CN105263606B - 具有贮存稳定性、用于快速浇制、印迹和成像的聚丙烯酰胺凝胶 - Google Patents

具有贮存稳定性、用于快速浇制、印迹和成像的聚丙烯酰胺凝胶 Download PDF

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Abstract

提供一种用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的手工浇制凝胶系统。在一些实施方式中，所述系统包含：刚性模具，其包含所述聚丙烯酰胺凝胶；和所述聚丙烯酰胺凝胶，其包含丙烯酰胺、三乙醇胺，选自甘氨酸和N‑三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)的两性电解质，以及由pKa在8.3～9.6范围内的氨基酸组成的共轭两性电解质。优点包括延长凝胶在使用前贮存的时间(例如在底部敞开(bottom‑open)的玻璃盒中贮存长达30天，或采用密封塑料盒贮存甚至更久)而不劣化或几乎不劣化的能力，以比采用典型手工浇制凝胶的完成时间更快地运行电泳实验的能力，比采用典型手工浇制凝胶更快地将蛋白质从凝胶印迹或转移至膜的能力，和无需染色(即以“免染”方式)即可使凝胶成像的能力。

Description

具有贮存稳定性、用于快速浇制、印迹和成像的聚丙烯酰胺 凝胶
相关申请的交叉参考
本申请要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/793,884的优先权，该文通过引用纳入本文。
发明背景
聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)广泛用于生物技术实验室，用于处理生物样品，以分离该样品中存在的生物分子以供于鉴定，并且在一些情况中，用于定量分离的物质。蛋白质混合物、肽混合物，以及DNA、RNA和DNA与RNA的片段的混合物都可在聚丙烯酰胺凝胶上分离。对于蛋白质混合物，PAGE的具体应用形式是SDS-PAGE，其中在样品中含有十二烷基硫酸钠(SDS)。所有蛋白质均由相连的氨基酸残基组成，并且各蛋白质自然折叠成三维形状，这是每个个体蛋白质的特征和特点。因此，氨基酸序列和折叠的蛋白质的形状在蛋白质之间彼此不同。然而，在SDS的存在下，蛋白质经历变性，即，它们会展开，进而失去其特征三维形状。因此，所有变性的蛋白质具有相同的形状，并且能在SDS-PAGE中仅依赖于其分子量而被分离。由于蛋白质在氨基酸的数量和种类上均有差异，不同的蛋白质通常具有不同的分子量，并且常见蛋白质的分子量范围较大。
然而，某些蛋白质的分子量极为接近，这使其难以在SDS-PAGE中分离。为了分离所述蛋白质，或使它们的分离最优化，通常在不连续的凝胶，即，由在“分离(resolving)”(还称作“分离(separating)”)凝胶之上浇制的“积层(stacking)”或“积层(stacker)”凝胶组成的组合凝胶中进行SDS-PAGE，其中所述积层凝胶具有较低的聚丙烯酰胺浓度，进而具有较高的多孔性。积层凝胶和分离凝胶在某一界面接触，在该界面处发生多孔性的梯式(stepwise)变化，并且在某些情况中，该界面处还包含pH从积层凝胶中的约中性或略酸性(pH 6.6～7.0)到分离凝胶中的碱性(pH 8.6～9.0)的梯式变化。与这些不连续构成无关，溶质、缓冲溶液和和电流能够自由穿过该界面，从所述凝胶的一部分到另一部分。该组合凝胶以垂直位置取向，其中积层凝胶处于分离凝胶上方，而样品初始时被置于积层凝胶的顶部边缘。然后施加合适极化的电场，以使样品中的蛋白质穿过积层凝胶朝向所述界面向下迁移，并进入分离凝胶。在迁移的初始阶段，蛋白质在所述界面处汇集在单一明晰条带中。然后，所述蛋白质继续其迁移，并进入分离凝胶，此时所述单一条带分离成代表个体蛋白质的多个条带。丙烯酰胺在分离凝胶中的百分比可变化，以实现蛋白质的最优分离。然而，一般而言，较大蛋白质在具有相对较低的百分比的分离凝胶中最易分离，而较小蛋白质在具有高百分比的分离凝胶中最易分离。
可是，凝胶的浇制是耗时且耗力的过程，因而，研究者购买预形成凝胶而不是在使用前浇制凝胶的现象变得越发普遍。购得的凝胶通常称为“预浇制凝胶”，而实验室中制备的那些称为“手工浇制凝胶”。预浇制凝胶的生产商已开发出在多个方面优于手工浇制凝胶的凝胶。例如，在贮存数天后，聚丙烯酰胺凝胶中的分辨力趋于下降，因此，通常在即将使用前不久制备手工浇制凝胶。生产商们通过配制预浇制凝胶而解决了该问题，将预浇制凝胶的寿命延长至一年或更久。另一个难点关于凝胶跑动时的电场强度，以及完成跑动所需的时间长度。手工浇制凝胶通常在低电场强度下跑动，以避免凝胶在跑动过程中升温，因为升温会造成实验中的失真，但是电场强度越低，实现蛋白质分离所需的时间越长。生产商们已解决了该问题，通过配制能够承受高场强度而不显示因升温所致的异常现象的预浇制凝胶。能够解决这些问题的凝胶制剂的公开内容可见于：Rowell等，美国专利号US 8,282,800B2(2012年10月9日)，和Petersen等，美国授权前申请号US 2010/0187114 A1(2012年7月29日)。
一旦凝胶经跑动，科研人员通常会将该凝胶染色以观察在该凝胶中分离的蛋白质，或将在该凝胶中分离的蛋白质条带转移至膜，供于进一步处理或鉴定。凝胶的染色通常通过施加化学染剂或染料来进行，所述化学染剂或染料通常是危险化学品。染色也是耗时过程。预浇制凝胶的生产商们已通过配制能够使蛋白质不用染剂或染料即可被观察的凝胶来解决了该问题，由此免去了危险化学品的使用，并缩短了检测蛋白质所需的时间。例如，生物辐射实验室公司(Bio-Rad Laboratories)(加利福尼亚州赫尔克里斯)出售Stain-FreeTM凝胶系统。将蛋白质转移至膜的方法被称为“western印迹”，并且其所涉及的转移以这样的方式进行：保持个体蛋白质的分离状况，具体而言，保持个体蛋白质条带在凝胶中的相对位置。所述转移允许科研人员进行在凝胶上无法进行的分析。所述分析包括，免疫试验，例如，由于免疫试验中所用的抗体太大，无法有效进入凝胶，但能够容易地接触膜上的蛋白质。所有蛋白质，包括在免染(Stain-Free)凝胶中的那些，均可被印迹至膜上，进一步为科研人员提供了便利，并加速了实验进程。一些预浇制凝胶，例如生物辐射实验室公司的TGX和TGX免染凝胶允许蛋白质从凝胶至膜的更快速转移。
尽管预浇制凝胶具有优势，但其也有缺点。一个缺点是，它们比手工浇制凝胶更贵，因为生产商会将制造、贮存和分配所述凝胶的成本传递给用户。第二个缺点是，用户会受限于生产商能够提供的凝胶类型。采用手工浇制凝胶，用户能够通过亲自选择特定组成的单体溶液来个性化地制备分离凝胶，以达具体实验的特殊需求或偏好，但是，采用预浇制凝胶通常无法实现这样的灵活性。因此，不论其益处，手工浇制凝胶通常缺乏生产商制备的预浇制凝胶的多种所需性质，包括如下能力：贮存凝胶以供未来使用，使凝胶快速跑动，无需染色步骤即可观察蛋白质，和将蛋白质条带从凝胶快速转移至膜，以在无需染色的情况下即可确认蛋白质成功地转移到膜上。
发明内容
本文公开了一种用于手工浇制法的手工浇制凝胶系统和储液，所述方法和溶液均提供目前仅能在预浇制凝胶获得的优点这些优点包括但不限于，延长凝胶在使用前贮存的时间长度(例如在底部敞开(bottom-open)的玻璃盒中贮存长达30天，或采用密封塑料盒贮存甚至更久)而不劣化或几乎不劣化的能力，以比采用典型手工浇制凝胶的完成时间更快地运行电泳实验的能力，比采用典型手工浇制凝胶更快地将蛋白质从凝胶转移或印迹至膜的能力，和，无需染色(即以“免染”方式)即可使凝胶成像的能力。储液具有另外的优点：相对于用于制备手工浇制凝胶所用的一些储液而言，该溶液本身能够稳定延长的时间长度。
在一些实施方式中，提供用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的手工浇制凝胶系统。在一些实施方式中，所述系统包含：刚性模具，其包含所述聚丙烯酰胺凝胶；和所述聚丙烯酰胺凝胶，其包含丙烯酰胺、三乙醇胺、选自甘氨酸和N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)的两性电解质、以及由pKa在8.3～9.6范围内的氨基酸组成的共轭两性电解质。
在一些实施方式中，所述系统能够在所述聚丙烯酰胺凝胶已于4C°贮存长达30天后分离蛋白质样品。在一些实施方式中，所述系统能够在短至15分钟的时间内进行电泳，并且能够在短至3分钟的时间内通过印迹将蛋白质基本完全转移至硝化纤维素上。
在一些实施方式中，所述凝胶还包含下述的一种或多种物质：甘油、Tris和在紫外光辐照后与色氨酸残基反应以形成荧光化合物的卤素取代的化合物。在一些实施方式中，所述卤素取代的化合物是三氯烷烃。在一些实施方式中，所述三氯烷烃选自下组：氯仿、三氯乙酸和三氯乙醇，或其混合物。
在一些实施方式中，所述凝胶是不连续的。在一些实施方式中，所述凝胶是连续的。
在一些实施方式中，所述刚性模具包含两块玻璃板，所述凝胶处于所述板之间。在一些实施方式中，所述刚性模具包含塑料盒，所述塑料盒包含其间具有凝胶的两块板。
在一些实施方式中，所述共轭两性电解质是天冬酰胺、牛磺酸、苏氨酸、丝氨酸和组氨酸。
还提供一种如上所述或如本文他处所述制备凝胶系统的方法。在一些实施方式中，所述方法包括：配制(forming)包含如下组分的混合物：丙烯酰胺、聚合化催化剂、三乙醇胺、选自甘氨酸和N-三(羟甲基)甲基甘氨酸的两性电解质、和由pKa在8.3～9.6范围内的氨基酸组成的共轭两性电解质；将所述混合物添加至模具；和使所述混合物在足以生成所述聚丙烯酰胺凝胶的条件下在模具中孵育。
在一些实施方式中，所述凝胶是不连续的，并且所述方法还包括在所述聚丙烯酰胺凝胶上制备积层凝胶。在一些实施方式中，在所述配制之前，形成包含丙烯酰胺/二丙烯酰胺的溶液，并且形成包含三乙醇胺、所述两性电解质，和所述共轭两性电解质的分离溶液，然后将(i)包含丙烯酰胺/二丙烯酰胺的溶液和(ii)该分离溶液合并不超过24小时，然后再进行所述配置。
在一些实施方式中，(i)包含丙烯酰胺/二丙烯酰胺的溶液和(ii)所述分离溶液在合并之前分开贮存至少7天。
在一些实施方式中，所述方法还包括在生成所述聚丙烯酰胺凝胶之后至少7、14、21或28天采用所述聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。
还提供用于配制所述聚丙烯酰胺凝胶的试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒包含：第一容器，其包括含有丙烯酰胺和二丙烯酰胺的溶液；和，第二容器，其包含三乙醇胺、选自甘氨酸和N-三(羟甲基)甲基甘氨酸的两性电解质、和由pKa在8.3～9.6范围内的氨基酸组成的共轭两性电解质。
在一些实施方式中，所述凝胶还包含下述的一种或多种物质：甘油、Tris和在紫外光辐照后与色氨酸残基反应以形成荧光化合物的卤素取代的化合物。在一些实施方式中，所述共轭两性电解质是天冬酰胺、牛磺酸、苏氨酸、丝氨酸和组氨酸。在一些实施方式中，所述卤素取代的化合物是三氯烷烃。在一些实施方式中，所述三氯烷烃选自下组：氯仿、三氯乙酸和三氯乙醇，或其混合物。在一些实施方式中，所述第二容器中的三乙醇胺是10-250mM，所述第二容器中的两性电解质是50-500mM，并且所述第二容器中的共轭两性电解质是10-500mM。在一些实施方式中，所述凝胶还包含Tris和/或乙醇酸。
其它目的、特征和优点将随下述说明而得以显明。
发明详述
I.手工浇制凝胶
如上所述，提供手工浇制凝胶和包含所述凝胶的系统。本文所述的手工浇制凝胶可以是连续的(即，仅包含分离部分的凝胶)或不连续的(即，包含积层部分和分离部分的凝胶)。在一些实施方式中，所述凝胶可在使用之前贮存相当长的时间(例如，超过7、14、21或28天)。在一些实施方式中，所述凝胶能够在短至15分钟的时间内完成电泳(例如，由染料前端跑至该凝胶底部计)，并且在一些实施方式中，能够在Bio-RadTurboTM转移系统中于短至3分钟的时间内，或在标准罐式印迹装置中于15分钟内，通过印迹将蛋白质基本完全转移至硝化纤维素或PVDF膜。在一些实施方式中，所述凝胶能够如上所述长期贮存，能够进行快速电泳，并在印迹过程中快速转移蛋白质。
用于本发明实践的聚丙烯酰胺凝胶通过如下方式形成：根据本领域熟知的方法，在聚合化催化剂的存在下，使丙烯酰胺单体和丙烯酰胺交联剂聚合化。术语“丙烯酰胺交联剂”指的是与丙烯酰胺单体或聚丙烯酰胺链反应以在所述链之间产生交联的分子。可采用本领域已知的丙烯酰胺交联剂；一种主要且广泛使用的丙烯酰胺交联剂是N,N'-亚甲基-二丙烯酰胺，也称为“二丙烯酰胺(bis-acrylamide)”或简称为“bis.”。其它丙烯酰胺交联剂有：二丙烯酸乙二醇酯(ED)、二烯丙基酒石二酰胺(DATD)，和二羟乙烯二丙烯酰胺(DHEBA)。
所述凝胶的多孔性可广泛变化。在制备不连续的凝胶的情况中，分离凝胶的多孔性一般低于积层凝胶。所述多孔性可通过单体溶液中单体和交联剂的浓度来确定，并且，如果制备的是不连续的凝胶，为获得所述凝胶之间的多孔不连续性，积层凝胶单体溶液的单体/交联剂浓度(即，即合并的单体和交联剂的两者的浓度)通常比分离凝胶单体溶液中的单体/交联剂浓度低至少约2.0体积百分数。在某些实施方式中，该浓度差异将在约2体积％～约20体积％范围内，并且在许多情况中，在约4体积％～约10体积％范围内。根据本领域中的常见用法，总单体(即，丙烯酰胺+交联剂)浓度以重量百分数表示，并由符号T代表，而交联剂与总单体的比例同样地以重量百分数表示，并且由符号C代表。除了积层凝胶和分离凝胶之间的差异之外，T和C的值并不重要，并且可广泛变化。在大多数应用中，然而，T的范围在分离凝胶单体溶液中是约8％～约40％，且更通常是约10％～约20％，而在积层凝胶单体溶液中是约4％～约8％，且更通常是约4％～约6％。两种溶液中的C的值可以相同，或者一种溶液中的C值大于另一种溶液中的C值。在大多数应用中，C的范围是约2％～约10％，优选是约2.5％～约5％。两种单体溶液通常会包含聚合化催化剂，而所述催化剂的示例有：过硫酸铵(APS)、N,N'-四亚甲基乙二胺(TEMED)、核黄素，和β-二甲氨基丙腈，其均以本领域技术人员已知的催化量使用。典型的催化剂浓度是0.3～3.0μg/mL的单体溶液，并且常见示例是APS和TEMED的组合，其各自浓度处于该范围内。例如，可在20mL体积的单体溶液中采用10μL的TEMED和100μL的10％(以重量计)APS。若制备的是连续凝胶，所述凝胶通常将具有上文关于分离凝胶所述的性质。
连续凝胶可通过在容器中浇制凝胶来形成。不连续的凝胶可通过在常用凝胶浇制容器中使两种单体溶液聚合化来形成，并且所述聚合化可依次或同时进行。因此，可在将积层凝胶单体溶液置于分离凝胶上方之前，使分离凝胶中的单体部分或完全聚合化，但通过使两种凝胶同时聚合化，可节省时间并且不会显著损失所述界面处梯式多孔性变化的清晰度。因此，可在分离凝胶单体已发生充分聚合化之前，事实上是在将分离凝胶单体溶液置于容器中之后立即将积层凝胶单体溶液置于分离凝胶单体溶液上方的容器中。如果想要使同时分离凝胶和积层凝胶同时聚合化，一般包含甘油或蔗糖以增强密度差异并防止混合。或者，如果想要先使分离凝胶聚合化，可以在分离凝胶聚合化时铺上一层水或醇以防止其暴露至空气。在分离凝胶聚合化之后，将所述水或醇移出，然后将积层凝胶溶液置于聚合化的分离凝胶顶部。
除丙烯酰胺以外，本文所述的手工浇制凝胶包含三乙醇胺、两性电解质，和共轭两性电解质。在其它属性中，三乙醇胺增加凝胶对水解的抗性。这些溶液中的三乙醇胺浓度可变化，但在大多数情况中，在如下浓度范围内将获得最佳结果：约0.01mol/L(1.5重量％)～约0.25mol/L(37.3重量％)，例如，约0.05mol/L(50mM)～约0.2mol/L(200mM)，或约0.075mol/L(75mM)～约0.15mol/L(150mM)。
所述手工浇制凝胶还将包含一种或多种两性电解质和一种或多种共轭两性电解质。如果制备不连续的凝胶，分离凝胶单体溶液，以及在许多情况中积层凝胶单体溶液和分离凝胶单体溶液两者，包含一种或多种两性电解质。示例性的两性电解质包括，例如，甘氨酸和N-三(羟甲基)甲基甘氨酸。合适的共轭两性电解质是pKa在8.3～9.6范围内的那些，并且通常是氨基酸。共轭两性电解质的示例有：天冬酰胺、牛磺酸(考虑用于本申请目的的氨基酸)、苏氨酸、丝氨酸和组氨酸。所述两性电解质能以，例如，约0.05mol/L(50mM)～约0.5mol/L(500mM)范围内的浓度存在，并且所述共轭两性电解质能相对于所述两性电解质以如下比例存在，例如，约0.1摩尔百分数～约65摩尔百分数，例如，约20摩尔百分数～约60摩尔百分数。(摩尔百分数表示本文所用的共轭两性电解质相对于两性电解质的比例，表示为共轭两性电解质的摩尔数除以两性电解质和共轭两性电解质的摩尔总数，再乘以100)。在大多数情况中，所述共轭两性电解质的浓度将是约100mM～约500mM，具体而言是约200mM～约350mM。
任选地，所述手工浇制凝胶还可包含一种或多种卤素取代的化合物，其在紫外光辐照后与色氨酸残基反应以形成荧光化合物。卤素取代的化合物的纳入允许对凝胶中的蛋白质进行快速检测而无需后续染色步骤。如果所述凝胶是不连续的凝胶，至少分离凝胶可包含所述卤素取代的化合物。卤素取代的化合物的示例由Edwards等公开于美国专利号US7,569,103 B2(2009年8月4日)和US 8,007,646 B2(2011年8月30日)。这些参考文献引用了色氨酸的吲哚部分和不同的卤素取代的有机化合物(特别提及氯仿、三氯乙醇和三氯乙酸)之间的紫外光诱导的反应，产生以可见范围内的波长发光的荧光化合物。其它公开内容可见于与本申请共有的如下美国临时专利申请：Paulus等发明人于2012年4月27日提交的临时专利申请号61/639,692,“Stain-Free Total Protein quantification of ComplexSamples From Diverse Sources(不同来源的复杂样品的免染总蛋白定量)”，和Short等发明人于2012年4约27日提交的临时专利申请号61/639,686,“Stain-Free Technology forWestern Blot Total Normalization(用于Western印迹总标准化的免染技术)”。一旦所述凝胶中的分离完成，即将该凝胶暴露至紫外光，并且检测并定量个体蛋白质条带所发的光。
可采用能参与与色氨酸的化学反应的任何卤素取代的有机化合物，从而形成在暴露至激发光后发出荧光的产物。特别感兴趣的卤代有机化合物是三卤代化合物，例如，三氯化合物和分子量为200或更低的那些。三卤代脂肪醇、三卤代脂肪酸、三卤代脂肪胺和三卤代链烷均有用。特定示例为：氯仿、三氯乙酸和三氯乙醇。卤素取代的有机化合物可单独使用或联用。
溶液中溶剂的选择和卤代化合物的浓度可广泛变化并可易于依据最终产生的信号强度进行优化。通常在所述凝胶中采用约0.2％～约2.0％的卤素取代的化合物，以及在一些实施方式中约0.1％～约0.5％(以体积计)来获得有效和高效的结果。
在某些实施方式中，将弱酸或两种或更多种弱酸的组合纳入所述凝胶溶液(在不连续的凝胶的情况中，一种或两种单体溶液)。示例性的弱酸包括柠檬酸、乙醇酸、马来酸、磷酸、乙酸和硼酸。当纳入所述酸时，在一些实施方式中，其浓度将在如下范围内：约0.01mol/L(10mM)～约0.50mol/L(500mM)，例如，约0.03mol/L(30mM)～约0.10mol/L(100mM)。另一种任选的添加剂是用于进一步分离条带的中性盐。合适的的盐的示例有：氯化钠、硫酸钠、磷酸钠、氯化钾，和磷酸钾。若存在，所述中性盐的浓度在一些实施方式中将在如下范围内：约0.01mol/L(10mM)～约0.50mol/L(500mM)，例如，约0.03mol/L(30mM)～约0.10mol/L(100mM)。如在典型的聚丙烯酰胺凝胶制备中，可用合适的酸将单体溶液的pH调节至所需范围，其示例有：盐酸、硫酸、乙酸、硼酸和磷酸。按需要，可将pH调节至如下范围内的值：6.4～9.0。在一些情况中，优选的pH范围是6.4～7.0。
在一些实施方式中，所述凝胶溶液还包含缓冲剂三(羟基甲基)氨基甲烷(“Tris”)和二(2-羟基乙基)氨基-三(羟基甲基)甲烷(“Bis-Tris”)中的一种或两种。在其它实施方式中，所述组分不存在。根据配方中所用的其它组成成分，Tris或Bis-Tris的浓度可变化，并且在一些实施方式中是约0.05mM～约200mM。
在涉及不连续的凝胶的某些实施方式中，在分离凝胶单体溶液中纳入提高粘度的添加剂，以提高将积层凝胶单体溶液在分离凝胶单体溶液上方分层的容易程度，并由此允许这两种溶液在凝胶浇制容器中定位，使溶液的混合现象(若出现)最小化。因此，可用分离凝胶单体溶液部分填充该容器作为第一步骤，然后将积层凝胶单体溶液置于该容器中的分离凝胶单体溶液上方。所述添加剂的示例有：甘油和各种糖，其一个示例是蔗糖。所述添加剂可同时存在于两种单体溶液中，但其益处可通过仅将其纳入分离凝胶单体溶液来实现，并且在许多情况中，这将是添加剂的最有效的用法。不论添加剂是仅存在于分离凝胶单体溶液中还是被纳入两种单体溶液，各溶液中的添加剂的量可广泛变化，并且能够在宽浓度范围内获得益处，改善溶液分层的容易程度而不将其混合在一起。然而，在大多数情况中，最佳结果将如下获得：使其中采用甘油或蔗糖的溶液的甘油或蔗糖的浓度处于约5重量％～约20重量％，或可能更常用的是：约5重量％～约15重量％。
如上所述，在一些实施方式中，提供一种手工浇制凝胶系统。例如，所述系统可包含容器内的本文所述的凝胶。该凝胶浇制容器可具有任何传统形状，和已知用作电泳凝胶的尺寸。所述容器可以是，例如，用于单一样品的一维分离的管，或板层凝胶容器或盒(例如，包含两块塑料、玻璃或其它材料的板，所述凝胶定位于所述板之间)，任选地用于多种样品在平行泳道中的电泳。板层凝胶盒的描述可广泛见于专利文献，例如，Van Atta,D.L.，美国专利号6,093,301(2000年7月25日)；Perez,E.等，美国专利号6,162,342(2000年12月19日)；Fernwood,G.等，美国专利号6,451,193(2002年9月17日)；和Latham,M.，美国专利号7,588,673(2009年9月15日)。还可参见，David Garfin，Electrophoretic Methods(《电泳方法》)，学术出版社公司(Academic Press，Inc.)。
II.试剂盒
还提供用于手工浇制本文所述的凝胶(连续或不连续的)的试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒包括含有所述凝胶的不同组分的至少两个容器，将其合并且随后添加聚合化试剂(若不存在于所述容器中的溶液中的至少一种中)时获得所需凝胶。因此，下方所列的组分浓度意指储液浓度。所述储液将用丙烯酰胺单体稀释或与之合并以达到最终工作浓度。
在涉及单一单体储液的情况中，所述溶液可包含待与三乙醇胺-两性电解质-共轭两性电解质缓冲溶液联用的丙烯酰胺单体。在一些实施方式中，所述溶液包含10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％，例如，约10-40％或25-35％单体，其中单体:交联剂的比例为37.5:1。在一些实施方式中，第二储液(待用丙烯酰胺单体稀释/与之合并以达到最终工作浓度)包含浓度为10-250mM(例如，约10、25、50、75、100、150、200、250mM)的三乙醇胺，浓度为50-500mM(例如，约50、100、150、200、250、300、500mM)的两性电解质(例如，甘氨酸或N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)，和第二容器中的浓度为10-500mM(例如，约10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500mM)的共轭两性电解质(例如，天冬酰胺、牛磺酸、苏氨酸、丝氨酸或组氨酸)。在一些实施方式中，所述第二储液还包含Tris或Tris-HCl(例如，在0.05mM～200mM范围内)中的一种或多种，和乙醇酸(例如，在10mM～500mM范围内)，例如，在6.0～7.0的pH范围内。所述第二储液还可包含，例如，0.2％～2％范围内的卤素取代的化合物(例如，氯仿、三氯乙酸或三氯乙醇)。
为形成凝胶溶液，可将所述单体溶液与三乙醇胺-两性-共轭两性电解质缓冲溶液和水以合适的比例合并，以获得所需百分比的凝胶。例如，对于不连续的凝胶，分离凝胶溶液的百分比凝胶相对较高，而积层溶液的百分比凝胶较低。所述积层凝胶溶液可以是，例如4％单体溶液，而所述分离凝胶可以是，例如7.5％、10％、12％、18％或20％单体溶液。
此外，在需要不连续的凝胶的情况中，用于制备所述两部分凝胶的储液可对于两种凝胶部分各自包含分开的水性单体溶液(即，各溶液同时包含单体和交联剂)，其单体和交联剂的总量不同，其中至少所述分离凝胶单体溶液包含一些或全部的上述其它组分。或者，单一单体储液可通过如下方式使用：对于两种凝胶部分，以不同比例将所述储液与缓冲溶液合并。当对两种凝胶采用分开的单体溶液时，所述分离凝胶溶液可例如包含甘油。在制备所述凝胶时待与分离凝胶单体溶液合并的分开的凝胶调节溶液，可以是包含三乙醇胺和共轭两性电解质(例如，牛磺酸)以及任何上述其它组分的溶液。这些储液中的所有组分的浓度可以与上述浓度和浓度范围相同。可使聚合化催化剂或催化剂保持隔开，直至待浇制所述凝胶时。当用户准备好手工浇制所述凝胶时，可将所述分离凝胶单体溶液和所述凝胶调节溶液的部分混合在一起，以形成第一混合物，并将所述积层凝胶单体溶液和所述调节溶液的第二部分混合在一起，以形成第二混合物。可将所述催化剂添加至所述第一和第二混合物。可将由此制备的最终混合物置于凝胶浇制容器中，其中首先添加第一混合物(用于分离凝胶)。
在所附的权利要求书中，术语“一个”或“一种”是用来表示“一个(种)或多个(种)”。当术语“包含”及其各种变体例如“包括”和“含有”位于叙述步骤或要素之前的时候，是用来表示添加其它的步骤或要素是任选的，并且是非排它性的。本说明书中引用的所有专利、专利申请和其它公开的参考材料都通过引用全文结合入本文中。当本说明书的内容与本发明引用的任何参考材料以及任何现有技术之间存在矛盾之处的时候，以本说明书为准。所述矛盾之处包括现有技术对词或词组的定义与本说明书对相同的词或词组明确给出的定义之间的差异。

Claims (15)

1.一种制备聚丙烯酰胺凝胶的方法，所述方法包括：
提供第一溶液和第二溶液，所述第一溶液包含丙烯酰胺/二丙烯酰胺，所述第二溶液包含三乙醇胺、两性电解质和共轭两性电解质；所述两性电解质选自甘氨酸和N-三(羟甲基)甲基甘氨酸；所述共轭两性电解质是由pKa在8.3～9.6范围内的氨基酸组成的；所述第一溶液和第二溶液分别储存至少7天；
形成所述第一溶液、第二溶液和聚合催化剂的混合物；
将所述混合物加入模具；和
在足以生成所述聚丙烯酰胺凝胶的条件下于所述模具中孵育所述混合物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝胶是不连续的，并且所述方法还包括：在所述聚丙烯酰胺凝胶上制备积层凝胶。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在配制之前不超过24小时内，形成所述混合物。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在聚丙烯酰胺凝胶生成之后至少7、14、21或28天，采用所述聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝胶还包含下述一种或多种物质：甘油、Tris和在紫外光辐照后与色氨酸残基反应形成荧光化合物的卤素取代的化合物。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共轭两性电解质是天冬酰胺、牛磺酸、苏氨酸、丝氨酸和组氨酸。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述卤素取代的化合物是三氯烷烃。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述卤素取代的化合物选自下组：氯仿、三氯乙酸和三氯乙醇，或其混合物。
9.一种用于配制聚丙烯酰胺凝胶的试剂盒，所述试剂盒包含：
第一容器，其包含含有丙烯酰胺和二丙烯酰胺的溶液；和
第二容器，其包含三乙醇胺、选自甘氨酸和N-三(羟甲基)甲基甘氨酸的两性电解质、和由pKa在8.3～9.6范围内的氨基酸组成的共轭两性电解质。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述凝胶还包含下述一种或多种物质：甘油、Tris和在紫外光辐照后与色氨酸残基反应形成荧光化合物的卤素取代的化合物。
11.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述共轭两性电解质是天冬酰胺、牛磺酸、苏氨酸、丝氨酸和组氨酸。
12.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述卤素取代的化合物是三氯烷烃。
13.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述卤素取代的化合物选自下组：氯仿、三氯乙酸和三氯乙醇，或其混合物。
14.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述第二容器中的三乙醇胺是10-250mM，所述第二容器中的所述两性电解质是50-500mM，并且所述第二容器中的所述共轭两性电解质是10-500mM。
15.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含Tris和/或乙醇酸。
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