CN105238837B - 一种花生粕醒酒肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种花生粕醒酒肽的制备方法，步骤包括：以脱脂后的花生粕为原料，经浸提和水洗后，除去水溶性蛋白，所得沉淀加水和Amano SD‑AY10蛋白酶酶解，灭酶后再加入Alcalase AF蛋白酶酶解，灭酶、离心、微滤和超滤，制得具有醒酒作用的分子量在1000～3000Da的花生粕多肽。体外试验表明，该多肽溶液对乙醇脱氢酶具有较高的激活率。动物试验表明，该多肽摄入量为200～400mg/kg·bw时，有显著的防醉和醒酒作用，可开发为醒酒保肝类保健食品。

Description

一种花生粕醒酒肽的制备方法

技术领域

本发明涉及花生多肽制备技术，特别涉及花生粕制备活性多肽的方法，具体是一种利用花生粕制备具有防醉与醒酒作用多肽的方法。

背景技术

花生粕作为花生油生产的副产物，其蛋白质含量达40％～50％，此外还富含黄酮类、鞣质、糖类、三萜或甾体类化合物等活性物质。目前关于花生粕的利用主要集中在分离蛋白的提取和研究，用花生粕制备醒酒多肽的研究较少。医学证明，长期过量饮酒或一次性大量饮酒会对人体十分不利，损害肝、胃、脾等内脏器官，造成胃溃疡、肝硬化等疾病。人们已经开始认识到了解酒保健的重要性。目前市场上的解酒保健品多以中草药提取物主，关于蛋白水解醒酒多肽的报道多见于玉米肽。

关于玉米醒酒肽的研究文献主要有：《酶膜耦合连续法制备玉米肽解酒及防醉研究》(食品科学2012,33(17):241～245)，通过Alcalase碱性蛋白酶耦合膜分离制备出分子量小于5000Da玉米醒酒多肽。CN201010540622的专利《一种醒酒肽的提取方法》，研究以玉米黄粉为原料，经过配水、加酒精和亚硫酸钠升温蒸煮，加碱性蛋白酶风味蛋白酶酶解，过滤后滤液经干燥后即获醒酒肽。CN200910073036的专利《玉米醒酒肽的制备方法》，通过Alcalase碱性蛋白酶和Protamex复合蛋白酶复合水解玉米粉或玉米蛋白制备出一种具有醒酒作用的多肽。以上文献所述中的醒酒肽所用原料均为玉米粉或玉米蛋白。

在《花生粕蛋白醒酒肽饮料的研制》(食品工业,2008,2:45～47)中，采用碱溶酸沉法从花生粕中提取分离蛋白，然后用枯草杆菌碱性蛋白酶酶解花生分离蛋白，制成具有醒酒作用的蛋白饮料。该文献采用碱溶酸沉法提取分离蛋白，如实现工业化生产可能会带来环境污染问题；所得酶解多肽未进一步分级纯化，醒酒效果不理想，同时也未对醒酒肽的醒酒作用做详细研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种花生粕醒酒肽的制备方法，该方法原料处理与多肽制备过程简单，不需碱溶酸沉步骤，纯化的活性多肽醒酒效果良好。

本发明提供的一种花生粕醒酒肽的制备方法，是以脱脂后的花生粕为原料，经浸提和水洗后，除去水溶性蛋白，所得沉淀按一定料液比加水后，先添加Amano SD-AY10蛋白酶酶解，灭酶后再加入Alcalase AF蛋白酶，在其最适宜条件下进行酶解，然后灭酶、离心、微滤和超滤，制得具有醒酒作用的花生粕多肽。具体步骤如下：

将脱脂后的花生粕粉末，按料液比1：10加入清水浸泡提取4h，4000r/min离心10min除去水溶性蛋白，取沉淀再加3倍体积的水，水洗2～3次，得到花生粕沉淀；将所得花生粕沉淀，按料液比1：10～15加入清水和Amano SD-AY10蛋白酶，加酶质量为花生粕沉淀质量的1/50；在50～60℃，pH9.0～10.0条件下酶解25～40min，升温到95℃灭酶10min，灭酶后冷却至40～50℃，再加入Alcalase AF蛋白酶，加酶的质量为花生粕沉淀质量的1/30～1/50，在pH7.5～9.0条件下酶解2～4h，酶解结束后升温到85℃灭酶；

将酶解液在5000r/min离心得到上清液，然后用孔径为0.22um的微滤膜进行微滤，所得滤出液用截留分子量为3000Da的超滤膜进行超滤，滤出液再用1000Da超滤膜超滤，收集1000～3000Da的截留液做为醒酒肽溶液。

该醒酒肽溶液可进一步浓缩成浓缩液冷藏，或喷雾干燥成粉末保存。

本发明的有益效果和优点：

体外和动物试验表明，花生粕多肽溶液浓度达到1.2～1.6％时，对于乙醇脱氢酶激活作用显著；动物摄入剂量为200-400mg/kg·bw时，能促进乙醇代谢为乙醛或乙酸，降低血液中乙醇的浓度，从而达到醒酒的作用。本发明方法制备的花生粕醒酒肽可在制备醒酒保健品中应用。

该多肽的原料来源广泛和成本低廉；该醒酒肽的加工工艺简单，酸碱废液排放少；所得的1000～3000Da多肽的乙醇脱氢酶激活率比未分级处理的酶解多肽混合液提高了20％，激活乙醇脱氢酶的作用显著。经分级处理，使该醒酒肽中1000～3000Da活性多肽的含量达到60％以上。

附图说明

图1本发明花生粕醒酒肽不同剂量随时间变化对小鼠体内乙醇变化的影响

具体实施方式

实施例1

取100g花生粕粉末，按料液比1：10加入清水浸泡提取4h，4000r/min离心10min，取沉淀再加3倍体积的水，水洗2次，得到沉淀花生粕。取50g处理好的花生粕，加入500ml水和1g Amano SD-AY10蛋白酶，在60℃，pH9.0条件下酶解30min，95℃灭酶10min后冷却至50℃，调节ph至8.0，加入1.5g Alcalase AF蛋白酶酶解2h，85℃灭酶后酶解液离心得到上清液，上清液用孔径为0.22um的微滤膜微滤，滤液选用截留分子量为3000、1000Da的超滤膜超滤，得到3组分子量的滤液：分别为Mw>3 000Da、1000～3000Da和Mw<1 000Da。将所得的3种多肽滤液和原酶解液分别真空浓缩到相同多肽含量后，取样进行分子量分析和乙醇脱氢酶(ADH)激活率分析。

同时采用碱溶酸沉法提取花生粕蛋白(参照文献《花生粕蛋白醒酒肽饮料的研制》，食品工业,2008,2:45～47)，所得分离蛋白加入枯草杆菌碱性蛋白酶进行酶解制备多肽，浓缩到与前述酶解液相近浓度后测定ADH激活率。

结果表明，在相近的多肽含量下，本发明的未分级酶解原液的ADH激活率比碱溶酸沉法制备的多肽高；本发明的1000～3000Da多肽的ADH激活率不仅比未分级酶解原液高，也远高于碱溶酸沉法制备的多肽；本多肽在浓度1.36％时，对ADH激活率为30.47％，其多肽的质量百分率为总肽的77.12％。

表1不同花生粕多肽ADH的对比

实施例2

取200g花生粕粉末，按料液比1：10加入清水浸泡提取4h，4000r/min离心取沉淀再加3倍体积的水，水洗3次，得到沉淀花生粕。取100g处理好的花生粕，加入1200ml水和2gAmano SD-AY10蛋白酶，在55℃，pH9.5条件下酶解35min，95℃灭酶10min后冷却至45℃，调节ph至8.5，加入2.5g Alcalase AF蛋白酶酶解3h，85℃灭酶后酶解液离心取上清液，用孔径为0.22um的微滤膜微滤，然后选用3000Da超滤膜进行超滤，滤出液再用1000Da超滤膜超滤，收集截留分子量为1000～3000Da滤液，浓缩至6％备用。

防醉试验：将灌胃醉酒的小鼠仰卧至四肢朝上，能持续30s作为翻正反射消失的指标。取40只体重为20±2g雄性昆明种小鼠，在温度25±3℃及相对湿度为50±10％的封闭环境下饲养一周，试验前12小时禁食不禁水，随机分为4组：乙醇模型组；花生粕多肽低、中、高剂量(100、200、400mg/kg·bw)组。试验各组动物先灌胃样液，乙醇模型组按体重灌胃0.1mL/10g剂量的生理盐水，试验组按体重灌胃0.1mL/10g剂量的样液，30min后所有小鼠均灌胃相同剂量的56°白酒。记录各组给酒后翻正反射消失时间和翻正反射恢复时间及小鼠醉酒只数。

醒酒试验：分组方法与试验指标同防醉试验，区别是动物先灌酒后灌胃样液。4各组灌胃白酒的剂量和30min后试验组灌胃样液的剂量与防醉试验相同。记录4组动物灌酒后翻正反射恢复的时间和小鼠醉酒只数。

试验说明，100mg/kg的低剂量可小鼠缩短醉酒和醒酒时间，但作用不显著(p>0.05)。200mg/kg中剂量组与400mg/kg高剂量组对于缩短醉酒时间及醒酒均表现出显著性。

表3防醉试验结果

注：与模型组相比，**.P＜0.01，差异极显著；*.P＜0.05，差异显著。

表4醒酒试验结果

注：与模型组相比，**.P＜0.01，差异极显著；*.P＜0.05，差异显著。

实施例3

取100g花生粕粉末，按料液比1：10加入清水浸泡提取4h，4000r/min离心取沉淀，再加3倍体积的水，水洗3次，得到沉淀花生粕。取60g预处理好的花生粕，加入900ml水和1.2g Amano SD-AY10蛋白酶，在50℃，pH10.0条件下酶解40min，95℃灭酶10min后冷却至40℃，调节ph至9.0，加入2gAlcalase AF蛋白酶酶解4h，85℃灭酶，然后将酶解液离心，上清液用孔径为0.22um的微滤膜微滤，滤液选用3000Da超滤膜进行超滤，再用1000Da超滤，收集截留分子量为1000～3000Da滤液，浓缩至6％备用。

血液中乙醇含量测定：取体重为20±2g雄性小鼠，随机分为3组：乙醇模型组和花生粕多肽低、高剂量(100、400mg/kg·bw)组，每组25只。各组先灌样液，试验组灌胃0.1mL/10g样液，乙醇模型组灌胃0.1mL/10g生理盐水。30min后，3组均灌胃0.1mL/10g剂量的56°白酒，在灌胃30、60、90、120、150min时眼眶取血，参照GA/T842-2009中顶空气相色谱法测定血液中乙醇含量。试验结果表明(见图1)，各组动物在灌胃乙醇60min后，血液中乙醇浓度大到最大值。低剂量组中血液乙醇浓度下降趋势与模型组相近，高剂量组在灌胃后，乙醇浓度始终明显低于模型组，在30min～120min血液中乙醇浓度显著降低(p<0.05)。说明剂量为400mg/kg·bw的醒酒效果良好，该多肽可用于制作醒酒保肝类保健食品。

Claims (3)

1.一种花生粕醒酒肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将脱脂后的花生粕粉末，按料液比1：10加入清水浸泡提取4h，4000r/min离心10min除去水溶性蛋白，取沉淀再加3倍体积的水，水洗2～3次，得到花生粕沉淀；

2)将所得花生粕沉淀，按料液比1：10～15加入清水和Amano SD-AY10蛋白酶，加酶质量为花生粕沉淀质量的1/50；在50～60℃，pH9.0～10.0条件下酶解25～40min，升温到95℃灭酶10min，灭酶后冷却至40～50℃，再加入Alcalase AF蛋白酶，加酶的质量为花生粕沉淀质量的1/30～1/50，在pH7.5～9.0条件下酶解2～4h，升温到85℃灭酶，得到酶解液；

3)将酶解液在5000r/min离心得到上清液，然后用孔径为0.22um的微滤膜进行微滤，所得滤出液用截留分子量为3000Da的超滤膜进行超滤，滤出液再用1000Da超滤膜超滤，收集1000～3000Da的截留液做为醒酒肽溶液。

2.如权利要求1所述的一种花生粕醒酒肽的制备方法，其特征在于，所述醒酒肽溶液进一步浓缩成浓缩液冷藏，或喷雾干燥成粉末保存。

3.如权利要求1或2所述方法制备的花生粕醒酒肽在制备醒酒保健品中的应用。