CN105264381B

CN105264381B - 用于确定癌症预后的方法

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Publication number: CN105264381B
Application number: CN201480026895.4A
Authority: CN
Inventors: 武藤诚; 园下将大; 坂井义治; 河田健二; 板谷喜朗
Original assignee: Kyoto University
Current assignee: Kyoto University
Priority date: 2013-05-16
Filing date: 2014-05-15
Publication date: 2018-06-01
Anticipated expiration: 2034-05-15
Also published as: EP2997378B1; CA2912526C; JP2016526147A; CN107095872A; JP6537143B2; US9863953B2; EP3168233A3; EP3168233A2; CN105264381A; WO2014185550A1; EP2997378A4; US20160103133A1; EP2997378A1; CA2912526A1

Abstract

本发明涉及用于确定受试者中癌症预后的方法，所述方法包括检测在从所述受试者获得的样品中的TRIO的2681位处的酪氨酸残基的磷酸化的步骤。

Description

用于确定癌症预后的方法

技术领域

本发明涉及用于确定受试者中癌症预后的方法、诊断组合物和试剂盒。

背景技术

在大部分工业化国家中，癌症是死亡的主要原因，并且癌症死亡的直接原因通常是其向生命器官的转移。在Japan，结直肠癌是第三大常见癌症原因，每年每100,000名人口中诊断出～100名新结直肠癌患者，并且死亡率是30–40名/100,000名患者；并且这仍然在增长。

癌症治疗，诸如化疗和射线，具有相关的风险，并且，最佳选择更可能得益的患者是重要的。尽管有一些关于结直肠癌的预后标记物的研究 (非专利文献1-7)，但是，其不足以鉴定具有良好的预后的患者，对于这样的患者，将不需要危险性的治疗。

引用列表

非专利文件

非专利文件1：Science(科学)314：268-274(2006)

非专利文件2：Science(科学)318：1108-1113(2007)

非专利文件3：NEJM 344：1196-1206(2001)

非专利文件4：Clin.Cancer Res.(临床癌症研究)17：1535-1545(2011)

非专利文件5：J.Clin.Oncol.(临床肿瘤学)29：17-24(2011)

非专利文件6：J.Clin.Oncol.(临床肿瘤学)29：1261-1270(2011)

非专利文件7：J.Clin.Oncol.(临床肿瘤学)29：4620-4626(2011)

这些参考文献通过引用结合在本文中。

发明概述

在研究癌症转移的机制时，我们证明Notch受体裂解起始DAB1-ABL 激活并且引起TRIO的Tyr-磷酸化。此外，我们发现TRIO在Y2681处的磷酸化与CRC患者差的预后相关(图6A)，并且TRIO(pY2681)不仅在原发性CRC中发出信号，而且还在其转移和包括乳腺癌和肺癌在内的多种其他类型的癌症中发出信号(图12和表2)。基于这些发现，我们完成了本发明。

在一个实施方案中，本发明提供用于确定受试者中的癌症预后的方法，所述方法包括以下步骤：在从所述受试者获得的样品中检测TRIO的 2681位处的酪氨酸残基的磷酸化，其中不存在磷酸化表示良好的癌症预后。

在另一个实施方案中，本发明提供特异性结合TRIO(pY2681)的抗体。

在另一个实施方案中，本发明提供用于确定癌症预后的诊断组合物，所述诊断组合物包含本发明的抗体。

在另一个实施方案中，本发明提供用于确定癌症预后的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的抗体。

在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗结直肠癌的药物组合物，所述药物组合物包含ABL抑制剂。

在另一个实施方案中，本发明提供用于防止癌症转移的药物组合物，所述药物组合物包含ABL抑制剂。

附图简述

图1.Notch信号传导(signaling)激活CRC细胞中的Rho从而刺激侵入

(A和B)Rbpj基因敲除阻断Apc/Aes复合突变体小鼠中肠肿瘤的侵入。在Apc/Aes双重和Apc/Aes/Rbpj三重突变体小鼠的肠中通过H&E染色(A)以组织病理学方式分析肿瘤侵入的深度并评分(B)。对于每组，n＝5。 (A)中的虚线表示粘膜肌层(muscularismucosae)的位置。(A)中的星号显示侵入到粘膜下层的CRC腺体。(B)中的侵入深度由粘膜内层(Mu)和到达粘膜下层(Sm)、固有肌层(MP)和浆膜(Se)的缩写显示。参见基因型缩写的实验规程。

(C)Apc/Aes小鼠的侵入的肠肿瘤中的Rho的激活。在GTP-Rho拉下测定(pull-down assay)中，分析来自Apc^+/Δ716对照(Apc)和Apc/Aes突变体小鼠的正常的肠粘膜(N)和肿瘤(T)的组织。还显示了总Rho蛋白的量。

(D)通过Aes的Rho激活的抑制。将Colon26 TetON-Aes-Flag细胞铺板到包被有重组的DLL4(rDLL4)的胞外结构域的培养皿上，并且通过多西环素(doxycycline)诱导有Flag-标记的Aes(Aes-F)。刮下后16小时收集细胞层，并且分析GTP-Rho。

(E和F)抑制Rho或Rock抑制培养物中的CRC细胞的基质胶侵入和透内皮迁移(TEM)。分别在存在两个剂量的Rho抑制剂C3T或Rock抑制剂Y-27632的情况下，测定RKO人CRC细胞的基质胶侵入(E)或TEM (F)。

(G和H)在用EDTA处理的人CRC细胞中通过Notch受体激活的 Rho激活的时程。将RKO细胞用10mM EDTA处理2分钟，并且在标准培养基中培养指定时间，并测定GTP-Rho。

(I)通过Notch受体经由其配体的激活来激活Rho。将RKO细胞铺板在包被有rDLL4的培养皿上，并且在指定时间点收集用于GTP-Rho拉下测定。

(J)在CRC细胞中通过敲低三个Notch受体种内同源基因减少Rho 激活。将RKO细胞用针对Notch1、2和3的siRNA(siNotch1/2/3)的混合物(对于每种种内同源基因，#1和#2)转染。非沉默siRNA(Ns)和无转染(-) 用作对照。转染后48小时，将细胞用或不用10mM EDTA处理并且分析 GTP-Rho。

(K)通过γ-分泌酶抑制Notch受体激活而抑制Rho激活。将RKO细胞用10μM DAPT处理12小时，用10mM EDTA处理，并进行Rho拉下测定。

刻度条，100μm。数据表示为平均值与SD。*p＜0.01，并且#p<0.05。对于GTP-Rho拉下测定，还测定总Rho蛋白的量。

图2.Rbpj-依赖性和-不依赖性Notch信号传导对于CRC进展都是关键的。

通过Notch受体激活的早期(A-D)和晚期(E-J)反应。

(A)Notch和Rho对于CRC细胞与内皮细胞(EC)的附着是关键的。将表达EGFP的HCT116细胞用或不用C3T或DAPT处理2小时，并且铺板到肺内皮细胞(LgEC)层上。15分钟后，将未结合的HCT116细胞清洗掉，并且通过荧光计计数保持附着的细胞数目。

(B和C)Rho的早期激活不依赖于RBPJ。通过转导两个用于非沉默对照(Ns)的表达载体或者RBPJ-敲低(shRBPJ)短发夹RNA构建体建立 HCT116细胞的稳定的克隆系(B)。在2分钟的EDTA处理后，使它们进行Rho拉下测定(C)。

(D)甚至在不存在RBPJ时，CRC细胞与EC的附着也取决于γ-分泌酶活性。将(B)中所述的RBPJ-敲低或对照细胞用或不用DAPT处理2小时，并且进行(A)中的附着测定。

(E)RBPJ对于Rho的晚期激活是关键的。将RBPJ-敲低或对照细胞用EDTA处理，并且在6或12小时测定GTP-Rho。

(F)小鼠和果蝇共有的Rbpj靶向基因。如通过RNA-seq和使用抗 -Rbpj Ab的染色质免疫沉淀(ChIP)-seq确定的，在小鼠脑中，98个基因由 Rbpj直接调节。另一方面，在果蝇中，55个基因通过Notch信号传导上调，其邻近的区域被Su(H)结合，Su(H)是小鼠Rbpj的果蝇直向同系物。显示的是在两个物种之间通过Rbpj共同表达的共有的3个基因家族；小鼠和(果蝇)基因符号。

(G)果蝇、小鼠和人dab/Dab1/DAB1启动子区中发现的Notch转录因子Su(H)/Rbpj/CBF1的高亲和性结合基序。高亲和性和低亲和性序列基序分别由实心三角和空心三角显示。用于ChIP分析的引物对(图2I，右侧) 由一对水平的三角形表示。TSS是转录起始位点。

(H)重组DLL4(rDLL4)配体在培养的CRC细胞中诱导DAB1。将 LS174T细胞用或不用10μM DAPT温育24小时，并且铺板在用或不用 rDLL4预先包被的培养皿上。四小时后，通过定量(q)RT-PCR定量DAB1 mRNA水平。

(I)RBPJ结合DAB1启动子。用抗-Rbpj或抗-NICD对LS174T裂解物进行的ChIP富集DAB1基因的基因组启动子片段，如由qPCR确定的。

(J)在Apc/Aes小鼠CRC中诱导Dab1。在Apc和Apc/Aes突变体小鼠的肿瘤中，Dab1用浅灰色染色，而细胞核用深灰色染色。框出的区域在右图中放大。符号同图1A。T，肿瘤。S，间质。

刻度条，50μm。数据表示为平均值与SD。*p<0.01。还参见图9。

图3.DAB1通过Rho激活刺激CRC侵入和转移

(A和B)Dab1对于内源性CRC的进展是关键的。将肠上皮-特异性的Dab1空突变引入到Apc/Aes双重突变体小鼠中以得到Apc/Aes/Dab1三重突变体小鼠。使用与图1A和1B相同的方法和符号。

(C，D和E)敲低DAB1抑制CRC移植物的转移。用编码EGFP的表达载体和针对DAB1的shRNA(shDAB1)转导高DAB1的LS174T细胞 (C)。建立两个克隆系，并且注射到裸鼠直肠中。在荧光解剖显微镜下评估它们的肺转移(D)，并对其数目进行评分(E)。

(F，G和H)DAB1的表达在体内刺激CRC转移。用EGFP和DAB1 的表达载体转导低DAB1的RKO细胞(F)，并且植入裸鼠直肠粘膜中。分别进行如在(D)和(E)中那样的评估(G)和定量(H)。

(I)DAB1对于通过Notch信号传导的Rho的早期和晚期激活都是关键的。将DAB1-敲低或对照克隆用10mM EDTA处理，并且在所示的时间进行Rho拉下测定。

(J)通过Notch受体分解和DAB1的Rho的协同性激活。将表达DAB1 的RKO细胞用或不用EDTA处理2分钟，并在5分钟后进行Rho拉下测定。

(K)EDTA处理后，DAB1的RBPJ-依赖性诱导。将RBPJ-敲低(shRBPJ；红色)或对照(Ns；黑色)HCT116细胞用EDTA处理，并且在指定的时间针对DAB1 mRNA进行qRT-PCR测定。

刻度条对于(A)为100μm，对于(D)和(G)为500μm。数据表示为平均值与SD。*p<0.01，并且#p<0.05。

图4.DAB1和ABL的酪氨酸磷酸化本身对于Rho激活和CRC细胞侵入是必要的

(A和B)伊马替尼(Imatinib)抑制内源性CRC的侵入。将Apc/Aes复合突变体小鼠用(红色)或不用(灰色)50mg/kg/天的伊马替尼处理9周(各 n＝5)。使用与图1A和1B相同的方法和符号。

(C)在人CRC细胞中敲低ABL抑制基质胶侵入。将RKO细胞分别用针对ABL1(siABL1)、ABL2(siABL2)的两个独立的siRNA组(#1和#2) 或它们的组合转导。转染后48小时，通过qRT-PCR定量ABL1和ABL2 的表达(下部)。同时，检测细胞的基质胶侵入(上部)。

(D)ABL敲低减少由Notch信号传导引发的Rho激活。在EDTA处理 5分钟后，在RKO细胞中检测两组组合的敲低对Rho的抑制作用。

(E)ABL抑制剂伊马替尼以剂量依赖性方式阻断CRC细胞的基质胶侵入。用伊马替尼处理RKO细胞，并检测基质胶侵入。

(F)伊马替尼抑制由Notch受体激活诱导的Rho激活。在不存在或存在伊马替尼的条件下，将RKO细胞用EDTA处理，并在5分钟后进行 Rho拉下测定。

(G)DAB1增加CRC细胞中ABL的Tyr-激酶活性。第1-3道；HCT116 细胞表达等量的Flag-标记的野生型DAB1(第2道)或其5YF突变体(第3 道)，并且，在免疫沉淀(IP)后通过蛋白质印迹(WB)确定其磷酸-Tyr(pY) 含量。第4-7道；HCT116细胞共表达DAB1-Flag和HA-标记的野生型(WT) ABL1B(ABL1B-HA)。注意，在第6和7道中DAB1-Flag cDNA的输入量分别与在第2和3道中的输入量相等。第8–11道；HCT116共表达与第4-7道中相同组的DAB1cDNA和ABL1B的激酶-死亡(KD)突变体。

数据表示为平均值与SD。*p<0.01。还参见图10。

图5.TRIO在ABL和DAB1的存在下Tyr-磷酸化，并且刺激CRC 侵入

(A)TRIO结构域结构(由(Bateman，J.和Vactor，D.V.，2001，J.Cell Sci.114:1973-1980)修改)和可磷酸化的Tyr残基的示意图。上部显示包含 3097个aa的野生型人TRIO(TRIO WT)的结构域。矩形显示所示的具体结构域。缩写：GEF，鸟嘌呤核苷酸交换因子结构域；Ig，免疫球蛋白样结构域；STK，丝氨酸-苏氨酸激酶结构域。在TRIO WT结构下方，Tyr(Y) 至Phe(F)突变的位置以红色“F”显示。Ig结构域中的星形表示G2699，在人肺癌中发现其错义突变为Val(见图7F和7G)。

(B和C)TRIO敲低抑制CRC细胞中由Notch信号传导诱导的Rho激活和基质胶侵入。将HCT116细胞用两个独立的针对TRIO mRNA的 siRNA构建体(siTRIO#1或2)转染。48小时温育后，将细胞用或不用EDTA 处理，并且测定GTP-Rho(B)和基质胶侵入(C)。

(D)在CRC细胞中，TRIO在ABL和DAB1的存在下Tyr-磷酸化。将HCT116细胞用或不用针对T7-标记的TRIO(T7-TRIO)的表达构建体转导，用或不用HA-标记的ABL1B(ABL1B-HA)和/或Flag-标记的DAB1 (DAB1-Flag)共转导。使用与图4G相同的符号。

(E)TRIO的C端半被ABL磷酸化。T7-TRIO的WT或YF突变体与或不与ABL1B-HA和DAB1-Flag同时表达，然后蛋白质印迹分析pYs。

(F)在ABL和DAB1存在下，TRIO中的Y1990和Y2681被磷酸化。注意，在Y1990F和Y2681F突变体(第2和4道)以及在4YFs(第6道)中， pY水平显著减少。

数据表示为平均值与SD。*p<0.01。

图6.人CRC中TRIO(Y2681)的磷酸化与差的预后相关。

(A)TRIO(pY2681)与CRC患者中差的预后相关。通过免疫组织化学检验来自102名患者的原发性CRC样品的TRIO(pY2681)，然后进行 Kaplan-Meier分析。(左)当合并所有阶段的患者时，32个病例是TRIO (pY2681)免疫染色阴性的(-)，而70个病例是阳性的(+)。(-)相对(+)，在卡方检验中，p＝0.01。(中)对于合并的I期和II期患者，TRIO(pY2681)-阴性组表现出100％的5年存活，TRIO(pY2681)-阳性组表现出～20％的死亡率。(-)(n＝23)相对(+)(n＝40)，在卡方检验中，p＝0.04。(右)甚至仅对于II期患者，与阳性患者(n＝33)相比，阴性患者(n＝13)具有100％的存活，表现出与合并的I期和II期相似的存活率(在卡方检验中，p＝0.1)。

(B)CRC细胞(箭头)中针对TRIO(pY2681)的染色强于在相邻的正常粘膜(N)或淋巴样滤泡(L)中的染色。框出的区域在插入的图表中放大表示。

(C，D和E)在侵入的间质中发现的CRC细胞中的TRIO(pY2681)的染色。注意，在出芽的(D)和分散的(E)CRC细胞(箭头)中，TRIO(Y2681) 被高度磷酸化。

刻度条，100μm。还参见图11。

图7.TRIO(Y2681)的磷酸化刺激RhoGEF活性并且促进CRC细胞的侵入。

(A)人CRC中核AES与TRIO(pY2681)的逆相关。显示的是用抗-AES 和抗-TRIO(pY2681)抗体免疫染色的两个代表性的系列切片组。注意，表达核AES的CRC腺体具有很少的TRIO(pY2681)染色(箭头；顶部行)，而TRIO(pY2681)-阳性CRC腺体没有AES表达(箭头；底端行)。插图显示更高放大率的框出区域。

(B)在小鼠肠肿瘤中通过失去Aes的Trio在Y2681处的磷酸化。通过IP-WB分析正常粘膜(N)和肠肿瘤(T)的裂解物的Trio(pY2681)。还显示了总Trio印迹(Trio)。

(C)TRIO(WT)而不是TRIO(Y2681F)刺激在基质胶中的CRC侵入。构建克隆的RKOTetON细胞系以多西环素(Dox)-可诱导的方式同时表达 ABL1B-HA/DAB1-Flag与T7-TRIO(WT)或T7-TRIO(Y2681F)，并且测定蛋白表达和基质胶侵入。

(D)不含细胞的RhoGEF GTP交换测定。表达TRIO(WT)蛋白，免疫沉淀，并且与重组RhoA和mant-GTP混合，mant-GTP在其与Rho结合时发出荧光。三次测定的代表性结果。

(E)TRIO(pY2681)对RhoGEF活性是关键的。纯化T7-标记的TRIO (WT或Y2681F)，并且确定其RhoGEF活性10分钟。TRIO[ima]；从伊马替尼处理的HEK293T细胞纯化的TRIO蛋白。

(F)TRIO(G2699V)刺激RhoGEF活性。纯化WT和G2699V突变体 TRIO，并且如在(E)中那样测定其RhoGEF活性。

(G)TRIO(G2699V)对Y2681处的Tyr-磷酸化更敏感。WT或G2699V T7-TRIO与或不与ABL1B-HA和DAB1-Flag同时表达。通过IP-WB分析TRIO中的pY含量。

刻度条，10μm。数据表示为平均值与SD。*p<0.01，并且#p<0.05。还参见图12。

图8.Notch信号传导激活CRC细胞中的Rho从而刺激侵入(图1的补充)。

(A)Rac抑制对CRC通过基质胶侵入几乎没有影响。在测定之前和过程中，将RKO细胞用不同浓度的Rac抑制剂NSC27366处理。

(B)通过EDTA处理的Notch受体激活。用10mM EDTA处理5分钟后，用抗-Notch1(C-term)抗体沉淀并检测Notch1和NICD。注意，用γ- 分泌酶抑制剂DAPT的处理抑制分解(cleavage)。

(C)响应于Colon26小鼠CRC细胞的EDTA处理的Rho激活。在 EDTA处理的指定时间点拉下活性Rho。还分析了总Rho。

图9.Rbpj-依赖性和-不依赖性的Notch信号传导对于CRC进展是关键的(图2的补充)

人结肠细胞中的DAB1表达。通过实时PCR定量DAB1 mRNA的量。

图10.Dab1和Abl的酪氨酸磷酸化本身对Rho激活和CRC细胞侵入是必需的(图4的补充)

(A)SRC抑制剂PP2(10μM)对基质胶侵入仅有较小的影响，而 SRC-ABL双重抑制剂达沙替尼(dasatinib)(0.01μM)表现出对基质胶中 HCT 116细胞侵入的紧密抑制。*p<0.01，#p<0.04。

(B)在Apc/Aes小鼠中在肠肿瘤中Dab 1与的Abl相互作用。使用抗 -Abl和抗-Dabl抗体通过蛋白质印迹解析并检测肿瘤裂解物的免疫沉淀物。

图11.人CRC中Trio(Y2681)的磷酸化与差的预后相关(图6的补充)

Tyr-磷酸化的TRIO的特异性抗体的验证。通过用合成的包含pY1990 或pY2681的肽免疫兔产生抗体，将其亲和纯化，并且用于免疫细胞化学。将HEK 293T细胞同时转染T7-标记的野生型(WT)、Y1990F或Y2681F TRIO的表达质粒与ABL1B和DAB1的表达质粒。注意，抗-TRIO(pY1990) 和抗-TRIO(pY2681)分别不能识别不可磷酸化的TRIO(Y1990F)和 TRIO(Y2681F)突变体，如通过免疫荧光(数据未显示)或蛋白质印迹分析确定的。对于蛋白质印迹分析，TRIO(4YFs)突变体用作Tyr-磷酸化的阴性对照(第5道)。

图12.Trio(Y2681)的磷酸化刺激RhoGEF活性并且促进CRC细胞的侵入(图7的补充)

(A和B)用抗-TRIO(pY2681)抗体免疫染色的直肠腺癌(A)及其向肺部的转移(B)。注意，转移的癌细胞包含比其原发性肿瘤更丰富的 TRIO(pY2681)信号。

(C和D)用抗-TRIO(pY2681)抗体免疫染色的结肠腺癌(C)与其向卵巢的转移(D)。注意，转移的癌细胞保持如在原发性肿瘤中的 TRIO(pY2681)。

(E和F)食管鳞状细胞癌(E)和胃腺癌(F)的TRIO(pY2681)免疫组织化学。注意，癌细胞具有强的TRIO(pY2681)染色(箭头)。

方形框出的区域在插入图中被放大。Mx，转移。刻度条，100μm。

图13.人CRC中的Trio(Y2681)的磷酸化与较差的预后相关。

关于原发性CRC样品的Trio(pY2681)的疾病特异性存活的 Kaplan-Meier分析。(A)当合并所有阶段的患者时(n＝339)，150个病例是Trio(pY2681)-低的，而189个病例是Trio(pY2681)-高的(在时序检验中， P<0.001)。(B)II期亚群(n＝115)具有Trio(pY2681)-低(n＝45)和–高(n＝70) 的患者(P＝0.015)。(C)IV期亚群(n＝57)具有Trio(pY2681)-低(n＝11)和- 高的患者(n＝46)(P＝0.006)。

图14.人肺腺癌中Trio(Y2681)的磷酸化与较差的预后相关。

关于原发性肺腺癌样品的Trio(pY2681)的疾病-特异性存活的 Kaplan-Meier分析。合并所有阶段的患者(n＝214)，143个病例是 Trio(pY2681)-低的，而71个病例是Trio(pY2681)-高的(在时序检验中，P ＝0.002)。

图15.人胃癌中Trio(Y2681)的磷酸化与较差的预后相关。

关于原发性胃癌样品的Trio(pY2681)的疾病-特异性存活的 Kaplan-Meier分析。合并I-III期患者(n＝172)，82个病例是Trio(pY2681)- 低的，而90个病例是Trio(pY2681)-高的(在时序检验中，P<0.001)。

图16.人胰腺癌中Trio(Y2681)的磷酸化与较差的预后相关。

关于原发性胰腺癌样品的Trio(pY2681)和Smad4的疾病-特异性存活的初级Kaplan-Meier分析。合并所有阶段的患者(n＝20)，(在时序检验中，分别地，P＝0.063和0.064)。尽管Trio(pY2681)和Smad4在此处都表现出几乎相同的P值，但是它们是统计学不相关的(P＝0.51)，这表明彼此是独立的。

实施方案描述

用于本文时，"TRIO"是指所有哺乳动物物种的天然TRIO，包括人 TRIO。术语“天然的TRIO”包括天然存在的变体，例如，TRIO的交替剪接的变体和等位基因变体。用于本文时，“TRIO的2681位处的酪氨酸残基”是指与SEQ ID NO:1的2681位处的酪氨酸残基相对应的天然TRIO 中的酪氨酸残基，在天然TRIO中，其可能不在2681位处。用于本文时， "TRIO(pY2681)"是指这样的TRIO，其中与SEQ ID NO:1的2681位处的酪氨酸残基相对应的酪氨酸残基被磷酸化。

用于本文时，癌症的预后包括预测存活的持续时间、无复发存活的持续时间、无进展存活的持续时间和易患或诊断患有癌症的受试者转移的可能性。在优选的实施方案中，癌症的预后是受试者在手术切除原发性肿瘤后存活的持续时间。

用于本文时，术语“受试者”和“患者”包括，但不限于，人，猴，兔，鸡和小鼠。在优选的实施方案中，受试者或患者是人。在优选的实施方案中，受试者或患者是已经接受原发性肿瘤手术切除的人癌症患者。

“样品”包括从受试者获得的多种样品类型，并且包括实体组织样品或来源于其的组织培养物或细胞。样品可以通过本领域已知的多种方法获得，包括，但不限于，手术切除，吸出或活组织检查，并且可以是新鲜的或冷冻的。术语“样品”还包括在其获取之后以任何方式操作的样品，诸如通过用试剂处理，增溶化或针对某些成分(如蛋白或多核苷酸)富集，或包埋在半固体或固体基质中用于切片目的。在优选的实施方案中，在手术去除肿瘤后，由受试者的癌性组织获得样品。所述癌性组织可以来源于内窥镜切除的息肉，或手术切除的原发性或转移性肿瘤。优选地，所述癌性组织通过手术切除由原发性肿瘤获得。

如在下述实例中所示，TRIO的2681位处的酪氨酸残基的磷酸化与癌症的转移有关，并且不仅在结直肠癌中而且在其他癌症中检测到 TRIO(pY2681)(图7和12以及表2)。因此，本发明的方法可以用于多种癌症。癌症的实例包括结直肠癌(包括直肠癌和结肠癌)；下述器官的癌症：肾上腺，血液(淋巴瘤)，骨，脑，乳腺，结直肠，子宫内膜，食道，胆囊，肾，喉，肝，肺，口腔，卵巢，胰腺，前列腺，唾液腺，皮肤，小肠 (GIST)，软组织，胃，睾丸，甲状腺，膀胱，子宫颈；鳞状细胞癌，子宫癌，黑素瘤，多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤，头颈癌，胶质母细胞瘤，和相关的转移。在一个实施方案中，所述癌症选自由下述组成的组：结直肠癌，乳腺癌，肺癌，胰腺癌和胃癌。在优选的实施方案中，癌症选自由下述组成的组：结直肠癌，乳腺癌，肺癌和胃癌。在更优选的实施方案中，癌症选自由结直肠癌和胃癌组成的组。在更优选的实施方案中，癌症是结直肠癌。

结直肠癌(也称作CRC)基于癌症生长入肠壁的程度、其是否到达附近的结构以及其是否已经扩散到淋巴结或远处的器官而分期(表1)。

表1结直肠癌分期

(http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/colon/Patient/ page2)

如在下述实例中所示，使用TRIO(pY2681)染色可以进一步区分I和 II期CRC患者中的两个亚群。即，具有阴性pY2681的那些表现出100％治愈(完全没有复发)，而具有pY2681-阳性原发性肿瘤的那些在5年内具有～20％的复发(图6A，图13B)。因此，对于按照目前的原则没有进行辅助化疗的I和II期患者，本发明的方法可以鉴定在手术后应该考虑用辅助治疗进一步治疗的患者。对于III和IV期患者，本发明的方法可以有助于给更高风险的亚群分层。因此，本发明的方法可以用于被诊断患有I-IV 期中任一期的结直肠癌的受试者，并且特别可用于被诊断患有I或II期、特别是II期结直肠癌的受试者。

TRIO的2681位处的酪氨酸残基的磷酸化可以通过抗-TRIO(pY2681) 抗体检测。用于本文时，“抗-TRIO(pY2681)抗体”是指特异性结合TRIO (pY2681)的抗体。“特异性结合TRIO(pY2681)”的抗体是指与TRIO (pY2681)结合但是不与2681位的酪氨酸残基未被磷酸化的TRIO(本文也称为“未磷酸化的TRIO(Y2681)”)结合的抗体。

磷酸化可以通过本领域公知的多种方法检测，包括免疫组织化学测定，ELISA(酶联免疫吸附测定)和蛋白质印迹分析。在优选的实施方案中，使用免疫组织化学测定。

在一个实施方案中，样品是从手术切除获得的组织样品，并被固定和包埋在石蜡等中。组织样品可以通过常规方法固定("Manual of Histological Staining Method ofthe Armed Forces Institute of Pathology(军方病理学研究所组织染色法手册),"第3版，(1960)Lee G.Luna，HT(ASCP) Editor，The Blakston Division McGraw-Hill BookCompany，New York；The Armed Forces Institute of Pathology Advanced LaboratoryMethods in Histology and Pathology(军方病理学研究所组织学和病理学高级实验室方法)(1994)Ulreka V.Mikel，Editor，Armed Forces Institute of Pathology，American Registry of Pathology，Washington，D.C.；这些参考文献通过引用结合在本文中)。例如，中性缓冲的福尔马林，Bouin's或低聚甲醛，可以用于固定样品。通常，样品先被固定，然后通过递增系列的醇脱水，浸润并且用石蜡或其他切片介质包埋，以使组织样品可以被切片。备选地，可以将冷冻的组织切片并将所得到的切片固定。在优选的实施方案中，组织样品可以通过常规方法在石蜡中包埋和处理。一旦组织样品被包埋，样品可以通过切片机等切片。切片厚度可以为约3微米至约5微米。在切片后，所述切片可以通过若干标准方法附着到载玻片上。载玻片粘合剂的实例包括，但是不限于，硅烷，明胶，聚-L-赖氨酸等。例如，石蜡包埋的切片可以附着到带正电的载玻片和/或由聚-L-赖氨酸包被的载玻片上。如果已经使用石蜡作为包埋物质，则通常将组织切片脱石蜡并用水再水合。组织切片可以通过几种常规标准方法脱石蜡。例如，可以使用二甲苯和逐渐递减系列的醇。备选地，可以使用商购的脱石蜡非有机试剂，如 Hemo-De7(CMS，Houston，Texas)。

在封闭步骤后，将组织切片暴露于与靶抗原(即TRIO(pY2861))特异性结合的抗体达充分的时间并且在适于所述抗体与组织样品中的靶抗原结合的条件下。适用于实现此的条件可以通过常规实验确定。所述抗体可以用放射性同位素、荧光标记或酶标记来标记，以在没有进一步抗体相互作用的条件下可视化所述靶抗原。备选地，与靶抗原特异性结合的抗体可以用作一抗，与其一起的是与所述一抗结合的标记的二抗。

为了检测癌症组织中的Trio(pY2681)，可以使用细胞ELISA (CELISA)，其是ELISA的一种改良。CELISA可以在96孔板中进行，其允许高通量结果。每个孔的底部附着有组织切片，所述组织切片然后被用去污剂渗透化处理。然后将样品在孔中与Trio(pY2681)抗体一起温育。将未结合的抗体洗掉后，然后使结合的一抗与酶连二抗结合，并再次洗掉未结合的抗体。然后通过偶联的酶反应的活性测量特异性结合的二抗的量 (例如，Schlosser，M.等，J.Immunol.Methods，140：101-109，1991，其通过引用结合在本文中)。

从受试者获得的样品中TRIO的2681位的酪氨酸残基的磷酸化可以通过将所述样品与适当的对照样品比较进行检测。示例性的对照样品包括阴性对照样品(例如，来自健康受试者的非癌性组织或来自具有良好预后的癌症患者的癌性组织)或阳性对照样品(例如，来自具有差的预后的癌症患者的癌性组织)。

用于本文时，不存在磷酸化是指与阴性对照样品观察到的磷酸化水平相比不显著的磷酸化水平。相反，存在磷酸化是指与阴性对照样品观察到的磷酸化水平相比显著的磷酸化水平。在本发明中，不存在磷酸化表示良好的癌症预后。在一个实施方案中，不存在磷酸化表示在手术切除原发性肿瘤后长期存活的可能性。在另一个实施方案中，不存在磷酸化表示在手术切除原发性肿瘤后5年内不复发的可能性。在另一个实施方案中，不存在磷酸化表示在手术切除原发性肿瘤后不需要辅助治疗。在另一个实施方案中，存在磷酸化表示在手术切除原发性肿瘤后需要辅助治疗。辅助治疗包括化疗、放疗、激素疗法、靶向疗法和生物疗法，并且优选是化疗。在优选的实施方案中，考虑到防止转移，辅助治疗是使用ABL激酶抑制剂 (诸如伊马替尼)的化疗。

在不同的实施方案中，本发明提供ABL激酶抑制剂(诸如伊马替尼)，其用于手术切除受试者中的原发性肿瘤后的辅助治疗。优选地，所述受试者是患有结直肠癌的人患者。

用于本文时，术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体和抗体片段。 “抗体”可以是在啮齿动物(小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔等)、鸟类(鸡、鹌鹑、火鸡等)、大哺乳动物(山羊、绵羊、驴等)中产生的抗体，人抗体，嵌合抗体和人源化的抗体。

抗-TRIO(pY2681)抗体可以使用来源于具有包含在2681位的磷酸化的酪氨酸的氨基酸序列的TRIO的肽作为免疫抗原进行制备。所述肽的长度没有特别限制，并且可以是5-30个氨基酸，优选5-20个氨基酸，更优选8-15个氨基酸。在优选的实施方案中，所述肽具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

多克隆抗体可以通过常规方法制备，例如，在“Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)”，Lane，H.D.等编，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork，1989中所述的方法，该文献通过引用结合在本文中。简言之，多克隆抗体可以通过用上文所述的来源于TRIO 的肽免疫动物(如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、鸡、鹌鹑、火鸡、山羊、绵羊或驴)制备。

单克隆抗体可以通过最先由Kohler等，Nature 256:495(1975)(其通过引用结合于此)所述的杂交瘤法制备，或者可以通过重组DNA法(美国专利号4,816,567，其通过引用结合于此)制备。单克隆抗体还可以使用例如Clarkson等，Nature 352:624-628(1991)(其通过引用结合于此)或Marks 等，J.MoI.Biol.222:581-597(1991)(其通过引用结合于此)所述的技术从噬菌体抗体文库分离。

嵌合抗体是包含来源于非人的哺乳动物(如小鼠)的抗体的重链和轻链上的可变区和来源于人抗体的重链和轻链上的恒定区的抗体。嵌合抗体可以通过以下方法获得：将编码小鼠抗体的可变区的DNA与编码人抗体的恒定区的DNA连接，并且结合到表达载体中并引入用于抗体产生的宿主。

人源化抗体由来源于非人哺乳动物的抗体的互补决定区(CDR)和来源于人抗体的构架区(FR)和恒定区组成。人源化抗体可以通过将来源于非人动物(如小鼠)的抗体的CDR移接到人抗体的CDR中而获得。具体地，通过PCR合成被设计成将小鼠抗体CDR与人抗体FR连接的DNA序列，使用被构建成具有CDR和FR二者末端的重叠位置的若干寡核苷酸作为引物。将得到的DNA与编码人抗体的恒定区的DNA连接，然后将其结合到表达载体中，所述表达载体被引入到宿主中并通过宿主表达，从而获得所述抗体(欧洲专利EP 239400；国际公布WO 96/02576；这些参考文献通过引用结合在本文中)。

用于获得人抗体的方法也是已知的。例如，在体外将人淋巴细胞用需要的抗原或表达所述需要的抗原的细胞致敏，并将致敏的淋巴细胞与人骨髓瘤细胞(例如U266)融合，以获得能够与所述抗原结合的所需的人抗体 (Japan专利公布号H1-59878，其通过引用结合在本文中)。备选地，可以用需要的抗原免疫具有人抗体基因的全体成员的全部的转基因动物来获得所需要的人抗体(国际公布WO 93/12227，WO 92/03918，WO 94/02602， WO94/25585，WO 96/34096和WO 96/33735；这些参考文献通过引用结合在本文中)。此外，通过自人抗体文库进行淘选来选择人抗体的技术也是已知的。例如，通过噬菌体展示法将人抗体的可变区作为单链抗体(scFv) 在噬菌体表面上表达，并且选择与所述抗原结合的噬菌体。分析所选择的噬菌体的基因，以确定编码与所述抗原结合的人抗体的可变区的DNA的序列。一旦确定了与所述抗原结合的scFv的DNA序列，可以制备包含所述序列的适当的表达载体，以产生人抗体。这些方法是公知的，并且记述在国际公布WO 92/01047，WO 92/20791，WO 93/06213，WO 93/11236， WO 93/19172，WO 95/01438和WO 95/15388(这些参考文献通过引用结合于此)中。

抗体片段的实例包括Fab，F(ab')2，Fv，具有一个Fab和完整的Fc 的Fab/c，和单链Fv(scFv)，其中H链和L链的Fv通过适当的接头连接。抗体片段可以通过用酶(如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)处理抗体而获得。备选地，构建编码这样的抗体片段的基因并将其引入到表达载体中，并且在适当的宿主细胞中表达所述抗体片段(例如，参见Co，M.S.等，J.Immunol. (1994)152，2968-2976，Better，M.&Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(酶学方法)(1989)178，476-496，Academic Press，Inc.，Plueckthun，A.& Skerra，A.Methods in Enzymology(酶学方法)(1989)178，476-496， Academic Press，Inc.，Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(酶学方法)(1989) 121，652-663，Rousseaux，J.等，Methods in Enzymology(酶学方法)(1989) 121，663-669，Bird，R.E.等，TIBTECH(1991)9，132-137；这些参考文献通过引用结合于此)。

用于本文时，“抗体”包括用多种分子如放射性同位素、荧光标记和酶标记中的任一种修饰的抗体。放射性同位素的实例包括³⁵S，¹⁴C，¹²⁵I， ³H和¹³¹I。酶标记的实例包括荧光素酶、荧光素、过氧化物酶(如辣根过氧化物酶)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶等。荧光标记的实例包括Texas Red，罗丹明(rhodamine)，荧光素，丹酰(dansyl)，丽丝胺(Lissamine)，伞形酮，phycocrytherin，藻蓝蛋白，或商购的荧光团如SPECTRUM ORANGE7和SPECTRUMGREEN7和/或前述任一种或多种的衍生物，或荧光染料如AlexaFluor，Cy3，Cy5。所述抗体可以使用常规方法(Current Protocols in Immunology(现代免疫学方法)，卷1和2，Coligen等编. Wiley-Interscience，New York，New York，Pubs.(1991)；Methods inEnzym. (酶学方法)，73:147-166(1981)；这些参考文献通过引用结合于此)用放射性同位素、荧光标记或酶标记标记。

在一个实施方案中，本发明提供用于确定癌症预后的诊断组合物，所述组合物包含本发明的抗体。本发明的诊断组合物按照本发明所述的方法使用，所述诊断组合物可以与按照本文所述的本发明的方法的使用说明一起提供。

在一个实施方案中，本发明提供用于确定癌症预后的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的抗体。本发明的试剂盒按照本发明的方法使用。所述试剂盒可以是用于免疫组织化学测定、蛋白质印迹分析或ELISA的试剂盒。所述试剂盒可以包含其他可选的成分如一种或多种缓冲液(例如，封闭缓冲液，洗涤缓冲液，底物缓冲液等)，其他试剂如通过酶标记化学改变的底物(例如，色原体)，和对照样品(阳性和/或阴性对照)以及按照本文所述的本发明的方法使用的使用说明。

在一个实施方案中，本发明提供用于治疗结直肠癌的药物组合物，所述药物组合物包含ABL抑制剂。

在另一个实施方案中，本发明提供用于防止癌症转移的药物组合物，所述药物组合物包含ABL抑制剂。所述转移包括微转移(micrometastasis)。癌症的实例包括结直肠癌(包括直肠癌和结肠癌)；下述器官的癌症：肾上腺，血液(淋巴瘤)，骨，脑，乳腺，结直肠，子宫内膜，食道，胆囊，肾，喉，肝，肺，口腔，卵巢，胰腺，前列腺，唾液腺，皮肤，小肠(GIST)，软组织，胃，睾丸，甲状腺，膀胱，子宫颈；鳞状细胞癌，子宫癌，黑素瘤，多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤，头颈癌，胶质母细胞瘤，和相关的转移。在一个实施方案中，所述癌症选自由下述组成的组：结直肠癌，乳腺癌，肺癌，胰腺癌和胃癌。在优选的实施方案中，癌症选自由下述组成的组：结直肠癌，乳腺癌，肺癌和胃癌。在更优选的实施方案中，癌症选自由结直肠癌和胃癌组成的组。在更优选的实施方案中，癌症是结直肠癌。

ABL抑制剂的实例包括伊马替尼(4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)-嘧啶-2-基氨基-)苯基]-苯甲酰胺)，尼罗替尼(nilotinib) (4-甲基-N-[3-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-5-(三氟甲基)苯基]-3-[(4-吡啶-3-基嘧啶-2-基)氨基]苯甲酰胺)，帕纳替尼(ponatinib)(3-(2-咪唑[1,2-b]哒嗪-3-基乙炔基)-4-甲基-N-[4-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺)，达沙替尼(dasatinib)(N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺一水合物)，伯舒替尼(bosutinib) (4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基] 喹啉-3-甲腈)和befatinib(INNO-406)(N-[3-([5,5'-二嘧啶]-2-基氨基)-4-甲基苯基]-4-[[(3S)-3-(二甲基氨基)-1-吡咯烷基]甲基]-3-(三氟甲基)苯甲酰胺) 或它们的药用盐。在优选的实施方案中，所述ABL抑制剂是伊马替尼或其药用盐。

伊马替尼的药用盐包括药用酸加成盐，如例如与无机酸，如盐酸、硫酸或磷酸的酸加成盐，或与适当的有机羧酸或磺酸的酸加成盐，所述有机羧酸或磺酸例如脂族单-或二-羧酸，如三氟乙酸，乙酸，丙酸，羟基乙酸，琥珀酸，马来酸，富马酸，羟基马来酸，苹果酸，酒石酸，柠檬酸或草酸，或氨基酸，如精氨酸或赖氨酸，芳香族羧酸，如苯甲酸，2-苯氧基-苯甲酸，2-乙酰氧基-苯甲酸，水杨酸，或4-氨基水杨酸，芳香族-脂族羧酸，如苦杏仁酸或肉桂酸，杂芳香族羧酸，如烟酸或异烟酸，脂族磺酸，如甲磺酸，乙磺酸或2-羟基乙磺酸，或芳香族磺酸，例如苯磺酸，对甲苯磺酸或萘-2-磺酸。在优选的实施方案中，使用伊马替尼的单甲磺酸加成盐，即，WO99/03854(其通过引用结合于此)中公开的甲磺酸伊马替尼。

以取决于物种、年龄、个体情况、给药模式和谈论的临床现象的日剂量将ABL抑制剂施用于受试者。例如，ABL抑制剂可以以约100-1000mg、优选约200-600mg、更优选约400-600、尤其是约400mg的日剂量施用给成年人。

在优选的实施方案中，本发明的药物组合物用于辅助治疗。优选地，所述辅助治疗是在手术切除患者中的原发性肿瘤后的治疗。

本发明提供用于治疗结直肠癌的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用ABL抑制剂，并且提供防止癌症转移的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用ABL抑制剂。此外，本发明提供ABL抑制剂用于制备用于治疗结直肠癌的药物的应用，和ABL抑制剂用于制备用于防止癌症转移的药物的应用。本发明的方法和应用可以如关于本发明的药物组合物所说明的那样实施。

在下述实施例中进一步描述本发明，下述实施例无一意欲限制本发明的范围。

实施例

实验方法

突变体小鼠、CRC细胞和直肠内移植

产生并维持Apc^+/Δ716突变体小鼠，如之前所述{Oshima，1995}。如报道地那样构建Apc^+/Δ716Aes^{Floxed/Floxed}vCre^ERT2(缩写为Apc/Aes)小鼠以利用 Cre^ERT2敲除Apc^+/Δ716小鼠中的Aes，Cre^ERT2的表达由肠上皮特异性的绒毛蛋白启动子驱动{Sonoshita，2011}。如报道那样构建Rbpj floxed等位基因{Han，2002}，由RIKEN BRC获得，并且与Apc/Aes小鼠杂交，以得到Apc^+/Δ716Aes^{Floxed/Floxed}Rbpj^{Floxed/Floxed}vCre^ERT2(Apc/Aes/Rbpj)小鼠。构建 Dab1floxed等位基因(Imai等，在制备中)，并且与Apc/Aes小鼠杂交以获得Apc^+/Δ716Aes^Floxed/ ^FloxedDab1^{Floxed/Floxed}vCre^ERT2(Apc/Aes/Dab1)小鼠。在12 周龄时，分析复合突变体小鼠中的肿瘤组织病理学。对于ABL抑制，将 Apc/Aes小鼠自其3周龄时起用伊马替尼(LCLaboratories)以50mg/kg/天 (i.p.)的剂量处理9周，所述剂量抑制BCR-ABL–转化的细胞系在移植的小鼠中的肿瘤发生活性{Buchdunger，2001}。对于每种突变体基因型，将来自5只小鼠的总共～100个直径大于2mm的肿瘤评分。CRC细胞系从 ATCC获得。在移植到直肠平滑肌中后，CRC细胞在一周内形成可见的原发性肿瘤。六周后，对小鼠进行安乐死，并且在荧光显微镜(Leica)下检查转移灶。所有的动物实验都按照由京都大学动物护理和应用委员会核准的程序进行。

活性Rho拉下测定

通过按照供应商的程序使用Rho激活测定试剂盒(Thermo)将 GTP-Rho拉下并检测。简言之，用裂解缓冲液裂解组织或CRC细胞，并且用Rhotekin将裂解物中的GTP-Rho拉下，并在western分析中通过抗 -Rho抗体进行检测。

rDLL4实验

用PBS重悬重组DLL4(rDLL4)(R&D)。对于刮擦和GTP-Rho拉下测定，将1μg放到6孔培养板中以用rDLL4以0.1μg/cm²包被其表面。对于q-RT-PCR测定，平板表面用rDLL4以0.1-1μg/cm²包被。在4度过夜孵育后，将所述平板用PBS洗涤一次，并用CRC细胞涂板。对于HES1 和DAB1的表达分析，将细胞裂解，并且在四小时后提取mRNA。

刮擦(scratch)测定

如所述构建Colon26 TetON-Aes-Flag细胞，从而通过多西环素诱导 Flag-标记的Aes的表达(Sonoshita等，2011)。将细胞铺板到用rDLL4包被的培养皿上，进行培养直到它们接近汇合(subconfluent)，并且在刮擦之前用多西环素处理16小时。进行刮擦后四小时，收集细胞用于活性Rho 的拉下测定。

基质胶侵入和TEM测定

在基质胶侵入和TEM测定之前，将培养的癌症细胞用C3T (Cytoskeleton)，Y-27632(Wako)，NSC27366，PP2(Calbiochem)，伊马替尼或达沙替尼(LC Laboratories)处理16小时。如之前所述使用基质胶(BD) 进行基质胶侵入测定{Sonoshita，2011}。对于TEM测定，将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种在Transwell(Corning)的上室中。一天(24h)后，将EGFP-标记的CRC细胞铺板到HUVEC层上。24小时后，在荧光显微镜下计数迁移到膜的低侧的CRC细胞。

通过EDTA的Notch受体激活

将培养的CRC用PBS洗涤，用在PBS中的10mM EDTA处理2分钟，并且在培养基中再次温育。已经显示该处理通过促使Notch胞外结构域的脱落而激活Notch受体(Rand等，2000；Tiyanont等，2011)。在温育指定的时间后，将细胞裂解，并且检测裂解的Notch和GTP-Rho。将DAPT (Calbiochem)施用到培养的CRC细胞以抑制其γ-分泌酶活性。

敲低实验

通过使用HiperFect转染试剂(QIAGEN)将siRNA寡聚物(QIAGEN) 转染到CRC细胞中。转染四十八小时后，对细胞进行基质胶侵入、 GTP-Rho拉下或基因表达测定。对于移植实验，将DAB1的敲低序列 (shDAB1#1：AAGGATTAAGTAGGATGTCAA(SEQ ID NO:2)，shDAB1#2：CCGGTACAAAGCCAAATTGAT(SEQ ID NO:3))分别插入到pLB载体 (Addgene)中。然后，制备慢病毒颗粒，并感染到LS174T细胞中，以得到组成型DAB1敲低的EGFP⁺细胞。如之前所述得到稳定的RBPJ的敲低克隆(Sonoshita等，2011)。

附着(attachment)测定

按照确定的程序{Reymond，2012}进行附着测定。简言之，将人肺内皮细胞铺板到胶原蛋白包被的培养皿上。在其达到汇合从而形成层后，将 EGFP标记的CRC细胞铺板到其上。十五分钟后，用PBS洗掉漂浮的细胞，并且在荧光显微镜下计数粘附到内皮层上的CRC细胞的数目。

Dab/Dab1/DAB1启动子分析

从UCSC基因组浏览数据库(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway) 提取蝇(Fly)dab，小鼠Dab1，和人DAB1启动子。通过如之前所述的基于文本的搜索(text-basedsearch)进行对高-和低-亲和性Su(H)/Rbpj结合位点的图表分析(Nellesen等，1999)。

定量PCR(q-PCR)

用于定量HES1、DAB1、ABL1和ABL2mRNA的TaqMan引物/探针购自ABI。按照公开的程序(Kakizaki等，2010)使用CRC细胞和抗-Rbpj (Institute of Immunology)和抗-NICD(Cell SignalingTechnology)抗体进行 ChIP分析。使用hHES1ChIP.F(CGTGTCTCCTCCTCCCATT)(SEQ ID NO: 4)和hHES1ChIP.R(GAACGGCTCGTGTGAAACTT)(SEQ IDNO:5)引物通过SYBR green(ABI)检测沉淀的基因组DNA的片段对HES1基因启动子区的富集，所述引物将Rbpj的高亲和性结合序列夹在中间。类似地，通过hDAB1ChIP.F2(CAAGCTCTGTGCTTGTCTCA)(SEQ ID NO:6)和 hDAB1ChIP.R2(GTAGCTGTGTGGTCTTATCA)(SEQID NO:7)引物定量 DAB1启动子片段的富集。

免疫组织化学

按照标准程序制备冷冻和石蜡包埋的小鼠组织。人CRC组织(n＝ 102，0-4期)用京都大学伦理委员会核准的程序切割自在2005至2007年间在京都大学医院在知情同意的情况下进行手术的患者。在该研究中还使用人组织阵列切片(Human Tissue Array slides)(SuperBioChips)用于分析转移的CRC和其他类型的癌症。将切片用H&E染色或者与对DAB1(SIGMA)、Aes(Sonoshita等，2011)、TRIO(pY1990)或TRIO(pY2681)特异的一抗(按照下文所述制备)一起孵育，然后与Alexa Fluor(Molecular Probes)缀合的或生物素化的二抗(Vector Laboratories)一起孵育。

过表达实验

将野生型DAB1 cDNA(由Kamon Sanada，The University of Tokyo， Japan提供)插入到pMX-IRES-EGFP(由Toshio Kitamura，The University of Tokyo，Japan提供)中。制备反转录病毒颗粒并将其感染到RKO细胞中，并验证EGFP+细胞稳定表达DAB1。

免疫沉淀-Western分析

由人结肠cDNA库制备ABL1B cDNA，并且用血凝素(HA)序列标记，以构建ABL1B-HA。将野生型cDNA通过QuikChange Lightning多位点定向诱变试剂盒(Agilent)诱变，以得到激酶-死亡(kinase-dead) ABL1B(K290R)-HA突变体。将这些ABL1B构建体置于pEFBosneo表达载体(由Shigekazu Nagata，Kyoto University，Japan提供)中。将DAB1-Flag cDNA插入到pcDNA3(Invitrogen)中。将TRIO cDNA(由Anne Debant， CRBM-CNRS，France提供)用T7序列标记，并且插入到携带CAG启动子和兔β-球蛋白聚(A)的pCX表达载体(由Masaru Okabe，Osaka University，Japan提供)中。NICD-Myc表达载体由TasukuHonjo，Kyoto University，Japan提供。将这些表达载体用Lipofectamine LTX(Invitrogen) 转染到CRC或HEK293T细胞中。转染后十六小时，将细胞在裂解缓冲液(10mMTris-Cl，1mM EDTA，150mM NaCl和1％NP-40)中裂解。将上清与缀合有抗-HA、Flag、T7或Myc抗体(MBL)的琼脂糖混合。将珠子用裂解缓冲液洗涤，然后在SDS样品缓冲液中煮沸。洗脱的蛋白通过 SDS-PAGE分离，转移到尼龙膜上，并且用针对HA、Flag、Myc、磷酸酪氨酸(pY；Cell Signaling Technology)、TRIO(pY2681)或T7(Novagen) 的抗体探测。用抗-Notch1(Santa Cruz)免疫沉淀内源性的Notch1，并在 western分析中用相同的抗体探测。分别用抗-Dab1或抗-Trio抗体(Santa Cruz)从小鼠肠裂解物免疫沉淀内源性的Dab1或Trio。

TRIO诱变

通过NetPhos2.0在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/) (Blom等，1999)预测TRIO中可能的Tyr磷酸化位点。在候选中，我们通过QuikChange Lightning多位点定向诱变试剂盒(Agilent)将具有高概率的 18个Tyr诱变成Phe，以产生YF不可磷酸化的突变体。使用相同的试剂盒将人癌症中TRIO的各个点突变引入到野生型TRIO中。通过DNA测序和western分析证实构建体的完整性。

制备抗-TRIO(pY1990)和抗-TRIO(pY2681)抗体

在Scrum(Japan)合成肽1985-1994 VRDLG(pY)VVEG(SEQ ID NO:8) 和2676-2686NPNYI(pY)DVPPE(SEQ ID NO:9)，并且将其注射到兔中。通过ELISA验证其效价后，使用固定的抗原和未磷酸化的对应肽亲和纯化每种抗体。

免疫细胞化学

将HCT116细胞用针对T7-TRIO、ABL1BHA和DAB1-Flag的表达质粒转染，并且接种到腔式载玻片(Thermo)上。温育16小时后，将细胞用在PBS中的3.7％甲醛固定5分钟，用包含0.1％TritonX-100的PBS渗透化处理5分钟，然后在5％正常的驴血清中封闭30分钟。然后，将样品与对T7和Tyr-磷酸化的TRIO特异的一抗在室温温育1小时。用PBS 洗涤三次后，将其与Alexa Fluor-缀合的二抗温育。将样品用PBS洗涤，然后用具有DAPI的VECTASHIELDMounting Medium(Vector Labs)封固在玻璃载玻片上。

构建RKO TetON细胞

将RKO细胞用pCMV-Tet3G(Clontech)转染，并且建立G418(Nacalai) 抗性克隆。通过其响应于多西环素(Clontech)而诱导荧光素酶的能力选择 “母本”TetON克隆。然后，将此种母本株系用编码ABL1B-HA和 DAB1-Flag的cDNA的pTRE3G载体(Clontech)转染，以建立双重可诱导的“RKO TetON ABL1B-HA/DAB1-Flag”细胞。随后，将它们用携带 T7-TRIOcDNA的pTRE3G转染，以构建三重可诱导的“RKO TetON T7-TRIO/ABL1B-HA/DAB1-Flag”细胞。

体外RhoGEF交换测定

首先，我们用T7-TRIO(WT，Y2681F或G2699V)的表达质粒转染 HEK293T细胞，并且使用缀合抗-T7抗体(MBL)的琼脂糖从细胞裂解物中拉下各种TRIO蛋白。然后，我们将TRIO级分与重组RhoA在mant-GTP (Cytoskeleton)存在下混合，mant-GTP在与Rho小GTP酶结合时发射较强的荧光(Rossman等，2002)。

数据分析

数据使用SPSS(IBM)通过Student’s t或卡方检验分析，并且表示为平均数±SD。P值<0.05认为是显著性的。

结果

Rbpj对于肠肿瘤侵入是关键的

如我们最近已经显示的，侵入性和内渗入血管(intravasating)的肿瘤在 Apc和Aes基因的复合突变体小鼠(缩写为Apc/Aes小鼠)的肠中发展(图 1A，左){Sonoshita，2011}。尽管Aes抑制CRC中Notch-依赖性的转录，但是由失去Aes阻遏的Notch信号传导是怎样刺激肠肿瘤进展的还是不清楚。作为Notch信号传导的转录因子，Rbpj(在人中为akaCBF1)在靶基因表达中起关键作用{Artavanis-Tsakonas，1999}。为了确定Rbpj在内源性CRC进展中的作用，我们将Rbpj无效突变{Han，2002}以肠上皮特异性方式引入到Apc/Aes双重突变体小鼠中，并且构建Apc/Aes/Rbpj三重突变体小鼠。有趣的是，敲除Rbpj显著减少肿瘤侵入和内渗，而不影响其尺寸或数量(图1A和B，数据未显示)，这表明Rbpj在通过Notch靶基因转录的CRC进展中起关键作用。

Notch信号传导通过Rho激活刺激CRC细胞的侵入和透内皮迁移(TEM)

我们接着研究了Notch信号传导下游的促进CRC侵入和内渗的效应子。Rho家族小GTP酶是被充分表征的细胞运动调节剂，其表现为是癌症转移所必需的{Hall，1998；Hall，2009；Weinberg，2007}。因此，我们首先利用拉下测定研究了良性(Apc)和侵入性(Apc/Aes)结肠肿瘤中Rho、 Rac和Cdc42的激活状态。我们发现，在来自Apc/Aes复合突变体小鼠的肠肿瘤的裂解物中，尽管Rac或Cdc42的水平不受影响或低于检测界限(数据未显示)，但是，GTP-结合的(即，活性形式)Rho的水平显著增加(图1C)。

已知Notch配体蛋白的重组细胞外结构域如果固定在固体表面上能够激活Notch信号传导{Varnum-Finney，2000}(还参见下图2H和2I)。我们还已经报道了在刮擦测定中，固定的DLL4重组胞外部分(rDLL4)刺激 CRC细胞的迁移。在Colon26 TetON-Aes-Flag细胞中，多西环素诱导的 Aes抑制Notch信号传导，减少在刮擦测定中的迁移{Sonoshita，2011}。在刮擦后该细胞系的迁移期间，我们发现通过引入Aes而被显著抑制的 Rho的～1.7倍的激活(图1D)。这些结果表明Notch信号传导激活Rho从而加速CRC进展。

我们已经报道CRC细胞以Notch信号传导依赖性方式侵入到基质胶 (小鼠中产生的胞外基质的混合物)中{Sonoshita，2011}。有趣的是，Rho 抑制剂C3T或Rock抑制剂Y-27632以剂量依赖性方式抑制RKO人CRC 细胞(图1E和F)以及另一种人CRC细胞系HCT116(数据未显示)的基质胶侵入和TEM。另一方面，用特异性的抑制剂NSC23766抑制Rac不影响培养物中的CRC细胞侵入(图8A)。这些结果表明通过Notch信号传导激活Rho对于CRC侵入是关键的。

为了确定Rho激活的时间表(chronology)，我们用10mM EDTA处理 RKO细胞2分钟以诱导Notch受体的构象变化，并且允许随后由γ-分泌酶在S3位点切割{Rand，2000；Tiyanont，2011}。如预测的，我们在EDTA 处理后检测到分解的受体NICD，其由γ-分泌酶抑制剂(GSI)DAPT阻断(图 8B)。与Rbpj-诱导的靶基因表达的时间表一致，我们在EDTA处理后6–12 小时观察到强Rho激活(图1G)。有趣的是，我们还注意到早在EDTA处理后5分钟的暂时和中等的Rho激活(图1G)。该早期激活在5-10分钟内达到峰值，并且在4小时内逐渐降低(图1G和H)。使用Colon26和CMT93 小鼠CRC细胞，以及使用DLD1，SW480和LS174T人CRC细胞获得相似的结果(图8C，数据未显示)。与这些结果一致，固定在培养皿表面上的rDLL4配体也激活培养的CRC细胞中的Rho(图1I)。此外，当Notch 受体表达被敲低时(图1J)或当Notch受体激活被DAPT抑制时(图1K)， Rho激活被抑制。

共同地，这些数据表明通过配体依赖性的Notch受体激活的Rho激活的两个不同阶段；早期(在数分钟之内)和晚期(>6小时)反应，其分别独立于和依赖于Rbpj介导的靶基因的转录(见下文)。

早期反应：CRC细胞中Rho的激活对于其与EC的粘附是关键的

为了起始内渗和外渗，癌细胞需要粘附到血管内衬并且通过其迁移 {Miles，2008；Weinberg，2007}。我们之前报道EC刺激毗邻的CRC细胞的Notch信号传导{Sonoshita，2011}。因此，我们假设在与EC接触后通过Notch信号传导在CRC细胞中Rho立即被激活，从而加强附着。如预期的，在铺板后15分钟在洗涤后，C3T(Rho抑制剂)或DAPT(GSI)减少保持附着于EC层的CRC的数目(图2A)。重要的是，在CRC细胞中的 RBPJ敲低(图2B)不影响早期Rho激活或与EC的粘附(图2C和2D)。一致地，甚至当敲低RBPJ时，DAPT阻止CRC细胞的EC细胞粘附(图2D)。这些结果表明，在早期Notch受体裂解激活Rho，从而促使CRC细胞与 EC以不依赖Rbpj的方式粘附。

晚期反应：Rbpj转录诱导Disabled1(DAB1/Dab1)表达并激活Rho

与早期反应不同，我们发现，晚期反应通过RBPJ-敲低被显著抑制(图 2E)。因此，我们推测Rbpj靶基因的表达对于Rho的晚期激活是必要的，并且该激活帮助CRC细胞在其初始附着到EC上之后的内渗和外渗。

最近，98种基因被报道为NICD转基因小鼠中的Rbpj靶标{Li，2012}。有趣的是，其中的3种基因在果蝇(Drosophila)中也通过Notch信号传导被诱导{Krejcí，2009}。它们是Disabledl(Dab1)(在果蝇中失效的)，Notch1 (Notch)和Hesl/5(E(spl))基因(图2F)。

我们在本研究中聚焦于DAB1，因为在脑发育过程中，Dab1增强神经元运动性{Sanada，2004，Hashimoto-Torii，2008}。我们发现人DABl 和小鼠Dab1基因都在其邻近的启动子区域中包含高亲和性Rbpj结合序列基序，如在果蝇中一样(图2G)，这表明Rbpj的进化保守的转录{Dowell， 2010}。另一方面，我们发现诱导Hes1引起CRC细胞的大量死亡(数据未显示)。

为了研究Notch受体激活对DABl表达的影响，我们将固定的rDLL4 应用到LS174T人CRC细胞，该细胞在人CRC细胞系中具有大量的DABl mRNA水平(图9)。我们发现rDLL4以剂量依赖性方式增加DABl mRNA 的表达，而DAPT对其抑制(图2H)。另外，Rbpj优先结合DABl基因启动子(图2G和2I)。NICD还富集于启动子DNA片段中，这表明Notch激活(transactivation)复合物诱导DAB1表达。使用另一种CRC细胞系 Colo205获得相似的结果，该细胞系也表达相对丰富的DABl(数据未显示)。

我们还发现在Notch信号传导被激活时的Apc/Aes小鼠中的CRC中的显著的Dab1诱导{Sonoshita，2011}，但是在Apc小鼠的腺瘤中没有发现(图2J)。总之，这些结果表明DAB1是CRC细胞中Notch转录靶标之一。

DAB1可以通过Rho激活刺激CRC侵入和转移

为了确定DAB1在CRC进展中的作用，我们将Dab1的纯合无效突变另外引入到Apc/Aes小鼠中，并且构建Apc/Aes/Dab1三重突变体小鼠。显著地，我们发现Dab1突变抑制肠肿瘤的侵入和内渗(图3A和3B)。

为了验证DAB1在CRC中的促转移作用，我们还构建了克隆LS174T 衍生物，其中DAB1表达被组成型地敲低(图3C)。将其移植到裸鼠直肠中后，我们发现，与对照细胞相比，在DAB1敲低细胞的情况下，肺转移灶的数目显著减少(图3D和3E)。另一方面，DAB1在RKO(低表达CRC 细胞系之一)(图9)中的表达增加从直肠到肺的转移(图3F，3G和3H)。

重要的是，在DAB1敲低的CRC细胞中，早期和晚期Rho激活反应都被抑制(图3I)。另一方面，单独表达DAB1足以组成型地激活Rho。Rho 的早期激活也被DAB1表达加强(图3J)。我们还注意到，在通过EDTA的 Notch激活后约4小时，在对照非沉默CRC细胞中DAB1mRNA被诱导，但是在RBPJ敲低的CRC细胞中却没有(图3K)。总之，强烈表明，在Notch 切割后的早期，内源性DAB1激活Rho，并且然后，Rbpj诱导的DAB1 有助于晚期和持久的Rho激活。这种解释与RBPJ的敲低仅减弱晚期而不是早期Rho激活的结果相符(图2C和2E)。

Dab1激活在Notch介导的Rho激活和CRC侵入中起重要作用的酪氨酸激酶Abl

在分化的小鼠嗜铬细胞瘤细胞中，DAB1被鉴定为是结合SRC家族酪氨酸激酶(包括SRC和FYN，以及Abelson(ABL))的蛋白之一{Howell， 1997}。在果蝇中，Notch受体基因(N)在轴突引导下与Abl遗传相互作用 {Giniger，1998}。酪氨酸激酶的ABL亚家族在进化上保守，在哺乳动物中包括ABL1和ABL2(也称为ARG)，并且在多种生理和病理过程(如细胞增殖和迁移)中起多效性作用{Colicelli，2010}。

因此，我们假设DAB1通过激活ABL而促进CRC转移。为了确定 ABL在内源性CRC进展中可能的作用，我们用ABL抑制剂伊马替尼(也称为Glivec{Buchdunger，2001；Sawyers，2003})处理Apc/Aes小鼠，并且发现在肿瘤尺寸或数目不改变的情况下CRC侵入的显著抑制(图4A和 4B)。一致地，敲低ABL1和/或ABL2基因(图4C，下图)显著减少RKO 细胞的基质胶侵入(图4C，上图)。并且，Rho激活被双重ABL1/ABL2敲低抑制(图4D)。类似地，伊马替尼以剂量依赖性方式阻断由EDTA诱导的侵入和Rho激活(图4E和4F)。我们还发现达沙替尼(ABL和SRC二者的双重抑制剂)也显著地抑制侵入(图10A)。尽管SRC在晚期CRC病例的亚组中被高度激活{Weinberg，2007b}，但是我们发现SRC家族抑制剂PP2 对培养物中的RKO细胞侵入仅有较小的作用(～20％)(图10A)。重要地，用HCT116细胞获得相同的结果(数据未显示)。这些结果表明ABL在 Rho激活和CRC进展中具有Notch下游的作用。

在神经元和HEK293细胞中，DAB1增强FYN的激酶活性{Arnaud， 2003；Bock，2003}。然而，在我们对CRC侵入的测定中，SRC家族抑制剂PP2仅表现出小的抑制(图10A)。因此，我们想知道DAB1是否与 ABL1B(ABL1主要的且充分表征的剪接变体{Hantschel，2004，Colicelli， 2010})相互作用从而刺激CRC侵入。

已知ABL磷酸化自身以得到最大的激酶活性{Hantschel，2004}。我们发现同时表达DAB1以剂量依赖性方式增加Tyr-磷酸化的ABL1B (pY-ABL1B)的水平(图4G；比较第4-6道)。在神经元中，Tyr-磷酸化的 DAB1(pY-DAB1)是其迁移所必需的，原因在于，迁移被5YF-DAB1突变体(其中五个Tyr残基被结构相似但是不可磷酸化的Phe替换)的表达所削弱{Sanada，2004}。在表达5YF-DAB1的CRC细胞中，我们发现pY-ABL1B 水平保持低(图4G；第7道)，这表明ABL激活依赖于pY-DAB1。我们还发现野生型DAB1在ABL1B存在下被Tyr-磷酸化，而5YF-突变体则不(图 4G；第5-7道)。可以想到的是，ABL1B直接Tyr-磷酸化DAB1，因为在小鼠肠肿瘤和培养的细胞中ABL和DAB1彼此物理相互作用(图10B和 Howell，1997)。与这一解释相一致的，在存在ABL1B的激酶-死亡(KD) 突变体的情况下，DAB1不被磷酸化(K290R；Barilá，2000)(图4G；第9-10 道)。

这些结果共同说明DAB1在体内在存在ABL的情况下被磷酸化，并且pY-DAB1作为Notch受体的下游效应子之一相互地激活ABL从而刺激 CRC侵入。我们提出ABL活性是针对CRC的恶性进展的新的治疗靶标。

TRIO RhoGEF在DAB1和ABL存在下被Tyr-磷酸化，并且促进CRC 侵入

在蝇神经元迁移中，果蝇三功能结构域(dTrio)作为dAbl的下游效应子起关键作用{Forsthoefel，2005}。TRIO属于可以激活Rho家族小GTP 酶的GEF蛋白的DBL家族，并且是其唯一携带两个GEF结构域的成员；一个用于Rac(GEF1)而另一个用于Rho(GEF2)(图5A){Debant，1996； Bateman；2001，Vigil；2010}。已经表明Trio GEF1在果蝇中激活Rac并且引起神经元迁移{Song，2012}。由于在Apc/Aes小鼠CRC中Rac保持未激活，并且其抑制对CRC侵入几乎没有影响(图8A，数据未显示)，我们聚焦于CRC侵入中通过TRIO的Rho激活。

即，我们首先敲低HCT116细胞中的TRIO mRNA表达，并且在用 EDTA激活Notch受体后确定GTP-Rho的水平。显著地，TRIO敲低引起 GTP-Rho水平和基质胶侵入能力的显著减少(图5B和5C)。我们使用RKO 细胞也获得基本上相同的结果(数据未显示)。这些结果强烈表明，在 Notch受体激活的细胞中，TRIO通过Rho激活在CRC侵入中起重要作用。

由于在果蝇S2细胞中dTrio在dAbl存在下被Tyr-磷酸化{Forsthoefel， 2005}，我们假设ABL在CRC细胞中也引起TRIO的Tyr-磷酸化，并且增加其Rho活性。如假设的，我们发现单独的ABL1B略微增加CRC细胞中的pY-TRIO水平(图5D，第3道)。有趣的是，当ABL1B与野生型 DAB1共同表达而不与5YF突变体DAB1共同表达时，pY-TRIO的水平显著增加(图5D，第4-5道)。另一方面，激酶-死亡的(KD)ABL1B突变体不能增加pY-TRIO水平(图5D，第6-7道)。这些结果共同表明TRIO 的Tyr-磷酸化依赖于ABL的激酶活性。

为了确定ABL在TRIO中特定的靶标Tyr残基，我们首先用在线 NetPhos2.0软件{Blom，1999}筛选TRIO的一级氨基酸序列。其预测所有 61个Tyr残基的磷酸化的可能性，并且鉴定出30个作为可能的候选，其具有高于0.5的阈值的得分。我们成功构建TRIO突变体，其中它们中的 18个被单独地或组合地转化为Phe(图5A中的YF突变体)。

然后，我们研究YF突变是否影响TRIO蛋白整体上的体内pY水平，并且发现，与TRIO(WT)相比，TRIO(18YFs)表现出显著减少的pY水平(图 5E，第1-2道)。尽管TRIO(7YFs-a)和TRIO(7YFs-b)与对照TRIO(WT)类似地被Tyr-磷酸化，但是在位置1990，2562，2681和2757包含另外的四个YF突变的TRIO(11YFs)具有显著减少的pY水平(图5E，第3-5道)。对于仅这另外四个酪氨酸被突变的TRIO(4YFs)突变体，我们观察到pY 水平的相似减少(图5E，第6道)。在这四个酪氨酸中，我们鉴定Y1990 和Y2681作为在ABL-DAB1存在下的磷酸化的关键靶标，因为Y1990F 和Y2681F突变体仅表现出适度的pY水平(图5F，分别为第2和4道)。

TRIO(pY2681)甚至有助于在I期和II期给具有差的预后的CRC患者分级

为了确定TRIO磷酸化的临床相关性，我们研究了在人原发性CRC 样品中Y1990和/或Y2681是否被磷酸化。为此，我们分别产生了针对 TRIO(pY1990)和TRIO(pY2681)的特异性抗体(图11)。然而，在 TRIO(pY1990)-阳性和-阴性CRC患者之间，存活率没有太多区别(p＝0.9，数据未显示)。

有趣的是，与携带TRIO(pY2681)-阴性CRC的患者相比，携带 TRIO(pY2681)-阳性CRC的患者表现出统计学显著的存活减少(包括所有期，n＝102，卡方检验中p＝0.01；图6A，左图)。当我们聚焦于I和II 期时，合并的TRIO(pY2681)-阴性CRC患者具有完全的(100％)治愈，而阳性患者在5年内表现出～20％的死亡(n＝63，p＝0.04；图6A，中图)。甚至对于单独的II期患者(n＝46)，在TRIO(pY2681)-阳性患者与-阴性亚群之间观察到相似的分布(p＝0.1；图6A，右图)。即，TRIO(pY2681)-阴性CRC患者如果在I或II期被切除后没有复发。因此，TRIO(Y2681)的磷酸化状态帮助预测患者预后，其具有的准确性大于其他生物标记物 {Salazar，2010}。

与附近的正常粘膜或淋巴样滤泡相比，CRC细胞在胞质中含有高得多的水平的TRIO(pY2681)(图6B)。奇怪地，在基质中分离的、出芽的或侵入的CRC细胞中也发现TRIO(pY2681)信号(图6C-E中的箭头)，这表明TRIO(pY2681)对于CRC侵入是关键的。事实上，TRIO(pY2681)的存在与侵入的深度(m，sm和mp vs.ss，se和si，在卡方检验中p<0.0001)和分期(0-I期vs.II-IV期，p＝0.02；0-III期vs.IV期，在卡方检验中p＝ 0.02)相关。

Aes抑制TRIO(pY2681)的磷酸化

Aes通过抑制Notch信号传导而抑制CRC进展{Sonoshita，2011}。有趣的是，AES的核表达与人CRC样品中的TRIO(pY2681)水平反相关 (在卡方检验中p<0.01，图7A中的代表性照片)。此外，我们在来自Apc/Aes 肠肿瘤的免疫沉淀的Trio中发现比来自Apc小鼠的那些更强的pY2681 信号(图7B)。因此，我们假设TRIO(Y2681)的磷酸化对于由丧失AES引起的CRC转移是关键的。由于Aes将Notch信号传导的效应子(包括 NICD，Maml和Rbpj)隔离到核病灶{Sonoshita，2011}，可预期Aes通过阻断NICD介导的早期和晚期反应而抑制TRIO(Y2681)的磷酸化。总之，这些结果表明AES在激活TRIO RhoGEF(GEF2)中具有关键作用。

TRIO(Y2681)的磷酸化刺激RhoGEF活性和CRC侵入

为了研究TRIO(pY2681)在CRC侵入中的作用，我们构建了克隆RKO 细胞，其中TRIO(WT)或不可磷酸化的TRIO(Y2681F)突变体与ABL1B 和DAB1一起以多西环素(Dox)依赖性方式同时被诱导(图7C)。有趣的是， TRIO(WT)而非TRIO(Y2681F)与ABL1B和DAB1的同时表达刺激RKO 细胞的基质胶侵入能力(图7C)。

为了评估TRIO Tyr-磷酸化对Rho激活的作用，我们使用纯化的蛋白在体外进行了RhoGEF GTP-交换测定。我们选择HEK293T而不是CRC 细胞作为产生TRIO的宿主细胞，以避免由CRC细胞中多种基因突变所致的可能混淆的结果。我们证实了从转染的细胞纯化的TRIO(WT)蛋白刺激在重组RhoA上的从GDP到GTP的交换反应，如报道一样{Debant， 1996}(图7D)。重要地，从用伊马替尼处理的转染子细胞纯化的TRIO(WT) 表现出显著减少的Rho激活能力(图7E)，这表明内源性ABL激酶对通过 TRIO的Rho激活的关键作用。显著地，TRIO(Y2681F)表现出相似地减少的GEF活性(图7E)，这表明在Y2681处的磷酸化对于其最大的GEF 活性是必需的。这些结果共同表明ABL引起TRIO在Y2681的磷酸化并且增加GTP-Rho，导致增强的CRC细胞侵入。

人癌症中的TRIO点突变刺激其RhoGEF活性

我们进一步研究了人癌症中可能的TRIO突变。在COSMIC(癌症体细胞突变目录(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer))数据库中，我们发现2％(4414中的102个)的不同类型的癌症含有141种TRIO突变。显著地，在CRC中在GEF2结构域中发现一个突变(L2044I)。我们还发现在 Ig样结构域与其之前的包含Y2681的区域中的七个突变。它们是子宫内膜癌中的E2652G，G2658S，T2695M和S2767L，乳腺癌中的N2668S，肾癌中的S2671Y，和肺癌中的G2699V(在图5A中以星形表示)。

我们构建这些TRIO的点突变体，并且检测它们的RhoGEF活性。有趣的是，我们发现，与TRIO(WT)相比，TRIO(G2699V)突变体更能够激活Rho，尽管其不影响Rac活性(图7F，数据未显示)。奇怪的是，在存在 ABL和DAB1时，TRIO(G2699V)比野生型对Tyr-磷酸化更敏感(图7G)。总之，这些结果表明TRIO突变可以通过加强其通过DAB1-ABL的Tyr- 磷酸化而激活RhoGEF能力，导致人癌症亚组中的进展。

多种类型的癌症发现TRIO(pY2681)

我们进一步研究TRIO的Y2681是否不仅在原发性CRC中而且也在其转移中以及在其他类型的癌症中被磷酸化。结果，我们发现 TRIO(pY2681)存在于转移的细胞中，并且还存在于多种类型的癌症中(图 12，表2)。这些结果表明这种转移机制在多种类型的癌症中是关键的。

表2保留TRIO(pY2681)的器官

肾上腺
	血液(淋巴瘤)
骨
	脑
乳腺
	结肠直肠
子宫内膜
	食管
胆囊
	肾
喉
	肝
肺
	口腔
卵巢
	胰腺

前列腺
	唾液腺
皮肤
	小肠(GIST)
软组织
	胃
睾丸
	甲状腺
膀胱
	子宫颈

表现出与TRIO(pY2681)强预后相关性的癌症类型

关于CRC，我们已经将我们的研究扩展到更多数量的病例(图13)。利用合并的所有分期的总计339个病例，我们已经发现TRIO(pY2681)- 和TRIO(pY2681)+患者之间在其预后方面的统计学显著的差异(P <0.001)。重要地，对于II期患者(n＝115)，阴性患者的五年存活率结果为～100％，而对于IV期患者(n＝57)，阴性患者的存活率为～50％，阳性患者的存活率仅为～10％。

此外，肺腺癌患者(n＝214)在TRIO(pY2681)-阴性和-阳性之间在其预后方面表现出显著的差异(P＝0.002)(图14)。

同样地，(I–III)期胃癌患者在TRIO(pY2681)-阴性和-阳性之间在其预后方面表现出显著的差异(P<0.001)(图15)。

另外，初步的数据(n＝20)已经表明强的倾向性，即胰腺癌患者如果其Trio(pY2681)是阴性的(与阳性患者相比)则显示更好的存活(图16)。该倾向性的统计学显著性几乎与另一种胰腺癌标记物Smad4的统计学显著性相同，尽管Trio(pY2681)和Smad4是不相关的独立标记物。

参考文献(所有的参考文献通过引用结合在本文中)

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Claims

1.能够检测从受试者获得的样品中TRIO的2681位处的酪氨酸残基的磷酸化的试剂用于制备诊断剂的用途，所述诊断剂用于确定所述受试者中癌症预后的方法，其中不存在磷酸化表示良好的癌症预后，其中TRIO的2681位处的酪氨酸残基是指与SEQ ID NO:1的2681位处的酪氨酸残基相对应的天然TRIO中的酪氨酸残基，其中所述样品是由原发性肿瘤获得的癌性组织，并且其中所述癌症选自结直肠癌，肺癌，胰腺癌和胃癌，其中所述能够检测TRIO的2681位处的酪氨酸残基的磷酸化的试剂是抗体，所述抗体与其中对应于SEQ ID NO:1的2681位处的酪氨酸残基的酪氨酸残基被磷酸化的TRIO结合，但是不与其中对应于SEQID NO:1的2681位处的酪氨酸残基的酪氨酸残基未被磷酸化的TRIO结合。

2.权利要求1的用途，其中所述样品是通过手术切除由原发性肿瘤获得的癌性组织。

3.权利要求2的用途，其中不存在磷酸化表示在手术切除所述原发性肿瘤后长期存活的可能性。

4.权利要求2的用途，其中存在磷酸化表示在手术切除所述原发性肿瘤后辅助治疗的必要性。

5.权利要求1-4中任一项的用途，其中通过免疫组织化学测定、蛋白质印迹分析或ELISA来检测磷酸化。

6.权利要求5的用途，其中所述癌症选自由结直肠癌和胃癌组成的组。

7.权利要求6的用途，其中所述癌症是结直肠癌。

8.权利要求7的用途，其中所述癌症是I期或II期结直肠癌。

9.权利要求8的用途，其中所述癌症是II期结直肠癌。

10.一种抗体，所述抗体与其中对应于SEQ ID NO:1的2681位处的酪氨酸残基的酪氨酸残基被磷酸化的TRIO结合，但是不与其中对应于SEQ ID NO:1的2681位处的酪氨酸残基的酪氨酸残基未被磷酸化的TRIO结合。

11.用于确定癌症预后的诊断组合物，所述组合物包含权利要求10的抗体。

12.权利要求11的诊断组合物，其中所述癌症选自由下述组成的组：结直肠癌，肺癌，胰腺癌和胃癌。

13.权利要求12的诊断组合物，其中所述癌症选自由结直肠癌和胃癌组成的组。

14.权利要求13的诊断组合物，其中所述癌症是结直肠癌。

15.权利要求14的诊断组合物，其中所述癌症是I期或II期结直肠癌。

16.权利要求15的诊断组合物，其中所述癌症是II期结直肠癌。

17.用于确定癌症预后的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求10的抗体。

18.权利要求17的试剂盒，其中所述癌症选自由下述组成的组：结直肠癌，肺癌，胰腺癌和胃癌。

19.权利要求18的试剂盒，其中所述癌症选自由结直肠癌和胃癌组成的组。

20.权利要求19的试剂盒，其中所述癌症是结直肠癌。

21.权利要求20的试剂盒，其中所述癌症是I期或II期结直肠癌。

22.权利要求21的试剂盒，其中所述癌症是II期结直肠癌。

23.权利要求10的抗体用于制备用于确定癌症预后的诊断组合物或试剂盒的用途，其中所述癌症选自结直肠癌，肺癌，胰腺癌和胃癌。

24.权利要求23的用途，其中所述癌症选自由结直肠癌和胃癌组成的组。

25.权利要求24的用途，其中所述癌症是结直肠癌。

26.权利要求25的用途，其中所述癌症是I期或II期结直肠癌。

27.权利要求26的用途，其中所述癌症是II期结直肠癌。