CN105255814B - 一种用于微骨折手术的软骨诱导基质的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于微骨折手术的软骨诱导基质及其制备方法，软骨诱导基质包括凝胶和添加剂，凝胶为纤维蛋白，胶原蛋白，透明质酸，凝血酶；添加剂在培养基中的终浓度为：维生素C：233μM～287μM；亚油酸：3.7μM～8.9μM；胆固醇：9μM～17μM；地塞米松：6nM～15nM；乙酰半胱氨酸：43μM～58μM；转铁蛋白：18μg/mL～32μg/mL；亚硒酸钠：22nM～52nM；泛酸钠：13μM～24μM；生物素：28μM～43μM；胰岛素样生长因子：7μg/mL～18μg/mL；表皮生长因子：2ng/mL～9ng/mL；成纤维生长因子：2ng/mL～9ng/mL；血小板衍生生长因子：2ng/mL～9ng/mL；转化生长因子：30ng/ml～70ng/ml；胰岛素铁硒传递蛋白：1％。

Description

一种用于微骨折手术的软骨诱导基质的制备方法

技术领域

本发明涉及软骨修复领域，尤其涉及一种用于微骨折手术的软骨诱导基质的制备方法。

背景技术

关节软骨损伤，无论是外伤还是病理原因造成的损伤都不能自发修复，而且通常都会导致软骨的退行性病变，进而造成骨性关节炎。目前，主要采用是外源性修复方法，如骨软骨移植、微骨折等。近几年，软骨组织工程技术被认为是修复大面积软骨损伤的唯一方法，但软骨组织工程的主要方法是在体外培养种子细胞构建组织工程软骨，往往需要进行两次手术，第一次手术取种子细胞，第二次进行组织工程软骨移植，体外构建周期长达2—3周，存在手术难度大，细胞体外培养失率高，且会给病人造成多次额外损伤(取病人健康软骨、开放性手术等)的缺点，且价格昂贵，故组织工程软骨的应用相对局限。故而现在软骨损伤首选的治疗手段任是微骨折术。微骨折是利用关节透镜将软骨受损部位移除，再在软骨下骨上钻孔，使骨髓细胞与血液凝结，成为平滑且坚固的修复组织，从而修复软骨全损的手术。其优点是一次手术、微创、简单、经济等；缺点是骨髓细胞易流失、无法修复大面积的损伤、无法形成透明软骨等缺点。事实上，由微骨折手术修复的软骨缺损因综上原因，只能在缺损部位形成纤维软骨，无法使缺损软骨恢复成正常形态和功能，对病人的生活质量有严重的影响。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明提出了一种用于微骨折手术的软骨诱导基质及制备方法，具体涉及了一种能在关节镜下操作的，与微骨折手术结合使用的软骨诱导基质及其制备方法。

本发明为解决其技术问题，所提供的技术方案为：

一种用于微骨折手术的软骨诱导基质，包括凝胶和添加剂，其特征在于，凝胶为纤维蛋白，胶原蛋白，透明质酸，凝血酶；添加剂在培养基中的终浓度为：维生素C：233μM～287μM；亚油酸：3.7μM～8.9μM；胆固醇：9μM～17μM；地塞米松：6nM～15nM；乙酰半胱氨酸：43μM～58μM；转铁蛋白：18μg/mL～32μg/mL；亚硒酸钠：22nM～52nM；泛酸钠：13μM～24μM；生物素：28μM～43μM；胰岛素样生长因子：7μg/mL～18μg/mL；表皮生长因子：2ng/mL～9ng/mL；成纤维生长因子：2ng/mL～9ng/mL；血小板衍生生长因子：2ng/mL～9ng/mL；转化生长因子：30ng/ml～70ng/ml；胰岛素铁硒传递蛋白：1％。添加剂能为骨髓细胞提供生长所需，并诱导其往透明软骨方向分化。

进一步，纤维蛋白100mg/ml；胶原蛋白25mg/ml；透明质酸5％。

本技术方案的有益效果是，该基质能覆盖着病人软骨缺损处，并在5分钟内形成凝胶，从而固定住骨髓细胞并能促进骨髓细胞往透明软骨方向分化。该基质包括纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸、凝血酶、维生素C、亚油酸、胆固醇、地塞米松、转铁蛋白、生物素等，在治疗软骨缺损时，只需在微骨折手术中注射该基质，操作简单方便。该基质解决了微骨折手术骨髓细胞易流失、无法修复大面积的损伤、无法形成透明软骨等缺点。

一种用于微骨折手术的软骨诱导基质，包括凝胶和添加剂，凝胶为纤维蛋白100mg/ml；胶原蛋白25mg/ml；透明质酸5％；凝血酶50U/ml；添加剂在培养基中的终浓度为：维生素C：250μM；亚油酸：4.5μM；胆固醇：13μM；地塞米松：10nM；乙酰半胱氨酸：50μM；转铁蛋白：25μg/mL；亚硒酸钠：30nM；泛酸钠：17μM；生物素：33μM；胰岛素样生长因子：10μg/mL；表皮生长因子：5ng/mL；成纤维生长因子：5ng/mL；血小板衍生生长因子：5ng/mL；转化生长因子：50ng/ml；胰岛素铁硒传递蛋白：1％。本技术方案的有益效果是，该基质能覆盖着病人软骨缺损处，并在5分钟内形成凝胶，从而固定住骨髓细胞并能促进骨髓细胞往透明软骨方向分化。该基质包括纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸、凝血酶、维生素C、亚油酸、胆固醇、地塞米松、转铁蛋白、生物素等，在治疗软骨缺损时，只需在微骨折手术中注射该基质，操作简单方便。该基质解决了微骨折手术骨髓细胞易流失、无法修复大面积的损伤、无法形成透明软骨等缺点。

一种用于微骨折手术的软骨诱导基质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：将维生素C，亚油酸，胆固醇，地塞米松，乙酰半胱氨酸，转铁蛋白，亚硒酸钠，泛酸钠，生物素，胰岛素样生长因子，表皮生长因子，成纤维生长因子，血小板衍生生长因子，转化生长因子，胰岛素铁硒传递蛋白添加到基础培养基中，使得添加剂在基础培养基中的最终浓度为：

维生素C：233μM～287μM；亚油酸：3.7μM～8.9μM；胆固醇：9μM～17μM；地塞米松：6nM～15nM；乙酰半胱氨酸：43μM～58μM；转铁蛋白：18μg/mL～32μg/mL；亚硒酸钠：22nM～52nM；泛酸钠：13μM～24μM；生物素：28μM～43μM；胰岛素样生长因子：7μg/mL～18μg/mL；表皮生长因子：2ng/mL～9ng/mL；成纤维生长因子：2ng/mL～9ng/mL；血小板衍生生长因子：2ng/mL～9ng/mL；转化生长因子：30ng/ml～70ng/ml；胰岛素铁硒传递蛋白：1％。

步骤二：用步骤一配制制溶剂分别溶解纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸和凝血酶；

步骤三：在微骨折手术中，将步骤二中配制的四种溶剂混合注射进病人软骨缺损部位；纤维蛋白和凝血酶混合时，模拟凝血链级反应的最后一步，通过凝血酶对纤维蛋白原的激活作用，使纤维蛋白原逐渐聚合，最终形成纤维蛋白固化物；胶原蛋白的作用是模拟软骨细胞在体内的生长环境；透明质酸的作用是固定添加剂，使添加剂能有效存在基质中。

进一步，步骤二中，纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸和凝血酶终浓度为：纤维蛋白100mg/ml；胶原蛋白25mg/ml；透明质酸5％；凝血酶50U/ml。

进一步，步骤一中，添加剂在基础培养基中的最终浓度为：

维生素C：250μM；亚油酸：4.5μM；胆固醇：13μM；地塞米松：10nM；乙酰半胱氨酸：50μM；转铁蛋白：25μg/mL；亚硒酸钠：30nM；泛酸钠：17μM；生物素：33μM；胰岛素样生长因子：10μg/mL；表皮生长因子：5ng/mL；成纤维生长因子：5ng/mL；血小板衍生生长因子：5ng/mL；转化生长因子：50ng/ml；胰岛素铁硒传递蛋白：1％。

本技术方案的有益效果是：通过实施例4中对12只新西兰兔分成三组进行实验，无论是通过肉眼观察还是光镜组织学检查，采用本方法后，基质快速覆盖着兔软骨缺损处，并在5分钟内形成凝胶，从而固定住骨髓细胞并能促进骨髓细胞往透明软骨方向分化。原软骨缺损位制表面光滑，呈白色，完全填平，富有弹性，与周围软骨组织相似，基本无界限，缺损基本愈合，修复组织细胞密度显著降低，基质均匀，细胞形态和排列接近正常软骨，修复软骨呈透明软骨样。本发明能够在微骨折手术中固定骨髓细胞、覆盖缺损面积、诱导骨髓细胞往透明软骨方向发展，满足众多的患者的临床应用，使其关节功能得到长期维持。

附图说明

图1：实施例4中光镜组织学检查A组；

图2：实施例4中光镜组织学检查B、C组；

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合图示与具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：

本实施例，提供一种用于微骨折手术的软骨诱导基质，它能够在微骨折手术中固定骨髓细胞、覆盖缺损面积、诱导骨髓细胞往透明软骨方向发展，满足众多的患者的临床应用，使其关节功能得到长期维持。

一种用于微骨折手术的软骨诱导基质，包括凝胶和添加剂，凝胶为纤维蛋白100mg/ml；胶原蛋白25mg/ml；透明质酸5％；凝血酶50U/ml；该凝胶能在5分钟内覆盖软骨缺损位制并凝固，为骨髓细胞提供固定支架；添加剂在培养基中的成分以终浓度计，包括：维生素C：233μM～287μM；亚油酸：3.7μM～8.9μM；胆固醇：9μM～17μM；地塞米松：6nM～15nM；乙酰半胱氨酸：43μM～58μM；转铁蛋白：18μg/mL～32μg/mL；亚硒酸钠：22nM～52nM；泛酸钠：13μM～24μM；生物素：28μM～43μM；胰岛素样生长因子：7μg/mL～18μg/mL；表皮生长因子：2ng/mL～9ng/mL；成纤维生长因子：2ng/mL～9ng/mL；血小板衍生生长因子：2ng/mL～9ng/mL；转化生长因子：30ng/ml～70ng/ml；胰岛素铁硒传递蛋白：1％。

添加剂能为骨髓细胞提供生长所需，并诱导其往透明软骨方向分化。

胰岛素样生长因子，表皮生长因子促进细胞生长并促进软骨细胞分泌蛋白的，成纤维生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子用于诱导微骨折释放的干细胞诱导成软骨细胞。

实施例2：

本实施例，提供一种用于微骨折手术的软骨诱导基质，它能够在微骨折手术中固定骨髓细胞、覆盖缺损面积、诱导骨髓细胞往透明软骨方向发展，满足众多的患者的临床应用，使其关节功能得到长期维持。

一种用于微骨折手术的软骨诱导基质，包括凝胶和添加剂，凝胶为纤维蛋白100mg/ml；胶原蛋白25mg/ml；透明质酸5％；凝血酶50U/ml；该凝胶能在5分钟内覆盖软骨缺损位制并凝固，为骨髓细胞提供固定支架；添加剂在培养基中的成分以终浓度计，包括：维生素C：250μM；亚油酸：4.5μM；胆固醇：13μM；地塞米松：10nM；乙酰半胱氨酸：50μM；转铁蛋白：25μg/mL；亚硒酸钠：30nM；泛酸钠：17μM；生物素：33μM；胰岛素样生长因子：10μg/mL；表皮生长因子：5ng/mL；成纤维生长因子：5ng/mL；血小板衍生生长因子：5ng/mL；转化生长因子：50ng/ml；胰岛素铁硒传递蛋白：1％。

添加剂能为骨髓细胞提供生长所需，并诱导其往透明软骨方向分化。

胰岛素样生长因子，表皮生长因子促进细胞生长并促进软骨细胞分泌蛋白的，成纤维生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子用于诱导微骨折释放的干细胞诱导成软骨细胞。

实施例3：

一种用于微骨折手术的软骨诱导基质的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：将维生素C，亚油酸，胆固醇，地塞米松，乙酰半胱氨酸，转铁蛋白，亚硒酸钠，泛酸钠，生物素，胰岛素样生长因子，表皮生长因子，成纤维生长因子，血小板衍生生长因子，转化生长因子，胰岛素铁硒传递蛋白添加到基础培养基中，使得添加剂在基础培养基中的最终浓度为：

维生素C：233μM～287μM；亚油酸：3.7μM～8.9μM；胆固醇：9μM～17μM；地塞米松：6nM～15nM；乙酰半胱氨酸：43μM～58μM；转铁蛋白：18μg/mL～32μg/mL；亚硒酸钠：22nM～52nM；泛酸钠：13μM～24μM；生物素：28μM～43μM；胰岛素样生长因子：7μg/mL～18μg/mL；表皮生长因子：2ng/mL～9ng/mL；成纤维生长因子：2ng/mL～9ng/mL；血小板衍生生长因子：2ng/mL～9ng/mL；转化生长因子：30ng/ml～70ng/ml；胰岛素铁硒传递蛋白：1％。

胰岛素样生长因子，表皮生长因子促进细胞生长并促进软骨细胞分泌蛋白的，成纤维生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子用于诱导微骨折释放的干细胞诱导成软骨细胞。

步骤2：用步骤1配制溶剂分别溶解纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸和凝血酶；使其终浓度为：纤维蛋白100mg/ml；胶原蛋白25mg/ml；透明质酸5％；凝血酶50U/ml；

步骤3：在微骨折手术中，将步骤2中配制的四种溶剂混合注射进病人软骨缺损部位，该基质中的凝胶能在5分钟内覆盖软骨缺损位制并凝固，为骨髓细胞提供固定支架。纤维蛋白和凝血酶混合时，模拟凝血链级反应的最后一步，通过凝血酶对纤维蛋白原的激活作用，使纤维蛋白原逐渐聚合，最终形成纤维蛋白固化物；胶原蛋白的作用是模拟软骨细胞在体内的生长环境；透明质酸的作用是固定添加剂，使添加剂能有效存在基质中。

实施例4：

一种用于微骨折手术的软骨诱导基质的制备方法：

具体操作过程如下：

步骤1：将维生素C，亚油酸，胆固醇，地塞米松，乙酰半胱氨酸，转铁蛋白，亚硒酸钠，泛酸钠，生物素，胰岛素样生长因子，表皮生长因子，成纤维生长因子，血小板衍生生长因子，转化生长因子，胰岛素铁硒传递蛋白添加到基础培养基中，使得添加剂在基础培养基中的最终浓度为：

维生素C：250μM；亚油酸：4.5μM；胆固醇：13μM；地塞米松：10nM；乙酰半胱氨酸：50μM；转铁蛋白：25μg/mL；亚硒酸钠：30nM；泛酸钠：17μM；生物素：33μM；胰岛素样生长因子：10μg/mL；表皮生长因子：5ng/mL；成纤维生长因子：5ng/mL；血小板衍生生长因子：5ng/mL；转化生长因子：50ng/ml；胰岛素铁硒传递蛋白：1％。

胰岛素样生长因子，表皮生长因子促进细胞生长并促进软骨细胞分泌蛋白的，成纤维生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子用于诱导微骨折释放的干细胞诱导成软骨细胞。

步骤2：用步骤1配制溶剂分别溶解纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸和凝血酶；使其终浓度为：纤维蛋白100mg/ml；胶原蛋白25mg/ml；透明质酸5％；凝血酶50U/ml；

步骤3：以兔为实验对象，将12只新西兰兔分为A、B、C三组，用3％戊巴比妥钠溶液按照1.0ml/kg耳缘静脉注射麻醉，术区脱毛，碘伏消毒，取双膝内侧入路，显露髌股关节面，用直径4mm空心平头钻在股骨髁间窝正中上方造成全层关节软骨缺损区，深及软骨下骨以均匀出血为止，将三组兔做成股骨髁软骨损伤模型。

A组在缺损部位进行微骨折手术并注射软骨诱导基质，该基质能在5分钟内覆盖软骨缺损位制并凝固，为骨髓细胞提供固定支架；

B组在缺损部位不进行微骨折手术只注射软骨诱导基质；

C组在缺损部位只进行微骨折手术。

12周后处死动物、取材，观察指标：

a肉眼观察：观察膝关节囊有无挛缩、粘连和新生物形成，以及关节活动度、修复组织的光滑性及其与周边组织的结合情况。

A组原软骨缺损位制表面光滑，呈白色，完全填平，富有弹性，与周围软骨组织相似，基本无界限；

B、C组外观相似，缺损部位有纤维状填充，质软，没有弹性，与周围健康软骨有明显界限，但也说明了只使用软骨诱导基质也对软骨缺损修复也有一定疗效。

b光镜组织学检查：将标本制于100g/L甲醛溶液中固定，脱钙，梯度乙醇脱水，石蜡包埋后，切片行苏木素一伊红染色(HE)和甲苯胺蓝(TB)染色。光镜下对修复组织的性质、表面特性和与正常软骨连接等进行组织学观察。采用Wakitanic制定的评分标准(见表1)，双盲法对各标本进行组织学评分。实验结果见图1和图2。

表1：各组的Wnkitanic评分

由图1可知，A组缺损基本愈合，修复组织细胞密度显著降低，基质均匀，细胞形态和排列接近正常软骨，修复软骨呈透明软骨样；

由图2可知，B、C对照组缺损表面不光滑，软骨细胞排列不规则，细胞密度小于正常，缺损处为纤维结缔组织，界限清晰；

可见A组的修复效果最好，其次是C组和B组。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (2)

1.一种用于微骨折手术的软骨诱导基质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：将维生素C，亚油酸，胆固醇，地塞米松，乙酰半胱氨酸，转铁蛋白，亚硒酸钠，泛酸钠，生物素，胰岛素样生长因子，表皮生长因子，成纤维生长因子，血小板衍生生长因子，转化生长因子，胰岛素铁硒传递蛋白添加到基础培养基中，使得添加剂在基础培养基中的最终浓度为：

维生素C：233μM～287μM；亚油酸：3.7μM～8.9μM；胆固醇：9μM～17μM；地塞米松：6nM～15nM；乙酰半胱氨酸：43μM～58μM；转铁蛋白：18μg/mL～32μg/mL；亚硒酸钠：22nM～52nM；泛酸钠：13μM～24μM；生物素：28μM～43μM；胰岛素样生长因子：7μg/mL～18μg/mL；表皮生长因子：2ng/mL～9ng/mL；成纤维生长因子：2ng/mL～9ng/mL；血小板衍生生长因子：2ng/mL～9ng/mL；转化生长因子：30ng/ml～70ng/ml；胰岛素铁硒传递蛋白：1％；

步骤二：用步骤一配制溶剂分别溶解纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸和凝血酶，其中浓度为：纤维蛋白100mg/ml；胶原蛋白25mg/ml；透明质酸5％；凝血酶50U/ml；

步骤三：在微骨折手术中，将步骤二中配制的四种溶剂混合注射进病人软骨缺损部位；纤维蛋白和凝血酶混合时，模拟凝血链级反应的最后一步，通过凝血酶对纤维蛋白原的激活作用，使纤维蛋白原逐渐聚合，最终形成纤维蛋白固化物；胶原蛋白的作用是模拟软骨细胞在体内的生长环境；透明质酸的作用是固定添加剂，使添加剂能有效存在基质中。

2.根据权利要求1所述的一种用于微骨折手术的软骨诱导基质的制备方法，其特征在于，步骤一中，添加剂在基础培养基中的最终浓度为：

维生素C：250μM；亚油酸：4.5μM；胆固醇：13μM；地塞米松：10nM；乙酰半胱氨酸：50μM；转铁蛋白：25μg/mL；亚硒酸钠：30nM；泛酸钠：17μM；生物素：33μM；胰岛素样生长因子：10μg/mL；表皮生长因子：5ng/mL；成纤维生长因子：5ng/mL；血小板衍生生长因子：5ng/mL；转化生长因子：50ng/ml；胰岛素铁硒传递蛋白：1％。