CN105251015B - Nonratt021972小干扰rna在制备糖尿病及并发疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA在制备糖尿病及并发疾病药物中的应用，NONRATT021972小干扰核糖核酸可降低2型糖尿病模型大鼠血糖、血清炎性因子水平、升高抗氧化物质的活性、提高血胰岛素水平、增加肝糖原水平，提高葡萄糖激酶(GK)活性。本发明还可在制备降血脂防治高血脂引发相关疾病、肝葡萄糖激酶(GK)功能异常引发糖尿病、代谢病及相关并发疾病、肝组织长非编码核糖核酸NONRATT021972功能异常相关疾病药物中的应用。可以口服、注射、含片或其它局部或全身可用药剂型药物进行相关疾病的诊断、预防和治疗。

Description

NONRATT021972小干扰RNA在制备糖尿病及并发疾病药物中的 应用

技术领域

本发明属于糖尿病药物用途发明技术领域。

背景技术

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一组代谢性临床综合征，随着社会的发展和人们生活水平的提高糖尿病的患病率逐年升高，在发达国家糖尿病患病率已达3％-7％，成为仅次于癌症、艾滋病、心脑血管病之后第4位需要优先考虑的疾病，已成为世界第5位死亡主因。糖尿病分为1型(胰岛素依赖性)和2型(非胰岛素依赖性)糖尿病，不论是1型(胰岛素依赖性)还是2型(非胰岛素依赖性)糖尿病，其最主要的症状便是高血糖。高血糖是引发糖尿病并发症的主要原因，据估计，全球六个人里面就有一个人处于患糖尿病并发症的危险中。我国糖尿病人群的构成以2型糖尿病为主，占糖尿病人群的90％以上，严重影响着人民健康和社会发展。

葡萄糖激酶(glucokinase，GK)己糖激酶家族中的一员，分子质量为52k，由448个氨基酸残基构成。GK是糖代谢途径中的关键酶，特异性地存在于胰腺β细胞和肝细胞，可促进胰岛素分泌和葡萄糖代谢，参与糖代谢的各条途径。GK具有双重的生物学功能，肝脏GK参与葡萄糖磷酸化，加速糖原合成及葡萄糖代谢；胰腺β细胞中GK为葡萄糖敏感器，可促进高浓度葡萄糖状态下胰岛β细胞分泌胰岛素来降低血糖。肝脏中的GK是糖酵解过程中第一步的限速酶，催化葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖，后者在胰岛素作用下经过糖原合成途径合成肝糖原储存起来。因此，肝脏中的GK的主要作用是促进糖酵解，加速糖原合成和抑制糖异生，控制肝细胞对葡萄糖的摄取与利用，从而有效控制体内血糖平衡。研究表明，普通糖尿病患者及糖尿病动物模型体内葡萄糖激酶活性明显降低，它可能对糖尿病的发生、发展产生重要影响，而增加GK活性可促进葡萄糖的磷酸化，促进糖原合成和胰岛素释放，从而改善糖耐量异常，提高胰岛细胞功能，改善糖尿病症状。GK在控制血糖稳态和代谢中的作用主要表现为：一方面调节肝糖代谢，当空腹或血糖低时，GK活性低下，肝糖输出增加，以保证重要器官的能量供给；餐后或血糖高时，GK活性增强，可促进肝糖原合成，抑制肝脏糖异生，以维持血糖稳态。

随着基因组测序计划的完成以及新一代深度测序技术的应用，人们发现哺乳动物细胞中多于95％的转录序列为非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)。非编码RNA是一类不编码蛋白质但具有生物学调控功能的RNA分子，它可通过参与mRNA的稳定和翻译水平的调节、蛋白质的运输、RNA的加工和修饰以及影响染色体的结构等机制，调控生物体的基本生命活动，同时与一些重要疾病的病理生理过程相关。非编码RNA包括短非编码RNA(包括siRNA、miRNA、piRNA)和长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。长度大于200个碱基(200nt)为长链非编码RNA(lncRNA)。目前长 度小于50个核苷酸的非编码RNA(如microRNA、siRNA和piRNA)等的研究已取得突破性进展，但对具有功能的长非编码RNA的研究不多。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA的第一个新用途，即长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA在制备降低血糖、促进胰岛素功能的防治糖尿病及并发疾病药物应用、及高血糖引发的其它疾病的药物应用。

本发明的第二个目的在于提供长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA的第二个新用途，即长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA在制备降血脂防治高血脂引发相关疾病的药物中的应用。

本发明的第三个目的在于提供长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA的第三个新用途，即长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA在制备提高肝葡萄糖激酶活性、防治其功能异常介导的糖尿病及并发疾病的药物中的应用。

本发明的第四个目的在于提供长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸在制备治疗肝组织长非编码核糖核酸NONRATT021972功能异常相关疾病的防治药物中的应用。

本发明的第五个目的在于提供长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸在制备糖尿病及其并发病、高血脂引发相关疾病、葡萄糖激酶(GK)介导疾病、长非编码核糖核酸NONRATT021972功能异常相关疾病的诊断标志物中的应用。

本发明用SOLiD高通量测序并通过生物信息学预测和分子生物学验证确定大鼠肝脏存在长非编码核糖核酸NONRATT021972[http://www.noncode.org]，并发现糖尿病模型大鼠肝脏长非编码核糖核酸NONRATT021972表达较对照组明显增加，提示肝脏的长非编码核糖核酸NONRATT021972与糖尿病的病理变化有关。

本发明通过2型糖尿病大鼠模型，观察长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理后2型糖尿病大鼠空腹血糖、餐后血糖、血脂、空腹血胰岛素变化，以及与肝葡萄糖激酶(GK)表达变化的关系，为长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA用于糖尿病的诊断、预防和治疗提供帮助。

长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA在防治糖尿病及并发疾病的作用机理涉及：提高肝组织葡萄糖激酶的表达和活性，产生降血糖、降血脂、促进胰岛素功能的作用，对糖尿病及其并发疾病产生防治作用。

附图说明

图1实验第11周末各组大鼠血清中血脂的变化比较图。实验分组：正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病模型+长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰处理组、糖尿病模型+乱序的小干扰核糖核酸阴性对照组；2型糖尿病模型+二甲双胍组。实验数据用表示，每组样本数均为8只。其中^**p<0.01表示和正常对照组比较，^##p<0.01表示和糖尿病模型组比较。

图2实验第11周末各组大鼠血清中胰岛素水平的变化比较图。实验分组：正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病模型+长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰处理组、糖尿病模型+乱序的小干扰核糖核酸阴性对照组；2型糖尿病模型+二甲双胍组。实验数据用表示，每组样本数均为8只。其中^**p<0.01表示和正常对照组比较，^##p<0.01表示和糖尿病模型组比较。

图3逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法检测长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸对2型糖尿病大鼠肝脏葡萄糖激酶(GK)mRNA表达的影响图。实验分组：正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病模型+长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰处理组、糖尿病模型+乱序的小干扰核糖核酸阴性(NCsi)对照组；2型糖尿病模型+二甲双胍组。每组实验重复3次后取平均值进行统计，所得数据用平均值±标准差表示。图3(a)为RT-PCR实验结果图，图3(b)为实验数据分析比较柱状图，其中^*p<0.05， ^**p<0.01表示和正常组比较，^#p<0.05,^##p<0.01表示与糖尿病模型组比较。

图4蛋白印迹方法检测长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰处理对2型糖尿病大鼠肝脏葡萄糖激酶(GK)蛋白表达量的影响图。实验分组：正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病模型+长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰处理组、糖尿病模型+乱序的小干扰核糖核酸阴性对照组；2型糖尿病模型+二甲双胍组。每组实验重复3次后取平均值进行统计，所得数据用平均值±标准差表示。图4(a)为蛋白印迹实验结果图，图4(b)为实验数据分析比较柱状图，其中^*p<0.05，^**p<0.01表示和正常组比较，^#p<0.05，^##p<0.01表示与糖尿病模型组比较。

图5逆转录聚合酶链式反应方法检测长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸处理对高糖高脂大鼠肝细胞模型中GK mRNA表达的影响。每组实验重复3次，所得数据用平均值±标准差表示。图5(a)为RT-PCR实验结果图，图5(b)为实验数据分析比较柱状图，其中*p<0.05，**p<0.01表示和Ctrl组比较，^#p<0.05，^##p<0.01表示与高糖高脂组比较。

图6蛋白印迹方法检测非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸处理对高糖高脂大鼠肝细胞模型中GK蛋白表达的影响。每组实验重复3次，所得数据用平均值±标准差表示。图6(a)为蛋白印迹实验结果图，图6(b)为实验数据分析比较柱状图，其中*p<0.05，**p<0.01表示和Ctrl组比较，^#p<0.05，^##p<0.01表示与高糖高脂组比较。

图7逆转录聚合酶链式反应方法检测2型糖尿病人血清中长非编码核糖核酸NONRATT021972的浓度变化。实验结果显示2型糖尿病人血清中长非编码核糖核酸NONRATT021972的浓度较健康对照组增加。图7(a)为RT-PCR实验结果图，图7(b)为实验数据分析比较柱状图，其中*p<0.05，表示与健康对照组比较。

具体实施方式

下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。

实施例1。

用本技术领域公知的方法，制成适用于糖尿病降血糖及并发疾病治疗的口服或注射的长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸制剂。

实施例2。

用本技术领域公知的方法，制成适用于涉及降血脂防治高血脂引发相关疾病的治疗的口服或注射的长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸制剂。

实施例3。

用本技术领域公知的方法，制成适用于涉及葡萄糖激酶(GK)介导疾病治疗的口服或注射的长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸制剂。

实施例4。

用本技术领域公知的方法，制成适用于涉及在制备治疗长非编码核糖核酸NONRATT021972功能异常相关疾病的口服或注射的长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸制剂。

实施例5。

用本技术领域公知的方法，制成适用于涉及在制备检测糖尿病及其并发病、高血脂引发相关疾病、长非编码核糖核酸NONRATT021972功能异常疾病、葡萄糖激酶(GK)介导疾病的诊断试剂或其他类似制剂。

总之，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸可以口服、注射、含片或其它局部或全身可用药剂型药物，及相关疾病的诊断试剂，进行上述疾病的防治。

为了更好地理解本发明的实质，下面以长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA对2型糖尿病模型大鼠血糖、血脂、血胰岛素等的作用，及对肝组织葡萄糖激酶的表达和活性的影响实验和相关结果来证明长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA的用途。

一、材料和方法。

1.动物和分组。

Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，体重200g左右，分笼饲养，每笼饲养7只，温度20-25℃，相对湿度40％-70％，昼夜明暗交替12h/12h，自由饮水，适应1周后禁食不禁水12h剪尾采血测血糖。将大鼠随机分成对照组(Con)(10只)和模型组(40只)，对照组始终喂养普通饲料(由南昌大学医学院实验动物科学部提供)，模型组喂养高糖高脂饲料(基础饲料66.5％，蔗糖20％，猪油10％，胆固醇2.5％，胆酸钠1％，加水做成条状放在恒温鼓风干燥箱中80℃干烤3小时)。第5周末(即模型组喂高糖高脂饲料4周后)，所有大鼠禁食不禁水12h测血糖。模型组大鼠空腹腹腔注射链脲佐菌素(STZ)30mg/kg(临用前将STZ溶解于4℃冰箱预冷的pH为4.2的0.1mol/L柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液中，配制成2.5g/L的STZ溶液)。第6周末，空腹血糖小于7.8mmol/L的个体再注射STZ 30mg/kg一次，第7周末测空腹血糖大于7.8mmol/L为成模标准。

50只清洁级SD雄性大鼠，给予常规饲料，自由饮水，室温，相对湿度40％～60％适应性饲养1周后随机分成正常对照组(Ctrl+NS)和模型组。Ctrl组8只，自始至终 给予常规饲料喂养。模型组42只，给予高糖高脂饲料(高糖高脂饲料配方质量比：常规饲料66.5％，胆固醇2.5％，胆酸钠1％，猪油10％，蔗糖20％，以上材料加开水混匀后捏成条状放恒温鼓风干燥箱中烤干)喂养4周。第5周末，模型组大鼠空腹腹腔注射STZ(STZ溶液的配制：将浓度为0.1mol/L、pH为4.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液置4℃冰箱预冷，然后将STZ粉末溶解于预冷的缓冲液中，配制成2.5g/L的STZ溶液，现配现用，注意避光)，剂量30mg/kg。Ctrl组注射相同剂量生理盐水，一周后于大鼠尾端静脉采血测餐后血糖(PBG)及空腹血糖(FPG)，以PBG＞11.1mmol/L和或FPG＞7.8mmol/L作为2型糖尿病模型成功的标准。若未成模则追加注射一次STZ，每只大鼠注射次数不超过两次。2型糖尿病成模后的大鼠继续高糖高脂喂养。

长非编码核糖核酸NONRATT021972小RNA干扰(siRNA)序列由Invitrogen(Carlsbad,CA)公司提供，靶序列为5’-GAATGTTGGTCATATCAAA-3’；阴性对照scrambledsiRNA(CNsi)购至Invitrogen(Carlsbad,CA)公司。在体转染试剂由Entranster^TM公司提供。根据Entranster^TM在体转染说明书，实验第10周末对糖尿病造模成功的大鼠进行长非编码核糖核酸NONRATT021972-siRNA在体小干扰实验。第10周末将成模后的大鼠再随机分成四组：糖尿病模型+生理盐水对照组，糖尿病模型+长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰处理组，糖尿病模型+乱序小干扰核糖核酸处理组(阴性对照组)，糖尿病模型+二甲双胍(阳性药物对照组。糖尿病模型+长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰处理组和糖尿病模型+乱序小干扰组的大鼠进行小干扰核糖核酸干扰处理，即分别通过尾静脉注射长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰和乱序小干扰处理。对照组和糖尿病模型组均舌下静脉注射相同体积生理盐水。糖尿病模型+二甲双胍t组则每日给予二甲双胍250mg/kg连续灌胃一周处理。1周后取各组大鼠标本检测相关指标。

2.药物与试剂。

葡萄糖激酶抗体[abcam(ab37796)]；葡萄糖转运体4[abcam(ab65267)]；肝/肌糖元试剂盒(南京建成生物工程研究所)；β-actin一抗(中杉金桥)；羊抗鼠二抗(中杉金桥)；羊抗兔二抗(中杉金桥)；GCK引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)；β-actin引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)。

3.主要仪器。

罗康全活力型血糖仪(德国罗氏公司)；消毒纱布、手巾、棉签等，碘酒及75％酒精，手术器械包：剪刀、眼科小弯镊、血管钳、丝线、有齿镊等。

4.体重测定。

分别于第1、5、10、11周末测量各组大鼠体重，每次测量均由同一人操作，其他条件保持一致。

5.血糖、血胰岛素、血脂的测定。

分别于第1、5、10、11周末用罗氏全活力型血糖仪测量各组大鼠空腹血糖(禁食12小时，自由饮水)和餐后血糖，每次测量由相同人员操作，其他条件保持一致。剪 尾采血方法：首先用酒精棉球擦拭大鼠尾端，然后用消毒剪刀剪去尾尖2mm左右，将血直接滴在已准备好的血糖试纸上测量。采血结束后对大鼠尾端伤口行碘伏消毒。

在第11周末，大鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉后，仰卧位固定取颈动脉血2ml，收集于离心管后室温静置30min，3000rap离心10min，吸取上清(即血清)，-20℃保存待测。采用全自动生化分析仪检测各组大鼠血清中总胆固醇(T-CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)含量。采用放射免疫方法测量各组大鼠空腹血胰岛素(FINS)。根据公式计算出胰岛素敏感性指数(Insulin sensitivity index，ISI)：ISI＝ln[1/(FBG*FINS)]。

6.氧化应激水平测定。

6.1.超氧化物歧化酶(SOD)活性测定。

原理：黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶反应系统可产生超氧阴离子自由基(O2-·)，O2-·氧化羟胺形成亚硝酸盐，后者在显色剂的作用下呈现紫红色，而SOD对超氧阴离子自由基有专一的抑制作用，当被检样品中含有SOD时，通过超氧阴离子自由基其形成的亚硝酸盐减少。我们测定紫红色液体的吸光度，通过公式可计算求出被检样品的SOD活力。

操作步骤如下：

混匀，室温放置10min，550nm波长处测OD值。

血清总SOD计算公式：

6.2.谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力测定。

原理：谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-PX)是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶，它可以促进过氧化氢(H2O2)与还原型谷胱甘肽(GSH)反应生成H2O及氧化型谷胱甘肽(GSSG)，而谷胱甘肽过氧化物酶的活力可以用其酶促反应的速度来表示，测定此酶促反应中还原型谷胱甘肽的消耗浓度， 则可求出酶的活力。

操作步骤如下：

6.2.1.酶促反应：(试剂一应用液提前在37℃预温)

充分混匀，3500转/分，离心10分钟，取上清1ml作显色反应。

6.2.2.显色反应：

充分混匀，室温静置15分钟后，412nm波长处测OD值。

6.2.3.血清中GSH-PX酶活力的计算：

7.一氧化氮合酶(NOS)活力测定。

NOS是催化L-精氨酸与O2产生NO的合成酶，它广泛存在于生物体的神经组织、血管内皮、呼吸道、肠上皮、心肌、肾等组织中。其活力大小可由测定NO合成量的多少来决定。

操作步骤如下：

充分混匀后，于530nm波长处测OD值。

总NOS活力(U/ml)测定。血清NOS酶活力计算公式：

8.糖尿病大鼠肝脏实验。

8.1.肝糖原含量测定。

取各组大鼠肝脏，具体操作按试剂盒说明书进行，用全自动生化仪测定。最后根据公式计算肝脏组织糖原含量：糖原含量(mg/g组织)＝(测定管OD值-标准管OD值)×标准管含量×样本测试前稀释倍数×样本测试过程中稀释倍数÷1.11。

8.2.逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)蛋白印迹检测肝脏葡萄糖激酶mRNA。

8.2.1.总RNA的提取：(1)取各组大鼠肝脏，提前用DEPC处理过的PBS中清洗；(2)把肝脏转移到用DEPC处理过的匀浆器，加入1ml的Trizol充分研磨；(3)转移到经DEPC水处理的1.5ml EP管中，静置5分钟，使完全变性；(4)每管加入0.2ml氯仿充分混匀后，冰浴15分钟；(5)4℃离心12000g×15min，可见管中的液体分为上(无色液相含总RNA中(白色乳状含蛋白质)和下(红色含DNA)三相；(6)将上层液相移入另一经DEPC水处理的1.5ml的EP管中，加等体积异丙醇，颠倒混匀数次，置-20℃约20分钟，沉淀RNA；(7)4℃离心12000g×15min，弃上清，管底可见少许白色沉淀物(为RNA)；(8)每管加75％乙醇1ml，充分洗涤RNA沉淀，4℃离心10000g×15min，弃上清×2次；(9)弃上清液，静置2分钟，使之干燥，加50μl无RNase水重悬沉淀，取10μl RNA用于定量和纯度检测，余下-20℃保存。

8.2.2.总RNA的鉴定：(1)分光光度计检测(RNA浓度、纯度测定)：用0.1％DEPC水给比色仪调零，取2μl RNA样品，用98μl0.1％DEPC水稀释50倍后，测RNA样品的OD 260nm和OD280nm，按以下公式计算RNA浓度和纯度。

RNA浓度(g/l)＝OD 260nm×50×0.04

RNA纯度＝OD260nm/OD 280nm，比值接近或大于1.8，说明RNA纯度较高，没有蛋白质的残余；比值小于1.6，说明RNA样品中有蛋白质、酚等污染；

(2)甲醛变性凝胶电泳鉴定RNA质量：配制1％甲醛变性胶，取RNA样品5μl与RNA上样缓冲液1:1混匀后，65℃水浴变性5min，在1×MOPS电泳缓冲液中电泳至满意为止(50v)，紫外灯下观察，可见28S、18S、5S三条带。

8.2.3.逆转录多聚酶链反应RT-PCR。

(1)引物设计：引物采用Primer Priemer 5.0软件设计，并经blast进一步验证。本发明选用β-actin作为内参，引物序列如下：

GCK:223bp

Forward primer 5'GGCTTCACCTTCTCCTTCCC 3'

Reverse primer 5'CACATTGGCGGTCTTCATAG 3'

Primerβ-actin:240bp

Sense:5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’

Antisense:5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’

(2)cDNA合成：按下列体系建立25μl逆转录反应：DEPC 4.875μl，5buffer 5μl，Rnasin 0.625μl，DNTP 1.5μl，Olig DT 2μl，MMLV 1μl，RNA样本10μl，共25μl，稍离心，37℃水浴1h；

(3)和β-actin扩增体系分别如下：DEPC 6.5μl，cDNA 4μl，

上下游引物各1μl(或GCK、β-actin上下游引物各1μl)，2×Taq酶12.5μl。PCR反应条件：94℃×3min→94℃×45sec，56℃×45sec，72℃×45sec，共35个循环→72℃×5min；

(4)PCR结果分析：各组取8μl扩增产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果、拍照，采用凝胶成像系统读取目的电泳条带的斑点密度扫描值。将条带与β-actin条带的比值作为mRNA的相对表达量。

8.3.蛋白印迹蛋白印迹检测肝脏葡萄糖激酶蛋白。

8.3.1.蛋白样品制备：将肝脏置于2ml匀浆器中球状部位，加200μl去污裂解液(含PMSF)于匀浆器中进行匀浆，然后置于冰上，几分钟后重复碾磨，再置于冰上，需要连续重复碾几次使组织尽量碾碎，裂解50min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，以12000rpm于4℃离心10min，取上清分装于0.5ml离心管中，取10μl蛋白裂解液用Bradford法进行蛋白质定量余下置于-20℃保存。

8.3.2.蛋白质定量：采用Bradford法测定。分别取1mg/ml的BSA：0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20:1，补实验用缓冲液(水)至终体积100:1，加入1ml Bradford工作液并震荡混匀，5min后测A595值，测量应在10min内完成。绘制标准曲线。以同样方法取1:1样品，分别加入99μl的水，再补以Bradford工作液1ml，测A595值，在标准曲线上查出的蛋白浓度即是样品本身的浓度。

8.3.3.SDS－PAGE电泳。

(1)制备10％分离胶：1.5mM Tris-HCl(pH 8.8)2.5ml，ddH₂O 4.0ml，30％聚丙烯酰胺3.3ml，10％SDS 100μl，10％过硫酸胺100μl，TEMED 5μl(加入后混匀，快速 制胶)。8ml上述混合液快速注入两层玻璃板间隙，随即以异丁醇1000ml封胶面，室温聚合30min，倾去异丁醇，ddH₂O冲洗胶顶面；

(2)制备5％积层胶：1mM Tris-HCl(pH 6.8)0.63ml，ddH2O 3.4ml，30％聚丙烯酰胺0.83ml，10％SDS 50μl，10％过硫酸胺50μl，TEMED 5μl(加入后混匀，快速制胶)。3ml上述混合液快速注入两层玻璃板间隙，迅速插入梳子，聚合完全后小心取出梳子；

(3)电泳：每组各取20μg蛋白和5×上样缓冲液按4：1体积混匀，100℃水浴5min，趁热加样，加样后凝胶放置于装有电泳缓冲液的电泳槽进行电泳。电泳条件：积层胶内90V×50min，分离胶内120V×1h，待样品中的溴酚蓝迁移至胶的前沿时，结束电泳；

(4)转膜：撬开玻璃板之间的凝胶，切取所需的部分，取与胶大小一致的PVDF膜在甲醇中浸泡10min后，盖住凝胶，在凝胶和膜两面各放四层滤纸，裁剪到与凝胶大小一致。将做好的膜块放入转膜器的黑白夹子中，胶在黑面(负极)，膜对白面(正极)，夹好后，放入转膜器中，加上转膜缓冲液转膜，电流160mV，2小时。

(5)检测转印膜上的蛋白质。

A、将转印后的PVDF膜浸泡在蒸馏水中洗涤；

B、将膜浸在丽春红S染色液中染色，约1min可见蛋白质色带出现；

C、将膜浸在蒸馏水中脱色，轻轻摇动数分钟，然后更换脱色液数次，直至背景色很淡。

(6)免疫学检测。

A、封闭：转膜后，将PVDF膜置TBST中，缓摇10min，然后膜于封闭液中室温下孵育2h。

B、结合一抗：封闭后将PVDF膜移入一抗反应液(羊源性GCK多克隆抗体按1:200、兔源性GCK多克隆抗体按1μg/ml溶于封闭液)，4℃过夜或室温平摇2h；回收一抗，膜浸入TBST10ml中，平摇10min，连续3次，清洗膜上残余一抗。

C、结合二抗：将PVDF膜分别移入兔抗羊(GCK)IgG-HRP二抗反应液(二抗按1：5000溶于封闭液)中，室温平摇2h后，PVDF膜浸入TBST 10ml中，平摇15min，连续3次，清洗膜上残余二抗。

D、免疫复合物的检测：膜在ECL中反应1min后，用保鲜膜包裹，置于X暗盒，暗室中剪大小合适X线胶片，曝光30s-5min，显影、定影，直至出满意结果，每组样品进行三次电泳，用于重复验证结果。

(7)光密度分析。

通过扫描仪透射扫描胶片，用Image-Pro Plus图像分析系统观察分析综合光密度。以各组β-actin条带的综合光密度值标化其相应组GCK的蛋白相对表达量。比较各组蛋白表达结果。

8.大鼠肝细胞(BRL-3A)细胞株实验。

大鼠肝细胞(BRL-3A)细胞株，购买于上海细胞库。

8.1细胞培养与转染。

细胞培养和分组：37℃、5％CO₂条件下，将购买的大鼠肝细胞(BRL-3A)用添加了10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液培养，每隔2天更换培养液液，3天后传代。取对数期细胞进行后续试验。

(1)小干扰核糖核酸(siRNA)干扰实验，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸的浓度为50nM。

1)肝细胞接种在6孔板，每组接种1孔，肝细胞的分组：

a)Ctrl组：用DMEM细胞培养基培养；b)HGHF组：DMEM细胞培养基中加入45mM葡萄糖和0.5mM游离脂肪酸；c)HGHF+长非编码核糖核酸NONRATT021972 si组；d)HGHF+NC si组；e)HGHF+Vector组。

2)小干扰步骤：

转染前将细胞更换不含有血清的Opti-MEM培养基继续培养。

3)准备siRNA-Fugene6混合液：

a)稀释Fugene6：用123μl不含血清培养基稀释12μl Fugene6，轻轻吹打混匀并在室温孵育5分钟；

b)稀释siRNA：将浓度为20μM的siRNA 15μl(加入细胞中的RNA终浓度50nM)加入Fugene6稀释液中，轻轻混匀，室温孵育15min；

c)将siRNA-Fugene6混合液加入含有细胞以及培养液的培养板各孔中，轻轻混匀；

d)将6孔板放在37℃的5％CO₂条件下培养，转染4～6小时后，把每个孔里面含有siRNA-Fugene混合培养液的培养基吸出，加入新鲜的细胞培养液；

e)培养72小时后，提取RNA及总蛋白，用RT-PCR和Western-blot检测目的蛋白和mRNA表达情况。

8.2逆转录-聚合酶链式反应。

方法同2型糖尿病大鼠整体实验中逆转录-聚合酶链式反应方法。

8.3蛋白印迹。

方法同2型糖尿病大鼠整体实验中蛋白印迹方法。

9实验数据的统计处理。

应用Excel和SPSS17.0统计软件对实验数据进行统计分析，各实验组结果以均数±标准差()表示，两组之间用t检验，多组之间用单因素方差分析后用最小显著差法(LSD)比较两两之间的差异。以p<0.05表示有统计学差异，p<0.01表示有显著性差异。

二、结果。

(一)实验动物特征和体重变化。

实验动物特征：对照组大鼠毛色光泽、精神状况良好、动作自如、反应灵敏；糖 尿病组大鼠毛发干枯、杂乱、脱落、行动迟缓、精神萎靡、尿量增多(每日尿量较之对照组高约2倍以上)并表现出多饮(每日饮水量较之对照组高约2倍以上)、多食(每日食量较之对照组高约2倍以上)等糖尿病症状。

体重的变化：实验开始(1周)时，各组大鼠体重无显著差异(p﹥0.05)；模型组经高糖高脂喂养四周后(5周)，体重增长显著，且比正常对照组(正常喂养到第5周)增长快，差异有统计学意义；注射STZ之后(10周)，模型组的大鼠体重增长缓慢，有的大鼠体重甚至下降，与正常组相比差异有显著的统计学意义(见表1.1)；到11W末，注射长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸组和二甲双胍灌胃组体重有缓慢增长，DM+NS组和DM+NCsi组则无明显增长，与正常组相比，有显著性差异(F_(4,35)＝128.28,p﹤0.01)(见表1.2)。

表1.1 药物处理前各组大鼠体重变化

表1.1药物处理前第1周、第5周、第10周正常对照组和糖尿病模型组大鼠体重的变化。实验数据用表示。^*p<0.05,^**p<0.01表示和糖尿病模型组比较。

表1.2 药物处理后(11W)各组大鼠体重变化

表1.2长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰处理和二甲双胍分别作用一周后各组大鼠体重的变化。各组样本数均为8只，实验数据用表示。其中^**p<0.01表示和正常对照组比较，^#p<0.05表示和糖尿病模型组比较。

(二)大鼠血糖的变化

实验开始时(1W末)各组大鼠FPG、PBG无统计学差异(p﹥0.05)；到第5周末(糖尿病模型组大鼠经高糖高脂喂养四周后)糖尿病模型组大鼠FPG、PBG与正常对照组相比均有升高但无统计学差异(p﹥0.05)(见表2.1)；注射STZ后到第10周末，糖尿病模型组大鼠与正常对照组大鼠相比餐后血糖和空腹血糖均升高，有统计学意义(p﹤0.01)。第11周末，与糖尿病模型组相比，糖尿病模型+长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰处理组和糖尿病模型+二甲双胍灌胃组空腹血糖(F_(4,35)＝3.42) 和餐后血糖(F_(4,35)＝3.92)均有所降低，差异有统计学意义(p﹤0.05)，糖尿病模型+乱序小干扰处理组和糖尿病模型组相比，空腹血糖和餐后血糖均无统计学意义(p﹥0.05)(见表2.2)。

表2.1 药物处理前各组大鼠血糖变化

表2.1实验第1周、第5周、第10周正常对照组和糖尿病模型组大鼠空腹血糖及餐后血糖的变化。实验数据用表示，n表示每组样本数。其中^**p<0.01表示和正常对照组比较。

表2.2 药物处理后(11W)各组大鼠血糖变化

表2.1实验第11周末大鼠空腹血糖及餐后血糖的变化。实验数据用表示，每组样本数均为8只。其中^**p<0.01表示和正常对照组比较，^#p<0.05，^##p<0.01表示和糖尿病模型组比较。

(三)大鼠血脂和空腹血胰岛素水平变化

全自动生化分析仪检测血脂结果表明，与正常对照组相比，糖尿病模型组和乱序小干扰核糖核酸阴性对照组的总胆固醇(T-CHOL)(F(4,35)＝12.43)、甘油三酯(TG)(F(4,35)＝14.71)、低密度脂蛋白(LDL-C)(F(4,35)＝6.89)水平均明显升高，而高密度脂蛋白(F(4,35)＝16.90)明显下降，且均有显著统计学意义(p﹤0.01)；而给予长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸处理组和二甲双胍灌胃组的大鼠血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平和糖尿病模型组相比则明显降低，高密度脂蛋白水平则明显升高，有显著统计学意义(p﹤0.01)；糖尿病模型组和小干扰RNA阴性对照组相比则均无统计学意义(见图1)。

用放免法测量第11周末各组大鼠空腹胰岛素，各组之间的表达存在显著差异，具有统计学意义(F(4,35)＝20.09，p﹤0.01)。分析结果表明：与正常对照组相比，糖尿病模型组和乱序小干扰核糖核酸阴性对照组的胰岛素水平降低，且有显著统计学意义(p﹤0.01)；而给予长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰处理组和二甲双胍灌胃组的大鼠胰岛素水平则显著升高，与糖尿病模型组相比有显著统计学意义(p﹤0.01)(见图2)。

(四)大鼠血清氧化应激指标结果。

采用全自动生化分析仪检测第11W末各组大鼠血清氧化应激指标：T-SOD、GSH-PX和T-NOS。实验结果分析表明：与正常对照组相比，糖尿病模型组和小干扰RNA阴性对照组的GSH-PX(F(4,35)＝20.81)、T-SOD(F(435)＝22.44)和T-NOS(F(4,35)＝12.91)均下降，且有显著差异性(p﹤0.01)；小干扰RNA处理组、二甲双胍灌胃组与糖尿病模型组相比，三项指标均升高，且有显著差异性(p﹤0.01)；小干扰RNA阴性对照组与糖尿病模型组相比无统计学差异(p﹥0.05)(见表4)。

表4.第11周末各组大鼠血清氧化应激指标的比较

表4.实验第11周末血清中氧化应激指标T-SOD、GSH-PX和T-NOS的变化比较。实验数据用表示，每组样本数均为8只。其中^**p<0.01表示和正常对照组比较， ^##p<0.01表示和糖尿病模型组比较。

(五)大鼠肝脏葡萄糖激酶(glucokinase，GK)表达的变化。

5.1RT-PCR结果。

RT-PCR实验结果采用凝胶成像系统软件进行分析。结果表明：正常对照组、糖尿病模型组、长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组、小干扰RNA阴性对照组以及二甲双胍灌胃组的GK mRNA的平均光密度值之间的表达存在显著差异(F(4,10)＝11.45，p﹤0.01)。分别是0.54±0.06、0.38±0.04、0.50±0.03、0.40±0.01、0.63±0.06(n＝3)。与对照组相比，糖尿病模型组大鼠肝脏中GK mRNA的表达量明显降低，统计学分析有显著差异(p﹤0.01)，糖尿病模型+小干扰RNA阴性对照组GK mRNA表达量也明显降低，有统计学差异(p﹤0.05)；与糖尿病模型组相比，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰处理组和二甲双胍灌胃组大鼠肝脏中GK mRNA的 表达明显升高，有显著差异性(F(2,6)＝15.27，p﹤0.01)；糖尿病模型组及糖尿病模型+小干扰RNA阴性对照组之间则无统计学差异(p﹥0.05)(见图3)。

5.2蛋白印迹结果：

用Image-Tool软件分析图像，读取各组目的条带以及β-actin条带的综合光密度值，然后用目的条带比β-actin条带的综合光密度值即可得到GK蛋白的相对表达量。结果显示：正常对照组、糖尿病模型组、长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组、小干扰RNA阴性对照组以及二甲双胍灌胃组的GK蛋白表达量存在显著性差异(F(4,10)＝146.85，p﹤0.01)。分别是0.62±0.04、0.47±0.03、0.93±0.05、0.50±0.05、1.49±0.07(n＝3)。与Ctrl+NS组相比，DM+NS组和DM+NC si组大鼠肝脏GK蛋白表达量明显降低(F(2,6)＝6.51，p﹤0.01)；与DM+NS组相比，DM+长非编码核糖核酸NONRATT021972si组和DM+Met组的GK蛋白表达量则显著增加(F(2，6)＝202.66，p﹤0.01)；DM+NS组与DM+NC si组的GK蛋白表达量则无统计学差异(p﹥0.05)(见图4)。

(六)大鼠糖原变化。

正常对照组、糖尿病模型组、长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰处理组、小干扰RNA阴性对照组以及二甲双胍灌胃组的糖原含量存在显著差异(F_(4，35)＝408.89，p﹤0.01)。DM+NS组、DM+NCsi组与Ctrl组相比，糖元含量明显降低，有显著差异性(F_(2,21)＝678.25，p﹤0.01)；DM+Met组、DM+长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA(si)组与DM+NS组相比，糖原含量明显增加，有显著差异性(F_(2,21)＝115.12，p﹤0.01)；DM+Met组与DM+NCsi组相比无统计学差异(p>0.05)(见表5)。

表5. 2型糖尿病大鼠肝糖原变化

各组大鼠样本数各8只，实验数据用表示。其中^*p<0.05,^**p<0.01表示和正常组比较；^#p<0.05,^##p<0.01表示和模型组比较。

(七)培养大鼠肝细胞(BRL-3A)细胞株实验结果。

7.1大鼠肝细胞(BRL-3A)细胞株GK mRNA表达变化。

RT-PCR结果采用凝胶成像系统软件进行分析，结果表明：Ctrl组、HGHF组、HGHF+长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸(si RNA)组、HGHF+NCsi组和HGHF+Vector组的GK mRNA的平均光密度值之间的表达存在显著差异(F_(4,10)＝20.6，p﹤0.01)。分别是0.28±0.01、0.20±0.03、0.31±0.01、0.20±01、0.23±0.01。与Ctrl组相比，HGHF组、HGHF+NCsi组、HGHF+Vector组肝细胞中GK mRNA的 表达明显降低，有显著差异性(F_(3,8)＝10.39，p﹤0.01)；HGHF+长非编码核糖核酸NONRATT021972si RNA组与HGHF组、HGHF+NCsi组、HGHF+Vector组比较，HGHF+长非编码核糖核酸NONRATT021972si RNA组肝细胞中GK mRNA的表达明显升高，且有显著差异性(F_(3,8)＝21.33，p﹤0.01)，HGHF组、HGHF+NCsi组和HGHF+Vector组之间无统计学差异(F_(2,6)＝1.96，p>0.05)(见图5)。

7.2.大鼠肝细胞(BRL-3A)细胞株GK蛋白表达变化。

Western结果采用凝胶成像系统软件进行分析，结果表明：Ctrl组、HGHF组、HGHF+长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸(si RNA)组、HGHF+NCsi组和HGHF+Vector组的GK蛋白平均表达量存在显著性差异(F_(4,10)＝12.91，p﹤0.01)，分别是1.24±0.18、0.78±0.07、1.35±0.01、0.98±0.08、0.96±0.01。与Ctrl组相比，HGHF+Vector组、HGHF+NCsi组肝细胞中GK的表达降低(F_(3，8)＝4.49,p﹤0.05)，HGHF组肝细胞中GK的表达明显降低(p﹤0.01)；HGHF+长非编码核糖核酸NONRATT021972si RNA组较HGHF组肝细胞中GK的表达显著升高(p﹤0.01)，HGHF组、HGHF+NCsi组、HGHF+Vector组之间无统计学差异(F_(2,6)＝1.20，p>0.05)(见图6)。

(八)2型糖尿病人血清中长非编码核糖核酸NONRATT021972的浓度变化。

逆转录聚合酶链式反应方法检测观察到2型糖尿病人血清中长非编码核糖核酸NONRATT021972的浓度较健康对照组增加(p<0.05)(见图7)。

发明人研究发现长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸可降低2型糖尿病模型大鼠升高的血糖、血清炎性因子水平、氧化应激水平、升高抗氧化物质的活性、提高血胰岛素水平、增加肝糖原水平，其机理涉及增加葡萄糖激酶(GK)表达、提高葡萄糖激酶(GK)活性。2型糖尿病人血清中长非编码核糖核酸NONRATT021972的浓度增加，提示其可能成为糖尿病及其并发病、高血脂引发疾病、NONRATT021972功能异常疾病、葡萄糖激酶(GK)介导疾病的诊断标志物。本发明为防治糖尿病并发疾病探明新方法，这将有助于长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸所涉及糖尿病并发疾病及其它相关疾病的药物防治应用。

Claims (6)

1.靶向长非编码核糖核酸NONRATT021972的小干扰核糖核酸在制备降低高血糖药物中的应用，所述的长非编码核糖核酸NONRATT021972序列如SEQ ID NO.3所示，所述的小干扰核糖核酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

2.靶向长非编码核糖核酸NONRATT021972的小干扰核糖核酸在制备治疗糖尿病药物中的应用，所述的长非编码核糖核酸NONRATT021972序列如SEQ ID NO.3所示，所述的小干扰核糖核酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

3.靶向长非编码核糖核酸NONRATT021972的小干扰核糖核酸在制备降血脂药物中的应用，所述的长非编码核糖核酸NONRATT021972序列如SEQ ID NO.3所示，所述的小干扰核糖核酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

4.靶向长非编码核糖核酸NONRATT021972的小干扰核糖核酸在制备治疗高血脂药物中的应用，所述的长非编码核糖核酸NONRATT021972序列如SEQ ID NO.3所示，所述的小干扰核糖核酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

5.靶向长非编码核糖核酸NONRATT021972的小干扰核糖核酸在制备增强葡萄糖激酶药物中的应用，所述的长非编码核糖核酸NONRATT021972序列如SEQ ID NO.3所示，所述的小干扰核糖核酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

6.靶向长非编码核糖核酸NONRATT021972的小干扰核糖核酸在制备糖尿病的诊断试剂中的应用，所述的长非编码核糖核酸NONRATT021972序列如SEQ ID NO.3所示，所述的小干扰核糖核酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。