CN105238800B - Tag1基因在调控植物叶片衰老进程中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了TAG1基因在调控植物叶片衰老进程中的应用，所述TAG1基因序列如SEQ ID NO:1所示。本发明通过利用外源基因表达载体将编码序列为SEQ ID NO:1所示的TAG1基因导入到目的植株中，过表达TAG1基因，植物植株表现为叶片衰老延缓。本发明通过调控TAG1基因在植物中的表达进而用于培育叶片衰老可调控的、高产植物新品种，为培育新的作物品种提供了新思路，在高产分子育种上具有极大的应用价值。

Description

TAG1基因在调控植物叶片衰老进程中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及TAG1基因在调控植物叶片衰老进程中的应用。

背景技术

叶片是特化了的光合器官，是植物同化产物形成和转运的主要场所。在作物遗传改良上，长期以来人们十分注重提高叶片的光合效率，而对如何通过直接调节叶片光合功能期和提高营养物质转运效率来提高作物的产量和品质关注较少。后者的调节实质上就是对叶片衰老进程的调控。植物叶片衰老的调控机制方面的研究有助于农业生产上的分子育种。过去五十年中，玉米上的高强度育种使得产量潜力得到了巨大的提高；深入的研究揭示，其产量上的遗传改良主要得益于杂交玉米叶片衰老进程的延缓。新近的研究也发现，多年来小麦育种上产量潜力的增加主要归因于叶片功能期的延长。上述研究表明，长期以来育种家是在无意识地通过延缓叶片衰老进程实现了作物产量改良的育种目标。利用分子生物学的手段通过提高衰老期间体内细胞分裂素含量延缓大豆叶片衰老进程不仅增加了作物的产量潜力，而且可以显著地提高植物的抗旱性。对于绿叶类作物而言，叶片衰老进程不仅影响到产量和品质要素的形成，而且还会直接地影响到采收产量、采后品质和货架寿命。延缓叶片衰老进程中叶绿素降解不仅能够显著地延缓绿叶类作物叶片中的蛋白质和相关品质指标的劣变，而且还能够显著地改变观赏植物的叶片景观。对于花卉植物而言，叶片和花器官的衰老进程直接影响到其观赏价值和销售价格。

叶片衰老是植物叶片发育的最后一个阶段，最终导致死亡。叶片是特异的进行光合作用的器官，植物投入了大量的能量和物质促进叶片生长。一旦叶片开始衰老，叶片对整个植物体的贡献就开始下降。叶片衰老过程也是一个程序化的影响物质回收、循环利用的过程。衰老叶片中的氮、磷及金属离子从衰老的叶片运输到处于旺盛生长中的叶子及种子。叶绿体中包含的蛋白质约占整个叶片总蛋白质的70％，是叶片衰老过程中第一个被降解的细胞器。细胞核负责调控基因表达，而线粒体负责能量的供应，在叶片衰老过程中保持完好直到最后阶段。

植物叶片衰老是一个受到基因控制的发育过程，即使在接近最佳生长环境中，在特定的时期衰老还是不可避免的发生。衰老作为叶片正常发育过程的一部分，虽然是受到基因严格控制，但一些能够影响基因组稳定性的毒性物质能诱导植物早衰。DNA分子容易受到生物、物理、化学等因素的影响导致各种不同程度的损伤可诱发基因突变或细胞损害从而导致细胞死亡。DNA损伤大部分是以碱基切除方式进行修复的。研究发现，DNA糖基化酶(DNA glycosylase)在碱基切除修复过程中具有关键作用。因此，在模式植物拟南芥中的研究表明，过表达基因TAG1能延缓叶片衰老进程并增强植株对基因毒性物质的抗性，这为通过基因工程手段延缓叶片衰老从而提高产量提供了新的思路。

发明内容

本发明的目的在于提供TAG1基因在调控植物叶片衰老进程中的应用，利用TAG1基因在植物叶片衰老进程中的表达调控，延缓叶片衰老的发生、发展，提高光合作用，为培育新的作物品种提供新的思路。

为了解决上述问题，本发明公开了TAG1基因在调控植物叶片衰老进程中的应用，所述TAG1基因序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还公开了TAG1基因在增强植物对博来霉素耐受中的应用，所述TAG1基因序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述植物为拟南芥。

本发明还公开了一种调控植物叶片衰老进程的方法，包括调控TAG1基因在植物中的表达，所述TAG1基因序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述方法包括如下步骤：

(1)构建重组表达载体，将SEQ ID NO:1所示基因序列的TAG1基因插入到真核细胞表达载体中；

(2)将重组表达载体转化到目的植物的细胞中，过表达TAG1基因；

(3)筛选抗性植物，得到晚衰植株。

优选地，所述方法中真核细胞表达载体为pCHF3-GFP。

优选地，所述方法中转化采用农杆菌介导法。

优选地，所述方法中所述植物为拟南芥。

本发明具有如下有益效果：

本发明通过利用外源基因表达载体将编码序列为SEQ ID NO:1所示的TAG1基因导入到植物植株中，过表达TAG1基因，植物植株表现为叶片衰老延缓。本发明通过调控TAG1基因在植物中的表达进而用于培育叶片衰老可调控的、高产植物新品种，为培育新的作物品种提供了新思路，在高产分子育种上具有极大的应用价值。

本发明通过筛选拟南芥突变体库，获得一个叶片早衰突变体tag1，TAG1基因编码3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶(DNA-3-methyladenine glycosylase)。tag1突变体对博来霉素(一种能引起DNA双链断裂损伤的抗生素)超敏感而过表达TAG1增强了对博来霉素的抗性，表明TAG1基因在DNA损伤修复方面具有重要的功能。本发明还发现过表达TAG1基因延缓叶片衰老进程。此项研究阐述了TAG1基因在调控植物叶片衰老中具有重要作用以及通过转基因延缓叶片衰老进程从而培育新的作物品种提供了新思路。

附图说明

图1为真核细胞表达载体pCHF3-GFP载体图谱，图中，LB表示左边界，RB表示右边界，Sacl-Kpnl-BamH1-Sall-Pstl为多克隆位点；

图2为本发明TAG1重组表达载体的部分序列鉴定结果；

图3为拟南芥Col-0野生型植株、tag1突变体以及TAG1转基因植物(TAG1ox)的衰老表型；

图4为拟南芥Col-0野生型植株、tag1突变体以及TAG1转基因植株(TAG1ox)在添加博来霉素的培养基上的生长情况。

具体实施方式

下文中将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。以下实施例中使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂和材料如无特殊说明，均为市售商品。其中，使用的各种突变体均购自ABRC，各种药品试剂，如无特殊说明均购自Sigma公司。

实施例1构建过表达TAG1的克隆

如图1和图2所示，本实施例以野生型拟南芥Col-0的cDNA为模板，通过RT-PCR的方法扩增得到TAG1基因的CDS。引物为：

正向引物F:5’-gc GAGCTC ATGTCGGCTC CACCGCGAGT-3’

反向引物R:5’-cc GGATCC ATTACCAGTC TCGTCCTTTG-3’

下划线分别为SacI和BamHI限制性内切酶位点，gc和cc为保护碱基。PCR引物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小，然后胶回收。把回收产物和图1所示的pCHF3载体分别用XhoI和ApaI双酶切，然后经胶回收；用T4连接酶在4℃连接过夜，连接产物经70℃、15分钟灭活后，通过热激的方法转到大肠杆菌，在壮观霉素的LB培养基上筛选阳性克隆，其测序鉴定的结果如图2所示。

实施例2构建转基因植物pCHF3-TAG1-GFP(TAG1ox)

本实施例构建了转基因植物pCHF3-TAG1-GFP(TAG1ox)，构建方法包括如下步骤：

(1)PCR扩增目标片段TAG1基因编码区，通过核酸内切酶酶切目标片段和质粒pCHF3-GFP产生黏性末端，将片段和质粒用连接酶连接，通过测序鉴定得到质粒pCHF3-TAG1-GFP；

(2)取2μl质粒加入100μl农杆菌GV3101中，2200V电击后迅速加入800μl LB培养基，28℃、220rpm培养1.5小时，均匀涂在50μg/ml壮观霉素LB培养基上，28℃倒置培养1天；

(3)接种单个菌落于5ml LB培养基(利福平50μg/ml+25μg/ml庆大霉素+壮观霉素50μg/ml)，28℃220rpm培养过夜；

(4)以1：100扩大培养于500mL含适当抗生素的LB(利福平50μg/ml+25μg/ml庆大霉素+壮观霉素50μg/ml)中，继续摇培5-8hr左右至生长密度为OD₆₀₀值1.0-1.2；

(5)室温，5000g，离心10min，收集菌体；

(6)用转化介质(5％蔗糖，2.033g/L MgCl₂)悬浮菌体；Silwet L-77(200μl/L)对菌液有伤害，应在转化植物前加入；

(7)将含有农杆菌的转化介质倒入烧杯中，将刚刚开花的拟南芥倒置其上，使得整个花序都浸入转化介质中(莲座基部的花序可用枪浇淋)，30s～120s；

(8)取出拟南芥，将其侧卧放在干净的塑料托盘上，并用薄膜覆盖避光保湿24hr；

(9)将拟南芥扶起，光下培养，约3-4周后长角果完全枯黄、欲开裂时，即可收获种子；

(10)用50μg/ml卡那霉素的MS培养基筛选转基因植物，即得转基因植物pCHF3-TAG1-GFP(TAG1ox)。

实施例3过表达TAG1基因调控植物叶片延缓衰老进程

本实施例中将构建好的过表达TAG1的克隆(TAG1ox)，转化到野生型拟南芥Col-0中。将转基因纯合体种子播种在MS培养基上，放置在人工培养箱内培养，培养温度为22℃，湿度为60％，16小时光照、8小时黑暗的长日照，在光(用白炽灯作为光源进行光照，连续作用光强度为200μmol·m–2s–1)下生长5天后转移土里，在植物培养室培养，培养温度为22℃，湿度为60％，16小时光照、8小时黑暗的长日照培养。培养16天后，每隔4天取四片叶片，用于测量叶绿素，并拍照。如图3所示，图3A为野生型拟南芥Col-0和tag1突变体在培养32天时的叶片表型，结果可见，tag1突变体的叶片衰老进程较野生型拟南芥Col-0的叶片衰老进程快；图3B为野生型拟南芥Col-0和TAG1ox转基因植株在培养48天时的叶片表型，结果可见，野生型拟南芥Col-0的叶片都衰老变黄了，而TAG1ox转基因植株的大部分叶片为绿色，与野生型拟南芥Col-0相比，TAG1ox转基因植株的叶片衰老进程明显延缓；图3C为不同时期野生型拟南芥Col-0、tag1突变体和TAG1ox转基因植株的叶绿素含量变化，结果可见，TAG1ox转基因植株的叶绿素含量明显高于野生型拟南芥Col-0和tag1突变体的叶绿素含量。以上结果表明，过表达TAG1可以延缓叶片衰老进程。

实施例4过表达TAG1基因提高了植株对博来霉素的抗性

本实施例中，将野生型拟南芥Col-0、tag1突变体以及TAG1ox转基因种子播种在添加了2mg/L博来霉素(一种能引起DNA双链断裂损伤的抗生素)的MS培养基上，在4℃暗处放置4天，让所有的种子充分吸涨以便萌发一致。然后在22℃光下培养20天，观察根生长情况。如图4所示，图4A为野生型拟南芥Col-0、tag1突变体以及TAG1ox转基因植株在添加了2mg/L博来霉素的培养基上的生长情况；图4B为野生型拟南芥Col-0、tag1突变体以及TAG1ox转基因植株的根生长情况；结果可见，与野生型对照Col-0相比，tag1突变体植株的根生长被博来霉素严重影响，而TAG1ox转基因植株的根明显较长。表明TAG1基因在DNA断裂损伤修复方面具有重要的功能。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.TAG1基因在调控植物叶片衰老进程中的应用，其特征在于，所述TAG1基因序列如SEQID NO:1所示。

2.TAG1基因在增强植物对博来霉素耐受中的应用，其特征在于，所述TAG1基因序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1至2任一所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥。

4.一种调控植物叶片衰老进程的方法，其特征在于，包括调控TAG1基因在植物中的表达，所述TAG1基因序列如SEQ ID NO:1所示。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建重组表达载体，将SEQ ID NO:1所示基因序列的TAG1基因插入到真核细胞表达载体中；

(2)将重组表达载体转化到目的植物的细胞中，过表达TAG1基因；

(3)筛选抗性植物，得到晚衰植株。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述真核细胞表达载体为pCHF3-GFP。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转化采用农杆菌介导法。

8.根据权利要求4至7任一所述的方法，其特征在于，所述植物为拟南芥。