大鼠晶状体中是恒定表达的，目的基因的表达和管家基因β-actin相比较。比率用扩增倍数表示＝2^-ΔΔCt.

DG-50分别代表薯蓣皂苷50mg/kg灌胃给药组。Nor为正常对照组；Con为模型对照组。

图14，薯蓣皂苷对糖尿病大鼠24小时尿液白蛋白排泄量的影响

DG-400分别代表薯蓣皂苷400mg/kg灌胃给药组。Nor为正常对照组；Con为模型对照组。数据用几何平均数×/÷容许因子表示。***P＜0.001vs正常对照组，###P＜0.001vs模型对照组.。

具体实施方式

实验材料

动物：21天龄Wistar大鼠，成年健康雄性SD大鼠(160-180g)，一般情况良好，裂隙灯下见所有大鼠晶状体完全透明，且无其它眼疾。由中国医学科学院动物研究所提供，饲养于SPF级动物房。

药品及试剂：NADPH·Na₄、DL-甘油醛、D-半乳糖及大鼠血清白蛋白均购自Sigma公司；Epalrestat购自上海金洹化工公司；DMEM液体培养基(无酚红、1.0g/L葡萄糖)购自北京钮因公司；Trizol Reagent购自Invitrogen公司；VigoScript First Strand cDNA Synthesis Kit购自威格拉斯生物技术公司；SYBR Premix Ex Taq^TM(perfect Real Time)购自大连宝生物有限公司；牛血清白蛋白购自Boehringer公司；生物素化羊抗兔IgG、正常羊血清及辣根酶标记联亲和素均购自北京中山生物技术公司；TMB购自Amresco公司；其他试剂均为国产分析纯。

实验仪器

ABI 7000PCR仪(美国应用生物系统公司)；低温高速冷冻离心机(Sigma公司)；6010型紫外-可见光分光光度计(安捷伦上海分析公司)；JY92-II型超声波细胞粉碎机(宁波新芝公司)；维纳斯剪(江苏六六视觉公司)；显微外科镊(上海医疗器械有限公司)；体视显微镜；裂隙灯(江苏六六视觉公司)。

实施例1、薯蓣皂苷对正常大鼠晶状体AR活性的抑制作用

大鼠晶状体醛糖还原酶(Aldose reductase，AR)的提取取-80℃短期冻存或新鲜的大鼠晶状体于EP管中，每只加400μl预冷去离子水，冰浴下超声破碎(200W×10s/次×3次)至整个晶状体完全破碎成乳白色混悬液，4℃离心(15,000g×30min)，弃沉淀，上清用于实验，现用现提。

薯蓣皂苷对正常大鼠晶状体AR的抑制作用实验提取正常大鼠晶状体醛糖还原酶，以Epalrestat为阳性参照，以NADPH为辅酶，DL-甘油醛为底物，设空白孔、NADPH对照孔、NADPH代谢孔、药物孔及药物空白孔，冰浴下新鲜配置NADPH及NADPH-DL甘油醛缓冲液。首先进行预实验(空白孔、NADPH孔及NADPH代谢孔)，混匀后30℃反应10min，计算NADPH自然氧化率。以NADPH 60-70％氧化率为标准确定此次反应时间，若氧化率偏小，适当延长反应时间，反之亦然。然后在冰浴下分别加入空白孔、NADPH对照孔及NADPH代谢孔、药物孔及药物空白孔，30℃准确反应预测时间，测定OD_340nm，计算薯蓣皂苷对正常大鼠晶状体AR的抑制率及IC₅₀。

本次实验结果显示，天然化合物-薯蓣皂苷对正常大鼠晶状体AR有一定的抑制作用，且量效关系较好，IC₅₀＝4.59×10^-6mol/L，见图1。

实施例2、薯蓣皂苷对离体培养大鼠晶状体渗透性膨胀的影响

大鼠晶状体离体培养成年健康雄性SD大鼠，断头处死后立即取出整个眼球，75％酒精中浸泡10min后转至超净台内，灭菌人工房水将眼球清洗3遍，采用后囊法小心取出整个晶状体，轻轻滚动以去除晶状体表面的玻璃体，然后转至24孔板内，于低糖(1g/L)、无酚红、无血清DMEM培养基中，37℃、5％CO₂无菌条件下预培养6h后，取10μl培基采用考马斯亮兰法进行蛋白定量，选完全透明且培基蛋白含量＜100μg/ml的晶状体为手术过程中无损伤晶状体，进行后续实验。薯蓣皂苷对离体培养大鼠晶状体渗透性膨胀的影响半乳糖是AR良好的底物，实验用50mM半乳糖诱导晶状体形成明显渗透性膨胀，选Epalrestat为阳性化合物，浓度为5μM，薯蓣皂苷浓度为2、4、6μM，选预培养后无损伤晶状体60只，分为6组，n＝10，同一组内避免同一只大鼠两个晶状体，更换培基时加入相应Epalrestat和薯蓣皂苷，药物干预24h后模型组及各药物组内添加半乳糖培基，共培养48h后更换培基，96h后终止实验，检测培基蛋白含量排除培养过程中损伤的晶状体，体视显微镜下测微尺测量晶状体的直径，称重后于-80℃冻存备用，7天内完成各项生化指标的检测。

大鼠晶状体组织处理-80℃短期冻存或者新鲜摘取大鼠晶状体，每只加400μl去离子水，冰浴下超声破碎：200W×3次，10s/次，然后4℃离心(15,000g×30min)，取上清用于各项生化指标测定。

晶状体AR活性的测定首先测定紫外酶标板在340nm及977/900nm处吸收值作为本底。反应设空白孔、对照孔及待测样品孔，反应体系为200ul，冰浴下依次加入0.1mol/L NaXPO₄缓冲液、晶状体匀浆上清、10mmol/L NADPH及0.16mmol/L甘油醛。去除气泡后25℃反应5min，终止反应后立即测OD_340nm和OD_977-900nm。根据酶学单位的国际定义，以25℃下每分钟内NADPH消耗的μmol数为1单位的AR，AR比活性＝AR活性单位/蛋白含量(mg)，单位为μmol/min/mg protein。

晶状体半乳糖醇含量测定晶状体匀浆上清经10％TCA沉淀蛋白后取上清备用。96孔板内分别加入缓冲液，待测样品(半乳糖醇标准)及12.5mM高碘酸溶液，混匀后避光反应10min，然后依次加入12.5mM亚砷酸钠溶液及0.2％变色酸，沸水浴30min后冷却离心，取上清测OD570nm，绘制标准曲线，计算晶状体内半乳糖醇的含量。

试验结果

1.薯蓣皂苷对渗透性膨胀晶状体直径及重量的影响

正常大鼠晶状体培养96h后重约36.58±1.44mg，直径为4.52±0.03mm，模型组晶状体重达47.33±0.12mg，直径增至4.70±0.06mm，均明显高于正常水平(P＜0.001)。与模型组相比，薯蓣皂苷(2、4、6μM)对半乳糖诱导的晶状体重量增加也具有明显的抑制作用，以4uM浓度下的抑制作用最强(42.97±1.18mg，P＜0.001)。在晶状体直径和重量的测定中，重量指标较为准确，见图2。

2.薯蓣皂苷对渗透性膨胀晶状体AR活性及半乳糖醇含量的影响

体外培养正常晶状体AR活性为7.72±1.96μmol/min/mg pro，半乳糖醇含量为3.42±1.34mg/g lens。模型组晶状体AR(12.90±0.89μmol/min/mg pro，P＜0.001)被显著激活，并引起半乳糖醇在晶状体内堆积(9.33±1.56mg/g lens，P＜0.001)。与模型组相比，薯蓣皂苷在2-4μM浓度下对AR激活及半乳糖醇堆积有一定改善作用；6μM浓度下能够明显抑制半乳糖诱导的AR激活(11.38±1.41μmol/min/mgpro，P＜0.05)及半乳糖醇的堆积(6.82±0.76mg/g lens，P＜0.01)，见图3。

实施例3、口服给予薯蓣皂苷对半乳糖性大鼠白内障的影响

实验设计

设正常组、半乳糖模型组及不同浓度的薯蓣皂苷组(DG 100、200、0.1％)，n＝10。实验采用口服方式给药，DG(100、200)组大鼠灌胃给药，剂量分别为100、200mg/kg，DG-0.1％组大鼠持续饮用0.1％薯蓣皂苷溶液。正常组及模型组大鼠灌胃给予等量正常饮用水，持续15天。

实验操作

20天龄正常雄性Wistar幼鼠，晶状体完全透明，随机分为5组并开始灌胃给药，自22天龄起，第1～7天模型组及给药组大鼠给予12.5％半乳糖溶液喂养，第8～15天给予10％半乳糖溶液，正常组始终给予正常饮用水。实验中每隔3天用0.1％复方托品酰胺散瞳一次，裂隙灯下观察并记录晶状体混浊度的级别，第16天断头处死大鼠，后囊法取出晶状体，-80℃冻存。

1.薯蓣皂苷对半乳糖性大鼠晶状体混浊度的影响

实验每3天裂隙灯下检测各组动物晶状体混浊度并进行分级，动态变化如下：正常大鼠晶状体始终完全透明，处于0级水平，模型组大鼠自3天起逐渐混浊，混浊度约每3天增加一级，始终明显高于正常水平。与同期模型组水平相比，薯蓣皂苷(100、200mg/kg)及0.1％薯蓣皂苷对晶状体混浊度进展均有明显的延缓作用(P＜0.05)，其中以0.1％薯蓣皂苷抑制效果最强，见图4和表1。

表1通过Kruskal-Wallis检验的各组动物间晶状体混浊度分级的P值比较

DG(100)，DG(200)分别代表薯蓣皂苷100mg/kg和200mg/kg灌胃给药组。DDG(0.1％)代表持续饮用0.1％薯蓣皂苷溶。Nor为正常对照组；Con为模型对照组。每组中n＝10。***P＜0.001vs Nor，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001vs Con.

2.薯蓣皂苷对半乳糖性大鼠晶状体重量及晶状体/体重比值的影响

正常组大鼠晶状体重约26.76±1.42mg，晶状体/体重比值(×10^-4)为3.37±0.21，模型组晶状体重量(34.24±2.35mg)及晶状体/体重比值(4.66±0.63)均明显高于正常水平(P＜0.001)。与模型组相比，薯蓣皂苷(100，200mg/kg)及0.1％薯蓣皂苷对晶状体重量及晶状体/体重比值的增加均有明显的抑制作用(P＜0.05)，见图5。

3.薯蓣皂苷对半乳糖性大鼠白内障晶状体AR活性及半乳糖醇含量影响

晶状体中AR活性和半乳糖醇含量测定方法同实施例2

正常晶状体AR活性为4.05±0.84μmol/mg pro，半乳糖醇含量低于1mg/glens。模型组晶状体AR被显著激活(11.66±1.57μmol/mg pro，P＜0.01)，并导致半乳糖醇在晶状体内大量堆积(5.37±0.77mg/g lens，P＜0.001)。与模型组比较，薯蓣皂苷(100，200mg/kg)及0.1％薯蓣皂苷对AR的过度激活均有明显的抑制作用(P＜0.05)；100mg/kg DG及0.1％DG显著降低了晶状体内山梨醇的堆积(P＜0.05)，见图6。

4.薯蓣皂苷对半乳糖性大鼠白内障晶状体WSP和USP含量的影响

晶状体水溶性蛋白(Water soluble protein，WSP)及脲溶性蛋白(Urea soluble protein，USP)含量测定将晶状体匀浆上清用去离子水稀释500倍后用于SWP含量测定，匀浆沉淀中再加入500μl去离子水，剧烈震荡混悬，离心(15,000g×30min)后弃上清，干燥后向各管沉淀中加入400μl尿素(8mol/L)，震荡混匀后150倍稀释，用于USP含量测定。BCA法测定晶状体WSP及USP含量。

正常晶状体WSP、USP含量分别为242.59±10.43和73.39±4.26mg/g lens。模型组WSP明显下降(204.83±25.23mg/g lens，P＜0.01)，USP含量却显著升高(97.56±3.43mg/g lens，P＜0.01)。与模型组相比，各用药组均有增加WSP的趋势(P＞0.05)；0.1％薯蓣皂苷明显抑制了USP的增加(60.96±1.64mg/g lens，P＜0.05)，薯蓣皂苷(100，200mg/kg)有降低USP的趋势(P＞0.05)，见图7。

5.薯蓣皂苷对半乳糖性大鼠晶状体AR mRNA表达的影响

Real time RT-PCR检测薯蓣皂苷对AR mRNA表达的影响。实验采用Trizol法提取晶状体总RNA，取总RNA 2μg，逆转成第一链cDNA后，取2-4μl逆转产物进行基因产物的扩增(real time RT-PCR)，反应体系(20μl)组成为：SYBR PremixEx Taq^TM(2×)10.0μl，cDNA  2.0-4.0μl，上下游引物各0.3μl，Rox Reference Dye(50×)0.4μl，去离子水加至20μl。PCR反应条件为：第一步，95℃×10sed；第二步，95℃×5sed+61℃×34sed，重复40个循环；第三步，95℃×15sed+60℃×60sed+95℃×15sed。实验以β-actin为内参，上游引物序列为5′-ACTCTTCCAGCCTTCCTTC-3′，下游为5′-ATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3′；AR上游引物序列为5′-GTGACCGAGGCTGTGAA-3′，下游序列为5′-AGAGGGTTGAAGTTGGAGA-3′。各以上引物均由Invitrogen公司合成。在以SYBR为荧光染料的real time RT-PCR实验中，首先要通过溶解曲线分析来考察引物的特异性，保证产物中无非特异性扩增及引物二聚体的生成，然后再采用ΔΔCt法对real time RT-PCR产物进行相对定量分析。

以β-actin为内参，ΔΔCT法进行相对定量分析。与正常相相比，模型组AR表达明显上调(3.17倍)，薯蓣皂苷(100、200mg/kg)及0.1％薯蓣皂苷对AR的高表达均有明显的下调作用，以0.1％DG抑制作用最强(2.13倍)，见图8。实施例4、灌胃给予薯蓣皂苷对STZ糖尿病性大鼠白内障的影响

实验设计

设正常组、糖尿病模型组及薯蓣皂苷组(DG 50)，n＝10。采用灌胃方式给药，DG 50组剂量为50mg/kg，正常组及模型组给予等量饮用水，持续8周。

实验操作

正常成年雄性SD大鼠，体重160～180g，晶状体完全透明，无任何混浊，随机分为正常组(n＝10)和糖尿病组(n＝25)。禁食过夜后糖尿病组所有大鼠一次性腹腔注射STZ溶液，剂量为65mg/kg，正常组大鼠给予等体积的柠檬酸缓冲液。4天后葡萄糖氧化酶法测大鼠尾静脉血糖，血糖在200～400mg/dl之间者为糖尿病动物(n＝20)，随机分为2组(糖尿病模型组及薯蓣皂苷组)并开始灌胃给药，此后每周所有大鼠散瞳一次，裂隙灯下观察晶状体混浊度变化，8周后，断头处死大鼠，后囊法小心取出晶状体，避免晶状体囊破裂，称重后-80℃冻存。

1.薯蓣皂苷对糖尿病性大鼠晶状体混浊度的影响

正常大鼠晶状体始终晶莹剔透，为0级水平；而模型组自高糖第3周起混浊度逐渐增加，明显高于正常水平(P＜0.001)，与模型组相比，薯蓣皂苷(50mg/kg)组晶状体混浊度级别始终明显低于模型组水平，见图9和表2。

表2通过Kruskal-Wallis检验的各组动物间晶状体混浊度分级的P值比较

DG(50)分别代表薯蓣皂苷50mg/kg灌胃给药组。Nor为正常对照组；Con为模型对照组。每组中n＝10；.***P＜0.01vs正常对照组，##P＜0.01，###P＜0.001vs模型对照组.。

2.薯蓣皂苷对糖尿病性大鼠晶状体重量及晶状体/体重比值的影响

正常大鼠晶状体重约47.19±1.62mg，晶状体/体重比值(×10^-4)约为10.69±1.36，持续高糖8周后，模型组晶状体重量(50.92±5.77mg)及晶状体/体重比值(25.63±3.57)均明显增加(P＜0.001)。与模型组相比，薯蓣皂苷(50mg/kg)能够明显抑制大鼠晶状体重量的增加(46.62±6.26mg，P＜0.05)及晶状体/体重之比的逐渐增大(21.14±1.59，P＜0.05)，见图10。

3.薯蓣皂苷对糖尿病性大鼠晶状体AR活性及山梨醇含量的影响

晶状体山梨醇含量测定晶状体匀浆上清经10％TCA沉淀蛋白后取上清备用。96孔板内分别加入缓冲液，待测样品(山梨醇标准)及12.5mM高碘酸溶液，混匀后避光反应10min，然后依次加入12.5mM亚砷酸钠溶液及0.2％变色酸，沸水浴30min后冷却离心，取上清测OD570nm，绘制标准曲线，计算晶状体内山梨醇的含量。

正常大鼠晶状体AR活性为4.09±0.42μmol/mg pro，山梨醇含量为0.72±0.16mg/g lens，模型组AR被高度激活(19.13±2.56μmol/mg pro，P＜0.001)，并致山梨醇在晶状体内大量堆积(5.08±0.86mg/g lens，P＜0.001)。与模型组相比，50mg/kg薯蓣皂苷明显抑制了晶状体内AR的激活(P＜0.01)及山梨醇的堆积(P＜0.05)，见图11。

4.薯蓣皂苷对糖尿病性大鼠晶状体WSP和USP含量的影响

试验方法同实施例4。正常大鼠晶状体内WSP，USP含量分别为229.27±22.83和93.14±13.11mg/g lens，模型组WSP含量明显低于正常水平(101.42±12.79mg/glens，P＜0.001)，而USP含量明显高于正常水平(133.01±21.42mg/g lens，P＜0.05)。与模型组相比，50mg/kg薯蓣皂苷显著改善晶状体内WSP的降低(177.86±23.69mg/g lens，P＜0.01)及USP的增加(P＜0.05)，见图12。

5.薯蓣皂苷对糖尿病性大鼠晶状体AR mRNA表达的影响

试验方法同实施例4。Real Time RT-PCR方法检测目的基因mRNA的表达，并将各个样本的Ct值与其内参基因β-actin的Ct值通过数据处理，使数据均一化。与正常水平相比，糖尿病大鼠晶状体AR表达明显增加(2.43倍)，50mg/kg薯蓣皂苷对AR的高表达抑制作用较明显(1.49倍)，见图13。

实施例5、灌胃给予薯蓣皂苷对STZ糖尿病性大鼠肾病的影响

1.实验设计

设正常组、糖尿病模型组及薯蓣皂苷组(DG 400)，n＝10。采用灌胃方式给药，DG 400组剂量为400mg/kg，正常组及模型组给予等量饮用水，持续8周。

2.实验操作

正常成年雄性SD大鼠，体重160～180g，随机分为正常组(n＝10)和糖尿病组(n＝23)。糖尿病组大鼠模型建立方法及高糖大鼠选择标准同实施例4，糖尿病动物(n＝20)随机分为糖尿病模型组及薯蓣皂苷组(n＝10)，并开始灌胃给药，给药第8周时，将大鼠置于代谢笼中，自由饮水及进食，收集24h尿液。收集器皿中加入适量甲苯防腐。收集完尿液后，量尿液体积，3000rpm×10min，取上清冻存于-20℃用于尿微量白蛋白测定。

竞争性ELISA法测定尿液中自蛋白浓度

1)试剂配置

(1)四甲基联苯胺(3，3′，5，5′-tetramethyl-benzidine，TMB)底物液①5mg TMB溶于5.0ml二甲基亚砜(DMSO)中(加温使之充分溶解)。

②4ml TMB溶液加至16ml醋酸缓冲液(0.2mol/L，pH 5.8-6.0)中混匀。

③“②”液与0.03％H₂O₂水溶液等体积混匀备用。

(2)pH 7.2PBS缓冲液：称取KCl 0.20g；KH₂PO₄0.20g；NaCl 8.00g；Na₂HPO₄·12H₂O 2.885g溶于1L蒸馏水中。

(3)PBST：含有0.05％吐温-20的PBS。

(4)抗体/抗原稀释液：含1％正常羊血清的PBS。

(5)包被缓冲液：NaHCO₃8.4g溶于1L蒸馏水中，调pH至9.6。

2)大鼠尿白蛋白的竞争性ELISA测定方法步骤

3)尿液白蛋白测定数据的统计处理

将尿液白蛋白浓度进行对数转换后，进行t-检验，结果表示为几何均数(geometric mean)×/÷几何标准差(tolerance factor)。

统计学处理尿液白蛋白结果表示为几何均数×/÷几何标准差，其它数据以

表示，定量资料组间进行Student’s t检测，白内障分级资料进行Kruskal-Wallis检验，所有统计学分析均以p＜0.05为有统计学差异。Real time RT-PCR结果采用ΔΔCt法进行处理。

实验结果

与正常组大鼠尿白蛋白含量相比，糖尿病对照组大鼠24h尿液白蛋白排泄量明显升高(P＜0.001)。薯蓣皂苷组大鼠尿液白蛋白排泄量明显低于糖尿病大鼠水平(P＜0.001)，能降低大鼠尿白蛋白排泄量一半以上。见表3和图14

表3，薯蓣皂苷对糖尿病大鼠24小时尿液白蛋白排泄量的影响

数据用几何平均数×/÷容许因子表示。***P＜0.001vs正常对照组，###P＜0.001vs模型对照组.。Nor为正常对照组；Con为模型对照组。DG-400分别代表薯蓣皂苷400mg/kg灌胃给药组。

尿液微量白蛋白结果表示方法：

因为正常动物和糖尿病模型动物之间尿液白蛋白排泄量数据差异非常大，所以国外权威糖尿病和肾病杂志对大鼠尿液白蛋白测定数据进行统计分析时，均将其看作对数正态分布，将尿液白蛋白浓度取对数后进行t-检验，结果表示为几何均数(geometric mean)×/÷几何标准差(tolerance factor)^[Soulis，T.；Cooper，M.E.；Sastra，S，et.al.Relative contributions of advanced glycation and nitric oxide synthase inhibition to aminoguanidine-mediated renoprotection in diabetic rats.Diabetologia.1997，40：1141-1151

Tanya，M.O，Yunxia，Y，Sianna，P，et.al.Prevention of albuminuria by aminoguanidine or ramipril in streptozotocin-induced diabetic rats is associated with the normalization of glomerular protein kinase C.Diabetes.2000，49：87-93

Soulis T，Cooper ME，Vranes D，et.al.Effects of aminoguanidine in preventing experimental diabetic nephropathy are related to the duration oftreatment.Kidney international.1996，50：627-634

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Claims (5)

1.薯蓣皂苷在制备预防、缓解和治疗醛糖还原酶相关的疾病的药物中应用。

2.薯蓣皂苷在制备预防、缓解和\或治疗糖尿病慢性并发症的药物中应用。

3.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述的糖尿病慢性并发症选自预防、缓解和\或治疗糖性白内障、糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病变或糖尿病神经病变。

4.根据权利要求3的应用，其特征在于，预防、缓解和\或治疗预防、缓解和\或治疗糖性白内障是指延缓白内障的发生及发展过程、改善晶状体混浊度；改善晶状体渗透性膨胀、改善醛糖还原酶的过度激活、改善半乳糖醇的堆积。

5.根据权利要求3的应用，其特征在于，预防、缓解和\或治疗预防、缓解和\或治疗糖尿病肾病变是指降低尿白蛋白排泄量。

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