CN103096711A

CN103096711A - 生产抗逆植物或其前体的方法

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Publication number: CN103096711A
Application number: CN2011800386020A
Authority: CN
Inventors: M·J·威尔金森; C·M·R·洛佩兹; P·特里克尔; P·哈德利
Original assignee: Aberystwyth University
Current assignee: Aberystwyth University
Priority date: 2010-06-14
Filing date: 2011-06-14
Publication date: 2013-05-08
Also published as: US20130305415A1; AU2011266829A1; GB201009945D0; EP2579703A1; WO2011157995A1; BR112012032049A2; JP2013534818A

Abstract

提供了抗逆植物或其前体的生产方法。所述方法包含(i)使一种或多种亲本植物经历一种或多种选自与下面有关的不适宜条件的逆压条件：相对湿度、水可利用性、周期性干旱、营养、日光、风、温度、pH、外源性化学物质、化学毒素如盐、食草作用（herbivory）、预防性化学物质、肥料、病原体侵袭如细菌、真菌或病毒感染和害虫侵扰；和(ii)从所述一种或多种亲本植物生成后代。所述后代显示对一种或多种逆压条件的耐受性相对于一种或多种亲本植物增加，所述逆压条件选自与下面有关的不适宜条件：相对湿度、水可利用性、周期性干旱、营养、日光、风、温度、pH、外源性化学物质、化学毒素如盐、食草作用、预防性化学物质、肥料、病原体侵袭如细菌、真菌或病毒感染和害虫侵扰。也提供了由所述方法生产的植物或其前体，和鉴定由所述方法生产的植物或其前体的试验。

Description

生产抗逆植物或其前体的方法

背景技术

本申请涉及增加植物和/或其后代耐受一种或多种逆压（stress）的方法，特别涉及生成抗逆植物和其种子/繁殖体。

非常需要提供耐受通常不适宜环境条件植物的能力。例如，萌发芽形成显示对干旱或其他水应激耐受性有比高于其亲本增加的耐受性的农作物的种子特别有用。另外，需要生产耐受的种子/繁殖体，以用于产率目当前受有限的水可利用性所限制的产率的气候条件。

发明内容

根据本发明的一方面，提供了生产抗逆植物或其前体的方法，所述方法包含：

(i)使一种或多种亲本植物经历一种或多种选自与下面有关的不适宜条件的逆压条件：相对湿度、水可利用性、周期性干旱、营养、日光、风、温度、pH、外源性化学物质、化学毒素如盐、食草作用（herbivory）、预防性化学物质、肥料、病原体侵袭如细菌、真菌或病毒感染和害虫侵扰（infestation）；和

(ii)从所述一种或多种亲本植物生成后代，

其中所述后代显示了对一种或多种逆压条件的耐受性相对于一种或多种亲本植物增加，所述逆压条件选自与下面有关的不适宜条件：相对湿度、水可利用性、周期性干旱、营养、日光、风、温度、pH、外源性化学物质、化学毒素如盐、食草作用（herbivory）、预防性化学物质、肥料、病原体侵袭如细菌、真菌或病毒感染和害虫侵扰（infestation）。

优选地，所述后代是成年植物或其前体如种子或营养（vegetative）繁殖体。

显然，发现了通过使亲本植物经历一种或多种逆压条件，从所述亲本植物生成的所述种子或营养（vegetative）后代能显示对相同的一种或多种逆压条件耐受性增加。显然，也发现了所述后代可以对与一种或多种亲本植物所经历条件不同的一种或多种逆压条件耐受。然而，例如，暴露于略微降低的相对湿度逆压的拟南芥（Arabidopsis）属植物显示了对周期性干旱逆压增加的耐受性（见下面实施例2）。因此，在一个实施方式中，优选所述后代对一种或多种亲本植物未经历的一种或多种逆压条件有耐受性。

应理解所述术语“不适宜”是相对于所研究的植物而言，并且是相对术语。例如，就通常在培养基或高水平湿度下旺盛的植物而言，低相对湿度可以看作“不适宜”并且因此作为逆压条件。例如，粮食作物背景中，任何造成产率、可收获产率或可维持收获下降的条件可以视为“不适宜”。

优选地，所述一种或多种逆压条件选自低相对湿度、周期性干旱和葡萄孢菌属（Botrytis）感染（如灰葡萄孢菌（Botrytis cynerea））。

优选地，使所述一种或多种亲本植物经历半控制或更优选控制条件下的一种或多种逆压条件。

优选地，所述一种或多种亲本植物选自高等植物、开花植物和双子叶植物。

优选地，所述一种或多种亲本植物是作物。

优选地，所述一种或多种亲本植物属于真双子叶植物（Eudicotyledon）。优选地，所述一种或多种亲本植物是十字花科（Brassicacea）或锦葵科（Malvaceae）的成员。优选地，所述一种或多种亲本植物选自拟南芥属植物和梧桐科（Theobroma）植物，例如选自拟南芥（Arabidopsis thaliana）和可可树（Theobroma cacao）。

优选地，所述一种或多种亲本植物是开花植物(木兰门(Magnoliophyta)),和一种或多种逆压条件可能影响可收获的产率；例如，包含与水可利用性(低相对湿度或周期性干旱)、毒性化学物质(如盐)、外源性化学物质或暴露于病原体(如葡萄孢菌属（Botrytis）)或害虫相关的逆压。

优选地，本发明的方法用于在一种或多种亲本植物经历和/或没有经历的一种或多种逆压条件下，生产能产生更高产率的植物。例如，优选通过本发明方法生产的植物在选定收获时间显示增加的生物质生产、开花数目、种子数目、种子重量。

如上所述，本发明的方法能用于生产抗逆植物的前体，如种子或营养（vegetative）繁殖体。例如，本发明的一方面提供了包含下面的方法：

(i)使一种或多种亲本植物经历一种或多种选自与下面有关的不适宜条件的逆压条件：相对湿度、水可利用性、周期性干旱、营养、日光、风、温度、pH、外源性化学物质、化学毒素如盐、食草作用（herbivory）、预防性化学物质、肥料、病原体侵袭如细菌、真菌或病毒感染和害虫侵扰（infestation）；

(ii)从所述一种或多种亲本植物中生成后代前体，其中所述前体能发育成植物，所述植物显示对选自与下面有关的不适宜条件的一种或多种逆压条件耐受性相对于一种或多种亲本植物增加：相对湿度、水可利用性、周期性干旱、营养、日光、风、温度、pH、外源性化学物质、化学毒素如盐、食草作用（herbivory）、预防性化学物质、肥料、病原体侵袭如细菌、真菌或病毒感染和害虫侵扰（infestation），和/或能在所述逆压条件下生成相对于一种或多种亲本植物更高的产率。

优选地，所述前体是种子或营养（vegetative）繁殖体如扦插（cutting）。例如，所述前体可以是拟南芥种子，所述种子能生长成耐受低相对湿度和/或周期性干旱的植物。在其他示例中，所述前体是可可（可可树(Theobroma cacaoL.)）的扦插或体细胞胚，所述插枝或体细胞胚能生长成耐受低相对湿度和/或周期性干旱的植物。其他示例包含能生长成对葡萄孢属耐受性增加的植物的拟南芥种子。

优选地，本发明的方法包含杂交（即异花受粉）两个亲本植物或自花受粉一个亲本植物。在其他示例中，从已经暴露于一种或多种逆压条件的亲本植物产生营养繁殖体。

优选地，本发明方法包含从单个亲本基因型生成种子后代，例如通过自花受粉或异花受粉经处理亲本植物之一与第二（未处理）亲本植物。

应理解使亲本植物经历一种或多种逆压条件，包含使全部或部分的所述植物经历一种或多种逆压条件。例如，全部所述植物都可以暴露于低相对湿度的情况中。在单叶或其部分可以暴露于葡萄孢属感染的情况中。

根据本发明的另一方面，提供了由本文所述方法生成的植物或其前体。

如此，本发明提供了对一种或多种逆压条件耐受的植物或其前体。

本发明的另一方面涉及鉴定由本文所述方法生产的植物或其前体的试验，所述试验包含分析怀疑由所述方法生产的植物或其前体中一个或多个基因组甲基化位点的出现或缺失，其中在所述一个或多个位点甲基化的出现或缺失指示由所述方法生产的植物或其前体。

优选地，所述方法用于生产耐受低相对湿度和/或周期性干旱的植物(例如拟南芥植物)或其种子，并且在SPEECHLESS或FAMA基因或者其中之一的功能同源物上或约10kb、优选约5kb、优选约2kb内出现甲基化状态指示由本文所述方法生成的植物或种子的获得性逆压耐受性。

本发明的另一方面提供了鉴定植物或其前体的试验，所述植物或其前体耐受选自与下面有关的不适宜条件的逆压条件：相对湿度、水可利用性、周期性干旱、营养、日光、风、温度、pH、外源性化学物质、化学毒素如盐、食草作用（herbivory）、预防性化学物质、肥料、病原体侵袭如细菌、真菌或病毒感染和害虫侵扰，其中所述试验包含分析植物或其前体中一个或多个基因组DNA甲基化位点的出现或缺失，其中在所述一个或多个位点甲基化的出现或缺失指示对所述一种或多种逆压条件耐受的植物或其前体。优选地，在SPEECHLESS或FAMA基因或者其中之一的功能同源物上或约10kb、优选约5kb、优选约2kb内出现基因组甲基化指示耐受低相对湿度和/或周期性干旱的植物或其前体。

可见根据本发明，提供了通过将一种或多种亲本先前(受精/受精卵形成前)暴露于一种或多种相同逆压或不同逆压(此后也称为条件逆压)来改变植物后代应激反应的方法。

如本文详述，在一些实施方式中，后代对应激反应的改变涉及所述亲本经历的不同逆压类型。即，暴露于条件逆压引起后代对另一种逆压的反应改变。

优选地，所述后代是亲本植物的克隆繁殖体。从另一方面来说，优选在暴露于条件逆压的亲本植物的克隆繁殖体中诱导应激反应的改变。

应理解生产任一或两个亲本已经暴露于一种或多种条件逆压的作物种子以提高所述种子衍生植物的逆压耐受性。

还应理解根据本发明的方法，已经暴露于一种或多种条件逆压的植物能用于生产对一种或多种条件逆压耐受性有改变的，优选提高的营养繁殖体如扦插、微繁殖、愈合组织介导的不定芽（callus-mediated adentitious shooting）或体细胞胚胎发生。

本发明的特别优选示例包含下面这些。

优选地，为了改变(优选提高)所述种子衍生植物对水逆压(示例包括但不限于低相对湿度逆压和周期性干旱)的耐受性，生产任一或两个亲本已经暴露于低相对湿度逆压的植物种子。

优选地，为了改变(优选提高)所述种子衍生植物对低相对湿度逆压的耐受性，生产任一或两个亲本已经暴露于低相对湿度逆压的植物种子。

优选地，为了提高所述种子衍生植物对水逆压(示例包括但不限于低相对湿度逆压和周期性干旱)的耐受性，生产任一或两个亲本已经暴露于低相对湿度逆压的真双子叶（Eudicotyledonous）植物种子。

优选地，为了改变(优选提高)所述种子衍生植物对低相对湿度逆压(示例包括但不限于低相对湿度逆压和周期性干旱)的耐受性，生产任一或两个亲本已经暴露于低相对湿度逆压的真双子叶植物种子。

优选地，为了提高所述种子衍生植物对水逆压(示例包括但不限于低相对湿度逆压和周期性干旱)的耐受性，生产任一或两个亲本已经暴露于低相对湿度逆压的十字花科或锦葵科植物种子。

优选地，为了改变(优选提高)所述种子衍生植物对低相对湿度逆压的耐受性，生产任一或两个亲本已经暴露于低相对湿度逆压的十字花科或锦葵科植物的种子。

优选地，已经暴露于低相对湿度逆压的植物用于生产对水逆压(示例包括但不限于低相对湿度逆压和周期性干旱)耐受性改变(优选提高)的营养繁殖体。

优选地，已经暴露于低相对湿度逆压的植物用于生产对低相对湿度逆压耐受性改变(优选提高)的营养繁殖体。

优选地，为了改变(优选提高)所述种子衍生植物对相同生物逆压的耐受性，生产任一或两个亲本已经暴露于生物逆压（示例包括但不限于暴露于致病性真菌）的植物的种子。

优选地，为了改变(优选提高)所述种子衍生植物对相同生物逆压的耐受性，生产任一或两个亲本已经暴露于生物逆压（示例包括但不限于暴露于致病性真菌）的真双子叶植物的种子。

优选地，为了改变(优选提高)所述种子衍生植物对相同生物逆压的耐受性，生产任一或两个亲本已经暴露于生物逆压（示例包括但不限于暴露于致病性真菌）的十字花科或锦葵科植物的种子。

优选地，为了改变(优选提高)所述种子衍生植物对葡萄孢属真菌感染的抗性，生产任一或两个亲本已经暴露于葡萄孢属真菌的植物的种子。

优选地，为了改变(优选提高)所述种子衍生植物对葡萄孢属真菌感染的抗性，生产任一或两个亲本已经暴露于葡萄孢属真菌的真双子叶植物的种子。

优选地，为了改变(优选提高)所述种子衍生植物对葡萄孢属真菌感染的抗性，生产任一或两个亲本已经暴露于葡萄孢属真菌的十字花科或锦葵科植物的种子。

优选地，其亲本已经暴露于条件逆压(如上所鉴定)的植物（优选作物）的改变逆压反应造成在任何选定收获时间下改变(优选提高)的生物质生产、开花数目、种子数目、种子重量。

优选地，根据本文所述方法生产对水逆压耐受性改变的植物，根据DNA甲基化状态的变化来检测(使用标准技术测量，所述技术包括但不限于亚硫酸氢盐处理随后桑格（Sanger）或NextGen测序、高分辨率熔解曲线分析或甲基捕获和pPCR)，所述DNA编码SPEECHLESS和/或FAMA基因(或其功能同源物)和/或紧密侧接所述基因的DNA序列，其中侧翼序列是距离起始或终止密码子的优选<10kb，更优选<3kb和最优选<1.5kb。

现在根据附图来描述本发明的示例性实施方式，其中：

图1显示了低相对湿度处理*亲本的差异气孔指数(SI)与SPCH和FAMA基因的表达正相关，并且与SPCH的DNA甲基化逆相关。在低相对湿度(LRH)诱导野生型(WT)SI:然而在LRH中生长的经LRH处理亲本后代中，SI增加(ANOVA:处理P=0.001，亲本P=<0.001，相互作用P=<0.001)。在甲基转移酶突变体met1和drm1/2中消除了这个影响。所示数据是一个实验的平均值(±s.e.m.)，其中n=48。在LRH的亲本而不是后代中也诱导SPCH和FAMA气孔通路基因的表达;met1、drm1/2或siRNA突变体rdr6中LRH未显著减少SPCH或FAMA的表达。所示数据是LRH中每个靶标相对于其自身对照的三个重复试验(x轴的0线)，以[mRNA]计的平均百分比增加。亚硫酸氢盐转换后的样品序列显示了在SPCH(a-共有第一代)和FAMA(d–共有第一代)中有LRH的从头胞嘧啶甲基化，这在met1或drm1/2突变体(b和e)中没有复制。这个甲基化在SPCH中可遗传，但是在LRH中生长的LRH生长亲本的后代中丧失(a–共有第二代)。就三代显示了SPCH基因座(TAIR v.9.0)中有LRH逆压的差异甲基化模式。G1植物(第一暴露)植物在LRH逆压下于所有背景中被从头甲基化(4.25kb中其他78位点)。这些植物的后代(G2)遗传了大多数甲基化(LRH-对照)，但是当回到LRH逆压(LRH-LRH)时，基本被去甲基化。在下一代中(G3,LRH-对照-对照)有包含上游调节区和转录起始位点在内的遗传甲基化丧失，但是这个区域在第二次暴露于逆压中被遗传性重新甲基化(LRH-LRH-对照)。在图1E中，阴影区(虚线表示)指示染色体5的21584.3k-21589.3k上甲基捕获+qPCR的甲基化区域，和条指示由亚硫酸氢盐转换后454测序的甲基化碱基对(绿色=CG、蓝色=CHG、粉色=CHH背景)。黑色水平线显示了成功的454测序和方法的程度。加框区域指示亚硫酸氢盐转换后通过亚克隆和测序在碱基对分离中测试的区域，并且其中代表性的序列示于a-c；

图2显示了后代的(A)大小(收获时干重(g))和(B)产率(生产的种子数目)也受到逆压的亲本经历的影响。暴露于LRH逆压的亲本的后代显示了在LRH处理和对照条件下增加的大小和产率(ANOVA:处理P=<0.001，亲本P=<0.001，相互作用P=0.39)。这个效果是四个重复实验中来自所有暴露亲本（每个实验中n=3）的系(每个重复实验中n=48)中所有经测试后代植物的特性；

图3A和3B显示了在LRH处理*亲本实验中siRNA的浓度。24nt siRNA的总浓度在第一次暴露于LRH时增加，而在LRH处理亲本的后代于LRH逆压下生长时下降。SPCH上游(基因组中)转座因子的siRNA诱导与基因表达逆相关，并与SPCH的甲基化正相关;

图4显示了4天干旱后用低相对湿度的预处理对叶绿素含量的影响。暴露于LRH逆压的亲本后代显示了在LRH处理和经历周期性干旱时，叶绿素含量增加；

图5显示了4天干旱后用低相对湿度的预处理对植物干重的影响。暴露于LRH逆压的亲本后代显示了在LRH处理和经历周期性干旱时，最终干重增加；

图6显示了前代的非致死接种增加对灰葡萄孢菌（Botrytis cynerea）抗性。用灰葡萄孢菌处理2代植物。图片显示了与拟南芥兰兹贝格生态型（Langsberg erecta）中接种3天后真菌感染有关的病变。非接种植物的后代(A)、接种植物的后代(B)箭头指出接种的叶子。非接种植物的后代(C)、接种植物的后代(D)的接种叶子的细节；

图7显示了用限制性酶MspI分析由灰葡萄孢菌感染诱导的全部甲基化改变。使用酶组合MspI/EcoRI(对CpHpG基序甲基化敏感)限制来自五个不同拟南芥基因型(野生型–Laer，和甲基化突变体:drm1/2、chr1、cmt3-7和kyp2)接种(扁菱形)和无病原体(圆圈)(各24个样品)的DNA。处理之间没有发现显著区别。误差条显示计算的标准差；和

图8显示了用限制性酶MspI分析由灰葡萄孢菌感染诱导的全部甲基化改变。使用酶组合HpaII/EcoRI(对CpHpG和CpG基序的甲基化敏感)限制来自五个不同拟南芥基因型(野生型–Laer，和甲基化突变体:drm1/2、chr1、cmt3-7和kyp2)接种(扁菱形)和无病原体(圆圈)(各24个样品)的DNA。在基因型野生型–Laer和kyp2处理之间没有发现显著的区别。基因型cmt3-7显示了葡萄孢属感染和那些非感染的样品之间一定程度的分离（不显著）。基因型drm1/2和chr1显示了由葡萄孢属感染诱导的显著的全DNA甲基化。误差条显示了计算的标准差。

发明详述

本发明涉及生产对一种或多种逆压条件耐受的植物或其前体的方法。特别地，本发明涉及生产种子和/或营养繁殖体的方法，所述种子和/或营养繁殖体置于一种或多种次佳的生长条件(逆压)下时存活、生长和/或生产收获产品的能力提高，在“亲本”植物和未处理谱系中造成生长、存活、生物质、种子生产和/或收获产率（对作物）的显著下降。

下面列出本发明使用的方法和本发明的详细示例。

在本说明书中，以能清晰和准确说明的书面方式描述了实施方式，但是意指并且应理解，实施方式可以多种组合或分开而不偏离本发明。

本说明书中，术语“包含”和“包括”解释为指“包含…等”。这些术语不意在解释为“仅由…构成”。

本说明书中，术语“约”指加上或减去20%，更优选加上或减去10%，甚至更优选加上或减去5%，最优选加上或减去2%。

本说明书中，术语“同源物”可以指从共同祖先DNA序列遗传的，与第二基因相关的基因。所述术语可以指与另一物种的基因在结构和进化起源上相似的基因。

本说明书中，术语“繁殖体”指能用于植物繁殖目的的任何植物材料。在无性生殖中，繁殖体可以是木质、半硬木或软木插枝、叶部分或任何数目的其他植物部分。在有性生殖中，繁殖体是种子或孢子。在一种无性生殖类型微繁殖中，可以使用植物的任何部分，尽管通常是高分生组织部分，例如根和茎的末端或芽。

本说明书中，术语“营养（vegetative）繁殖体”所指后代是通过生物种子以外的植物材料衍生的单个亲本植物的克隆（即遗传上相同）后代。这与种子相反，种子通常是有性生殖的结果，即两个或更多个亲本植物的后代。

本说明书中，术语“耐受”指后代/营养繁殖体显示相比亲本植物对一种或多种逆压耐受性增加。优选这种增加是统计学显著。

实施例1：拟南芥后代中对低湿度逆压的遗传反应

发现了暴露于一种水逆压形式(低相对湿度LRH)的拟南芥植物，通过降低叶子中的气孔（孔）数目而短期响应，从而不丧失过量的水并且存活。所得的植物小，但确实存活以得到一些种子。然而，特别显著地，收集自这些植物的种子在置于相同条件下时表现更好。所述植物也更大，并且生成的种子多许多。所用植物是近交的，从而就所有意图和目的而言后代与亲本遗传上相同。因此，显著显示了对所述亲本植物施加逆压使下一代中的所述后代预先适应了相同逆压。其他逆压中观察到相似的现象(如冷和热逆压(Whittle等,2009)、UV-C光(Molinier等,2006)和病原体如细菌(Molinier等,2006)。本文所述的发明特定应用于作物中生成市售种子。另外，用于在合适逆压条件下生产市售种子批的亲本克隆/群的生长应该预先设定（pre-programme）种子的表观遗传概况以增加发芽时对相同逆压的适应能力。重要地是，所述效果没有持续很多代，并且快速消退。因此，本发明提供了不改变遗传密码而提高植物生产的方法。

叶表面的气孔口的密度和操作(开启)都受环境信号的强烈影响；它们一起控制短(分钟-小时)和长(季节-终生)时间尺度中叶对水蒸气(g)的气孔传导度（conductance）。这种塑性使植物平衡就光合作用捕获大气二氧化碳(CO₂)与尽可能减少通过蒸腾作用的水损失的冲突需求，水分利用效率(wue)在植物生命期中与叶气孔密度逆相关。近期对遗传调节气孔发育的理解有进展。控制气孔保卫细胞发育的通路涉及原表皮表皮细胞形成气孔的“默认”命运，但是一系列模式基因的表达妨碍了进入气孔谱系(和因此的保卫细胞形成)，并且因此设定气孔密度。正调节物决定进入气孔谱系和形成气孔保卫细胞的不对称分裂。使植物响应其接受的环境信号而就水分保持和碳固定维持塑性的机理尚不明了。研究了以下可能性：对植物生命早期所经历环境逆压的塑性反应会提供发育晚期或甚至在种子生成中就相似逆压预期的适应性调节。

分析了气孔通路对不同环境湿度水平的反应。在恒定的低相对湿度(LRH;45%±5)或实验控制(65%±5)湿度下，拟南芥生态型兰兹贝格（Landsbergerecta）和哥伦比亚（Columbia）从种子生长到种子收获。气孔频率（作为表皮细胞百分比的气孔指数(SI)）受LRH逆压的影响（图1）。兰兹贝格生态型中，其在每个重复的实验中减少，每次有很大影响(科恩d检验>0.80)，而wue增加。然而在经LRH处理亲本的等基因后代中，当后代暴露于相同LRH逆压(LRH-LRH)时，SI不再下降（图1）。Wue不再与SI相关，而是增加。同样地，在第一暴露世代而不是LRH-LRH植物中，LRH逆压降低了(作为参数生物质和种子数目测量)适应性（图2）。当发育中受逆压植物回到对照RH(LRH→对照)时，SI仍然降低(25%降低，P=0.028)，和当受逆压植物与对照植物杂交(LRH x对照)时，SI在LRH逆压(LRH x对照-LRH)下相比于对照植物杂交(对照x对照-LRH)增加(40%增加,P=<0.01)。所有样品植物受到的影响相似。

研究气孔通路基因的基因座DNA甲基化以观察是否受到环境的不同影响。在11气孔模式和形成基因中，就LRH下相比于对照环境，筛选DNA甲基化的差异(表1)。在SPEECHLESS(SPCH)和FAMA基因的调节和5’编码区中发现了与RH处理有关的差异甲基化(图1)。SPCH和FAMA基因是编码推定为转录因子的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)蛋白的旁系同源物（paralogue）。在有MUTE和其二聚化伙伴ICE1和SCREAM2的通路中，这些基因的表达调节原表皮细胞进入气孔谱系，并且控制随后的不对称和放大细胞分裂，最终形成气孔保卫细胞。需要SPCH来起始不对称细胞分裂，形成拟分生组织，并且FAMA调节保卫母细胞的最终分裂。在暴露于LRH的叶中，SPCH和FAMA的甲基化明显更多。拟南芥基因组中转录因子基因的5’区甲基化罕见，可能由异常表达引起或造成异常表达。两个基因的表达在LRH条件下被抑制。基因表达在DNA于LRH下甲基化时被抑制(31-58%)(图1)，并且与叶表皮上的气孔数目下降相关。

表1.气孔通路中基因的亚硫酸盐特异性PCR的引物设计。还在Col-0生态型上测试ER、ERL1和ERL2。

还使用甲基转移酶突变体研究调节气孔频率的甲基化作用。在维持胞嘧啶甲基转移酶MET1的突变体(降低的甲基化2DNA)(met1))中，LRH中SI增加，并且就SPCH和FAMA而言有处理的差异甲基化减少。LRH处理不再降低SPCH的表达，并且FAMA表达增加(图1)。结构域重排甲基转移酶1和2(drm1/drm2)的双突变体中，LRH既没有降低SI，也没有降低FAMA的表达，SPCH表达增加并且处理没有检测到差异甲基化(图1)。结构域重排甲基转移酶(DRM2)是至今已知在拟南芥中从头甲基化DNA的唯一酶。响应LRH逆压时发生SPCH和FAMA的从头甲基化。SPCH和FAMA基因座片段的单碱基分离序列显示了对称(CG)和不对称(CHH，其中H是任意碱基)背景中处理的差异甲基化(图1)。野生型(WT)中LRH下的其他不对称甲基化没有强加于drm1/2植物的任一基因座(图1)。DRM2和蛋白染色质甲基化酶（CHROMOMETHYLASE）3(CMT3)过量维持了非CG甲基化。也检查了cmt3突变体的反应，并且发现其以与WT植物相同的方式响应LRH，LRH中有降低的SI、降低的表达和增加的甲基化(数据未显示)。cmt3植物中消除了LRH诱导的FAMA非对称甲基化。所述两个基因之间的区别暗示了FAMA中的反应需要从头确立非对称甲基化，但是诱导甲基化的CG依赖性维持可能对SPCH的不同环境反应同样重要。

拟南芥中24nt短干扰RNA(siRNA)指导通过基因启动子序列单向甲基化的DRM2介导的转录因子基因沉默(TGS)：21-22nt第二siRNA的转录后基因沉默(PTGS)还与转录区域的双向甲基化有关。RNA介导DNA甲基化(RdDM)的一组突变体在对照和LRH环境中生长，从而研究siRNA介导在所观察DNA甲基化和生理反应中的作用。在TGS中，双链短RNA的合成需要RDR2(rna依赖性rna聚合酶2)。PTGS的维持和传递（transitivity）需要RDR6并且依赖于靶标基因的转录。Dicer样RNA III蛋白加工dsRNA或发夹RNA，DCL3主要作用于RDR2生成的RNA并且DCL4作用于RDR6生成的RNA；然而，有单一dcl突变体中通过四个拟南芥DCL的一些重叠和补偿性加工。LRH逆压下真正的rdr2或dcl3没有发芽；表达了两个基因(数据未显示),总体小RNA含量相较WT增加，并且尽管在低许多的水平上，幼苗中出现了24nt siRNA(图3)。有趣的是，对照处理中rdr2和dcl3突变体的气孔频率(与其背景生态型哥伦比亚（Columbia）相比)更高(数据未显示)，表明可能需要siRNA以抑制通路中一些点的气孔形成。rdr2中SPCH和FAMA保持非对称碱基处相当的非甲基化，如drm1/2(图1)，并且FAMA表达增加，确认了前面的观察。dcl4植物的两个处理中出现了21nt siRNA，但是在rdr6中没有可检测的水平(数据未显示)。SPCH或FAMA的对称或非对称背景下，rdr6中LRH诱导的甲基化整体下降，但是没有消失(图1)。SPCH和FAMA的表达在rdr6中增加(图1,确证了前面的结果)并且SI在WT对照和LRH下都增加。这些数据显示SPCH和FAMA在环境逆压下是RdDM的靶标，并且提示两个基因座能进行TGS和PTGS。

拟南芥的高通量测序数据的小RNA读数显示了定位于FAMA基因上游300bp内的7个小RNA(TAIR9中可用http://gbrowse.arabidopsis.org)。这些小RNA的表达与FAMA一起定量测试，并且鉴于rdr2植物中FAMA表达增加，其令人惊奇的与FAMA表达正相关(P=0.014,R²0.97)。SPCH的上游(和未知蛋白的预测177bp基因At5g53205)是427bp分散重复区内对应42小RNA和40bp串联重复的滚环式（rolling-curve-type）helitron家族转座子簇。认为类似这些的小转座子对沉默而言，优选通过DRM1/2依赖于RdDM。假设了这些小RNA是否会指导延伸超出转座因子(TE)的非CG甲基化以影响SPCH转录，如对drm1drm2cmt3(SDC)抑制子编码的F盒蛋白的7个串联重复和对FWA转录起始位点周围串联正向重复产生的RdDM所显示。SPCH的表达与这些siRNA亚组的表达一起测量。发现其逆相关(P=0.004,R²0.87)，从而当这些siRNA的表达上调时SPCH下调，并且SPCH在LRH中甲基化。暴露于LRH逆压时，诱导了对应SPCH基因座上游TE的24nt siRNA，并且测试的DNA甲基化延伸进入SPCH的调节和基因区。

然后检测在暴露于LRH单个亲本的等基因后代中SPCH和FAMA的甲基化，以观察其是否与基因表达和SI相关。LRH对照后代保持了SPCH编码和非编码区中的亲本甲基化状态(图1)，并且显示了相似的抑制表达。因此推断SPCH基因座的甲基化可遗传。相反地，SPCH的甲基化状态在LRH-LRH后代中丧失，从而这个基因变非甲基化和高效表达(图1)。Drm1/2后代(LRH-对照)保持未甲基化(表2)。与WT不同，cmt3LRH-对照后代在SPCH没有甲基化，但甲基化由LRH诱导（不考虑百分比）(cmt3LRH-LRH和cmt3对照-LRH植物)。

LRH-LRH植物中SPCH甲基化丧失有数个可能的原因，包含RdDM的丧失。后代等量总体RNA中，LRH-LRH植物中小RNA双链的完全互补下降(图3)，并且SPCH上游siRNA的表达下降(图3)。这提示LRH诱导的甲基化的遗传保留影响了RdDM，从而其在重复逆压下不会推进，这与cmt3植物不能传递甲基化给其后代一致。由于跨代DNA甲基化和siRNA在对照环境中没有丧失，在亲本生殖生长期中后续施加LRH逆压必须是诱发因素，而不是基因组重新设定和甲基化的再激活。

表2.在对照和低相对湿度(LRH)中SPCH基因座内和周围的甲基转移酶突变体的甲基化区(以碱基对数目计)。√指示了每个样品中与非甲基化部分相比，基因组DNA甲基化部分的实时PCR的正扩增。

此处，siRNA的丧失会引起活性去甲基化。LRH-LRH植物和cmt3突变体(LRH-对照)中丧失SPCH的遗传甲基化在对称序列中明显(图1)。来自met1后续世代的证据表明拟南芥胞嘧啶去甲基化酶的表达需要维持甲基化CG，和随后保护去甲基化的CG不受到涉及DRM2的从头再甲基化影响。全幼苗中，去甲基化DNA糖基化酶沉默抑制因子（REPRESSOR OF SILENCING）1(ROS1)的转录体在WT植物中为LRH消除，并且在SPCH的CG甲基化消除的LRH-LRH植物中检测不到，但是在跨代甲基化后代中表达(0.43X对照,P=<0.001)。去甲基化酶DEMETER(DME)的表达在WT植物中同样由LRH消除，并且在LRH亲本的甲基化后代中降低(0.74X对照)，但是在LRH-LRH中显著增加(50.3X对照)。两种去甲基化酶的表达在met1对照植物中检测不到，但在met1中通过LRH处理而相对WT增加(ROS110.3X和DME5.7X对照)。这些数据表明去甲基化在CG甲基化的协调动态模式响应逆压中的作用。LRH诱导CG甲基化，但是不能复制或维持时，可能诱导去甲基化酶以保护抵御随机、全基因组从头非对称甲基化和增加的表型异常。在SPCH基因座中，CG甲基化的丧失不引起非对称甲基化增加(图1)，但是与SPCH中甲基化CG丧失有关的siRNA转录体下降，如前面在met1中就FWA基因座所示。在拟南芥印迹基因和发育种子中，DME负责母体等位基因的活性去甲基化，其在中央细胞中的表达造成胚胎和胚乳基因组中的差异甲基化。种子发育中DME介导的差异组织去甲基化与TE(包含helitron TE残留物)的活化和抑制、差异siRNA积累和分布以及紧密相邻基因的甲基化有关。本文所示的发现强烈提示相似机理作用于气孔前体细胞中SPCH基因座的遗传甲基化。不可能排除ROS1也参与早期跨代甲基化CG的活性去甲基化，这可以解释为什么当SPCH已经去甲基化时，其在LRH-LRH种子中检测不到。然而，注意到对此类快速持续去甲基化而言，ROS1可能比其他DME家族酶更不适合。LRH中rdr2和dcl3突变体不发芽，可能需要TE有关的siRNA积累和后续RdDM以使种子在逆压下正确发育。

SPCH的遗传甲基化在跨代甲基化亲本的后代中丧失(LRH-对照-对照)(图1)并且去甲基化亲本后代中于LRH逆压下重新获得(LRH-LRH-对照)(图1)。整个靶标SPCH基因片段的可预测性(在第一世代植物中差异甲基化)在三个世代中保持较高(分别为85%、95%和80%)。SPCH转录起始位点序列重复下游的一个对称位点的甲基化状态以高保真度解释了基因和其表达的所观察处理*亲本甲基化模式。不考虑百分比或处理，重复序列本身在所有样品植物中低甲基化（图1）。在所有的检测样品和扩增子中，所述CpG在对照植物中总是未甲基化，在LRH下甲基化和LRH-对照后代中跨代甲基化(图1)。在此基础上，LRH-LRH中去甲基化的可预测性下降至71%，并且第三代甲基化的丧失和获得进一步下降至LRH-对照-对照中的55%和LRH-LRH-对照中的43%。因此，此位点处的代间LRH-诱导的甲基化的可预测性减小与去甲基化过程有关。可能SPCH遗传后在逆压下的去甲基化和重新建立甲基化的过程引起不同阶段的核组，所述核组因此具有繁殖(有丝分裂和减数分裂)中不同的甲基化状态。另一种解释是如前面提出的，去甲基化后保护胞嘧啶防止再甲基化，但是这种保护有缺陷。

与SPCH相反，FAMA中亲本植物显示的差异甲基化模式在后代中复制，从而FAMA在所有LRH植物中甲基化(图1)。小部分(5%)LRH-对照后代中有FAMA遗传甲基化的证据，但是这更加不可预测。FAMA的差异甲基化主要由植物发育中经历的生长条件决定，并且与SPCH中不同，仅微弱遗传。基因CG的甲基化在LRH-LRH中出现，在LRH-对照植物中相对第一代WT对照缓解，并且在rdr6(但不是rdr2)中消失(图1)。这个甲基化可以是减数分裂中不常释放的、更老的PTGS事件的标记。测试的siRNA在LRH-对照后代中仍然出现，并且与FAMA表达正相关(P=0.035,R²=0.80)，除了现在与FAMA mRNA逆相关的基因21nt siRNA的转录体(P=0.006,R²0.98)。所述实验表明逆压诱导的RdDM和随后的减数分裂可在所述基因甲基化释放中起作用。烟草中，出现PTGS衍生的基因甲基化没有影响FAMA表达和其释放。在所有处理*亲本条件下，FAMA表达与SPCH和最终SI的表达高度相关。这能由气孔通路中FAMA和其他上游基因间的相关作用来解释，所述FAMA和其他上游基因以剂量依赖性方式推动后续分裂，包含SPCH和FAMA的ICE1.SCRM2异二聚体伙伴以及SPCH本身。LRH-LRH植物中FAMA增加的表达很大程度上由SPCH表达增加引起，而不是由FAMA的从头甲基化引起，与siRNA补体的CG甲基化丧失和降低后的SPCH去抑制一致。与SPCH→FAMA气孔发育通路相互作用的促分裂原活化蛋白质激酶信号级联中的两个逆压相关激酶(MKK7和MKK9)也已经显示有相反的作用，根据其是否由谱系定义阶段的SPCH启动子或保卫母细胞中的FAMA启动子驱动。能诱导气孔发育的通常抑制物以提高气孔形成分裂。本文所述数据提供证据显示一旦定向于植物学中SPCH的气孔谱系，大部分拟分生组织会形成功能保卫细胞，并且这是由于至少SPCH和FAMA的协调表达。尽管SI增加时LRH-LRH植物的g降低，在这些植物中没有注意到比WT更多的异常气孔肿瘤、气孔的畸形前体或聚集。SPCH还调节气孔模式通路中数个基因的表达，并且是YDA介导MAPK信号级联结束时MPK3和MPK6磷酸化的底物。因此SPCH似乎就协调的发育和环境信号而言是重要的中心，本身通过RdDM响应环境逆压。

提出SPCH上从头和遗传甲基化与去甲基化的精细相互作用有效地针对其亲本所经历气孔发育的相同逆压“免疫”所述后代。这能解释由靶标DNA甲基化介导的跨代“适应印迹”反应。

LRH-LRH和LRH-对照后代显然在增加生物质和种子生产方面有益处(图2)。根据其亲本的经历改变这些后代的适应性概况。拟南芥是自体授精的一年生草种，相比于群间变化通常在其群内有非常低的基因变化。因此，局部地，群必须严重依赖于塑性回弹以适应生长条件的波动。由上下文可见，根据亲本的经历调节默认生理反应的能力对近交群而言可以有相当多的优势以缓解局部基因变化的缺失。预期最强烈应用于近交或单性生殖的多年生植物中，其中个体在很多季节中反复暴露于环境波动。

方法-概要

提供的拟南芥(L.)Heynh兰兹贝格生态型种子在低(45%)和对照(65%)相对湿度(RH)生长室中生长，并且收集种子。两个处理中从单个亲本收集的种子在低和对照RH中与未处理种子和就数种已知甲基转移酶突变体提供的种子一起生长。这个实验重复四次；提供的已知RNAi突变体的种子在第四次重复实验中生长。每次，气孔密度(气孔mm^-2)和指数(形成气孔的表皮细胞百分比)通过远轴叶面(abaxial leaf surface)印记的显微镜检测在相同生长阶段评价。评价衰老后的植物干重、种子重量和种子数目。样品DNA的亚硫酸盐转换后，由气孔形成通路中已知基因PCR产物的高分辨率熔解曲线(HRM)分析来筛选有处理的差异甲基化和百分比。通过捕获样品基因组的甲基化部分和就感兴趣基因的300bp片段进行所得DNA的qPCR来分析靶标基因的全长和上游的差异甲基化。所研究靶标基因区≥32克隆的PCR片段亚硫酸盐测序证实了单碱基分离甲基化概况。通过多重串联qPCR(MT-qPCR)测量幼苗RNA中SPCH和FAMA的表达水平。通过双标准曲线分析相较对靶标基因效率相等的持家基因分析MT-qPCR数据。分析多个siRNA表达，所述分析是通过富集小RNA部分与定制合成探针的溶液杂交和RNA酶消化以及随后保护探针的电泳分离和定量。

方法–植物和生长环境

NASC(英国诺丁汉)提供了拟南芥(L.)Heynh.生态型兰兹贝格(Ler参考号NW20)和哥伦比亚(Col-0参考号N1092)、MET1甲基转移酶突变体((降低的甲基化2DNA、met1参考号N854300)、染色质甲基化酶(cmt3参考号N6365)和结构域重排甲基转移酶1/2(drm1/drm2参考号N6366)和RNAi突变体的RNA依赖性rna聚合酶2(rdr2参考号N850602)、RNA依赖性rna聚合酶6(rdr6参考号N24285)、Dicer样3(dcl3参考号N505512)和Dicer样4(dcl4参考号N6954)的种子。种子于幼苗堆肥(英国林肯市的辛克莱（Sinclair）)中播种，在受控环境生长箱(英国柴郡布雷德伯里的Saxcil,R.K.Saxton)中发芽和生长直到收获，生长过程根据ARBC指南，除了一个箱子的相对湿度控制在45%±5而另一个维持在65%±5。64天后，阶段9.70，从每个个体收集种子。收获的Ler种子，提供的Ler种子(如前)和提供的突变体的种子(如前)如前（除了交换生长箱和没有应用层化）播种、发芽和生长。在所述4个重复实验中各使用不同的(旋转)生长室以适应生长室效果(英国拉夫堡的三洋公司（SanyoGallenkamp)）。通过一系列分层网格脱粒后，称重单个收获植物的全部干生物质和种子质量并且种子计数，使用爱普生（Epson）Perfection3170扫描仪捕获收集种子的数字图像(英国赫默尔亨普斯特德（Hemel Hempstead）的爱普生（Epson）(英国))然后使用ImageJ软件1.37版本分析颗粒(美国的免费软件NIH)。

方法–气孔分析

通过在每个重复实验的相同生理阶段(6.50)中生成来自48个植物(来自处理*亲本实验中各3个单独亲本的各16个复制植物)的一个成熟莲座叶(插入6-8,长度约40mm)和一个茎生叶(插入13-15,长度约15mm)的整个远轴叶面印记，测定气孔密度(气孔mm^-2)和指数(形成气孔的表皮细胞百分比)。然后使用AxioVision3.1(英国牛津郡的图像联合公司（Image Associates）)软件从连接有Axiocam照相机的Axioscope2显微镜(卡尔蔡司有限公司（Carl Zeiss Ltd）)捕获数字图像，并且使用ImageJ软件计数每单位面积的气孔和其他表皮细胞数目(如前)。在环境RH于黑暗中预先调节12小时的6个复制植物中，使用有拟南芥叶室的Lc_pro+红外气体分析仪(英国Great Amwell的ADC生物科学公司（ADC BioScientific）)测量气体交换(气孔传导度（conductance）对水蒸气和瞬时叶水平水利用效率)。

方法–DNA甲基化分析

来自≥12复制植物的全部幼苗(第一真叶阶段)、成熟和非成熟叶子速冻于液氮并且存储于-80°C。根据生产商说明书，使用Dneasy植物小试剂盒(英国凯杰公司（Qiagen）)提取DNA。然后，根据生产商说明书使用EZ DNA甲基化试剂盒(加利福尼亚州橙县的ZR研究公司（Zymo Research）)通过亚硫酸盐处理修饰2μg基因组DNA。1比5稀释去磺化的DNA。高分辨率熔解曲线(HRM)分析用于分析差异甲基化，用如Wojdacz,T.K.和Dobrovic,A.Methylation-sensitive high resolution melting(MS-HRM):a new approach forsensitive and high-throughput assessment of methylation（在甲基化敏感的高分辨率熔解曲线(MS-HRM):敏感和高通量评价甲基化的新方法）.Nucleic AcidsRes.35,第6e41号(所述内容通过引用全文纳入本文)中的处理，除了每个20μl反应混合物包含1x Biomix(英国伦敦比奥立公司（Bioline）),25μM Syto9染料(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司（Invitrogen）)和300nM感兴趣基因的各正向和反向亚硫酸盐特异性引物。使用的PCR扩增条件是:95°C2分钟，然后50轮95°C15秒和50°C30秒循环，60°C保持1分钟和以0.5°C秒^-1来自58-80°C的HRM。对每个基因，包含未处理的基因组DNA（1比1000稀释）作为阳性对照，使用等价（但不是亚硫酸盐特异性）引物。使用RotorGene^TM6000系列软件1.7版本(英国剑桥郡的英国CR有限公司（CorbettResearch）)以80%置信区间鉴定有处理的差异甲基化。对推定鉴定为差异甲基化的基因重复6-8次试验。

指示SPCH和FAMA基因中差异甲基化的阳性结果通过使用Methylamp甲基化DNA捕获试剂盒(英国剑桥的Epigentek,剑桥生物科学公司（CambridgeBioscience）)捕获基因组DNA的甲基化部分和使用试剂盒提供的阴性对照(Ig小鼠抗体)进行比较qPCR分析来证实。随后，设计引物以靶定编码区中每一个300bp，用于SPCH和FAMA基因(5’)上游区的600bp和SPCH的2.3kb上游基因组区。qPCR和HRM条件如上所述，除了使用15ng模板DNA，T_a是56°C和66°C持续6分钟的延伸期取代1分钟保持;来自68-90°C的HRM。

通过亚硫酸盐处理和PCR后，对三个集中（pooled）复制植物(英国诺丁汉的Geneservice,SB公司（Source Bioscience PLC）)测序每样品≥32克隆扩增子(载体pCR2.1;加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司（Invitrogen）)来获得碱基对分离甲基化概况，如上所述，除了在亚硫酸盐处理前将用于各个PCR产物的有甲基化和非甲基化胞嘧啶的5nM经标记合成DNA(英国吉林汉姆的西格玛-艾尔德里奇公司（Sigma-Aldrich Ltd.）)加入到2μg样品DNA以作为完全亚硫酸盐转化的阳性对照。根据未修饰基因组DNA序列和处理之间胞嘧啶转化成胸腺嘧啶的比较来评价差异甲基化。使用ClustalW2比对序列且预测性使用BioEdit v.7.0.9.0计算为逆熵。

每轮HRM、qPCR和PCR后，分析产物样品的大小准确性和纯度，使用安捷伦生物分析仪系列（Agilent Bioanalyzer Series）II DNA1000芯片(英国Winnersh的安捷伦公司（Agilent）)。

方法–RNA表达分析

使用RNeasy植物小试剂盒(英国凯杰公司（Qiagen）)根据生产商说明书从冷冻叶材料中分离总RNA。对靶标基因SPCH和FAMA以及内部对照基因PP2A和SAND设计多重串联PCR(MT-PCR)引物。如Stanley,K.K.和Szewczuk,E.Multiplexed tandem PCR:gene profiling from small amounts of RNA usingSYBR green detection（多重串联PCR:使用SYBR绿色检测的少量RNA的基因概况）Nucleic Acids Res.33,20e180(2005)(所述内容通过引用全文纳入本文)使用500ng起始RNA进行MT-PCR，除了使用Sensimix(英国伦敦Quantace公司)逆转录酶和缓冲液，和逆转录在45°C进行15分钟然后70°C15分钟。在ABI9700热循环仪中使用Sybr Premix Ex Taq聚合酶(法国圣日耳曼昂莱的宝生物欧洲公司（Takara Bio Europe）)和各个引物200nM终体积进行第一轮多重扩增。PCR在下列条件下进行:95°C1分钟，10-15轮95°C15秒、58°C20秒和72°C15秒循环，然后72°C7分钟。1:1稀释预扩增产物，和用SybrPremix Ex Taq(如前)和内部引物和1μl模板cDNA准备第二轮PCR。在RotorGeneTM6000热循环仪(英国剑桥郡的英国CR有限公司（CorbettResearch）)中使用以下条件进行qPCR:95°C1分钟，然后40轮95°C10秒、60°C20秒和72°C8秒以及0.5°C s^-1下来自70-96°C的HRM。在对感兴趣和对照完成的三重和系列稀释中准备所有反应。RotorGeneTM6000系列软件1.7版本用于测定基因扩增效率和RNA定量(如前)，使用双标准曲线法。

每轮PCR和qPCR后，分析产物样品的大小准确性和纯度，使用安捷伦生物分析仪（Agilent Bioanalyzer）DNA1000芯片和试剂盒(如前)。

方法–siRNA分析

总RNA使用mirVana miRNA分离试剂盒(英国沃灵顿的安碧公司（Ambion）)根据生产商说明书从幼苗样品中分离，使用安捷伦生物分析仪RNA6000Nano和小RNA芯片和试剂盒(英国Winnersh的安捷伦公司)针对小dsRNA标准(英国希钦的NEB公司（New England Biolabs）)检测和定量。使用分离试剂盒(如前)对小RNA部分富集每个样品的200ng总RNA。使用mirVana探针构建试剂盒(英国沃灵顿的安碧公司)对SPCH、FAMA和局部smRNA设计和构建不同nt长度的未标记反义RNA探针；使用mirVana检测试剂盒(英国沃灵顿的安碧公司)根据生产商说明书在每个反应中检测≤四个探针。使用安捷伦生物分析仪小RNA芯片(如前)和小dsRNA标准梯度(如前)对探针进行后标记并荧光观察。

方法–引物设计

DNA甲基化、RNA和siRNA分析的引物设计包含在表1和3-5。所有引物使用Primer3软件设计；亚硫酸盐特异性引物基于来自MethPrimer软件的返回、亚硫酸盐特异性序列。

表3.未修饰基因组DNA(等同于分析的亚硫酸盐特异性区域)的引物。这些引物还在捕获甲基化DNA后用于qPCR。

表4.454测序的酶捕获和扩增DNA后，甲基化基因组DNA的qPCR引物。

表5.由¹⁵设计和使用气孔发育和内源性对照基因的MT-qPCR引物，ROS1和DME的qPCR引物。RDR2的qPCR引物是RDR2F(5’-GGGTCCAGAGCTTGAGACTG-3’(SEQ ID NO:113))和RDR2R(5’-CCCTTCTCCAAGGATTGACA-3’(SEQ ID NO:114))。DCL3-1的qPCR引物是DCL3F(5’-GTCTTTGAGCCGTTGCTTTC-3’(SEQ ID NO:115))和DCL3R(5’-GTGAAGCTGCTTTTCCCAAG-3’(SEQ ID NO:116))。测定甲基转移酶突变体基因型的引物是在^23-25，就DRM2而言侧接插入AAGTGGCACTTCATCGTCTCCCAATCAAAATGAAGCT(SEQ ID NO:117)(GenBank登录CC887813)。siRNA分析的反义探针设计成从拟南芥小RNA计划数据库(http://asrp.cgrb.oregonstate.edu/)^19,36-40下载的小RNA序列以用于FAMA的3:8714.3k..8721k区域和SPCH的5:21601k..21611.4k f区域。在这个数据库中，SPCH当前定位在5:21603.8k。加入其他(A)碱基以人工创造不同长度的探针。FAMA RNA的反义探针是CUUCUGCCGUAAACCUCGUUUCACUUGaaaa(SEQ ID NO:118)且SPCH的反义探针是UUAAGUGCUCGUUCAUUUGCUUUCUCCGaaaa(SEQ IDNO:119)。

实施例2：拟南芥中由低相对湿度诱导的遗传获得性干旱耐受性。

当亲本植物在对照相对湿度下生长时，施加短时间干旱造成叶绿素含量(图4;Gen1对照RH)和总植物干质量(图5;Gen1对照RH)的明显和显著降低。相反，当相同基因型在恒定低相对湿度(LRH)下生长时，施加相同周期性干旱确实造成叶绿素含量相对于未干旱对照下降(图4;Gen1LRH)且令人惊讶地与最终干质量增加有关(图5;Gen1对照RH)。来自暴露于对照相对湿度的植物收集种子生成的后代在对照条件下表现相似，叶绿素含量(图4;对照-对照)和最终干生物质(图5;对照-对照)显著下降。明显的是，来自暴露于低相对湿度的亲本植物收集种子生成的后代在暴露于相同周期性干旱时，显示叶绿素含量的显著增加(图4;LRH-对照)和总干生物质的相似显著增加(图5;LRH-对照)。因此，所述亲本暴露于LRH正面改变了后代对周期性干旱的反应。甚至更加明显的是，在低相对湿度下生长的亲本植物后代在暴露于与亲本相同水平的低相对湿度时，其变得在叶绿素含量(图4;LRH-LRH)和干生物质(图5;LRH-LRH)方面对周期性干旱不敏感。出乎意料的是，当在对照条件下生长时，在叶绿素含量(图4;LRH-对照-对照)和生物质(图5;LRH-对照-对照)方面，第一代的低RH预先调节作用没有遗传给第三代。暴露于两个连续LRH条件然后是有和没有干旱的对照的第三代后代表现与LRH-对照处理基本相似(图4和5)。从头甲基化(drm1/2)和甲基化(cmt3)(冗余（redundantly）)维持的突变体在对照RH下受干旱的影响相似，但是只有drm1/2突变体被低RH预先调节拯救。因此，亲本植物暴露于可变相对湿度条件导致同代和后代中对周期性干旱的表观遗传学反应改变。

方法–植物和生长环境

NASC(英国诺丁汉)提供了拟南芥(L.)Heynh.生态型兰兹贝格(Ler参考号NW20)、染色质甲基化酶(cmt3参考号N6365)和结构域重排甲基转移酶1/2(drm1/drm2参考号N6366)的种子。种子于幼苗堆肥(英国林肯市的辛克莱（Sinclair）)中播种，在受控环境生长箱(英国柴郡布雷德伯里的Saxcil,R.K.Saxton)中发芽和生长直到收获，生长过程根据ARBC指南，除了一个箱子的相对湿度控制在45%±5而另一个维持在65%±5。收获的Ler种子、提供的Ler种子(如前)和提供的突变体种子(如前)在前面对照RH下播种、发芽和生长，除了40天后每个基因型的一半所述植物通过停水4天进行干旱处理。这个处理后，重新开始浇水，直到在第64天从每个个体收获种子(阶段9.70)。交换生长箱，并且没有应用层化。在所述4个重复实验中各使用不同的(旋转)生长室以适应生长室效果(英国拉夫堡的三洋公司（Sanyo Gallenkamp)）。每次，气孔密度(气孔mm^-2)和指数(形成气孔的表皮细胞百分比)通过远轴叶面印记的显微镜检测在相同生长阶段评价(如上所述)。通过一系列分层网格脱粒后，称重单个收获植物的全部干生物质和种子质量并且种子计数，使用爱普生(Epson)Perfection3170扫描仪捕获收集种子的数字图像(英国赫默尔亨普斯特德的爱普生(Epson)(英国))然后使用ImageJ软件1.37版本分析颗粒(美国的免费软件NIH)。

实施例3：拟南芥后代中对病原体灰葡萄孢菌增加的遗传抗性

发现了当接种灰葡萄孢菌致病菌株时，拟南芥植物通过激活特异疾病抗性基因表达而短期响应。同时，也改变了植物基因组的全甲基化模式。然而，特别显著地，从这些植物收集的种子在接种时有对病原体更高的抗性。使用的所述植物是近交的，从而就所有的意图和目的而言，后代与亲本遗传上相同。

播种第二代野生型植物以比较是否任何甲基化水平改变传给了下一代。形态学数据揭示了在野生型兰兹贝格基因型中存在对灰葡萄孢菌的跨代获得性抗性增加，而甲基化突变体都没有显示所述抗性增加(图6)。用灰葡萄孢菌处理代2植物。图片显示了与拟南芥兰兹贝格生态型（Langsberg erecta）中接种3天后真菌感染有关的病变。非接种植物的后代(A)、接种植物的后代(B)箭头指出接种的叶子。非接种植物的后代(C)、接种植物的后代(D)的接种叶子的细节。

表6.接种三天后，估计拟南芥兰兹贝格生态型(野生型-Laer)和甲基化突变体drm1/2(Drm)、chr1(Chr)、cmt3-7(Cmt)和kyp2(Kyp)中对灰葡萄孢菌的抗性。Cont:非接种植物的后代，Bot:接种植物的后代。较浅阴影指示对病原体的抗性，较深阴影是基于形态学分析的易感性。

灰葡萄孢菌感染诱导的全甲基化改变的MSAP分析(用对CpHpG基序上甲基化敏感的酶组合MspI/EcoRI)没有显示感染和非感染植物之间显著的差异(图7)。相反地，当使用酶组合HpaII/EcoRI(对CpHpG和CpG基序上的甲基化敏感)时，基因型drm1/2和chr1显示了由葡萄孢属感染诱导的全DNA甲基化的显著改变。令人惊讶的是，在基因型野生型–Laer和kyp2处理之间没有发现显著的区别。而基因型cmt3-7显示了葡萄孢属感染和那些非感染的样品之间一定程度的分离（不显著）（图8）。显然，观察到的与葡萄孢属感染有关的全DNA甲基化改变呈现与上述获得性抗性增加逆相关。这些结果表明DNA甲基化的维持对生成获得性抗性是必需的。

方法–植物和生长环境

拟南芥(L.)Heynh.生态型兰兹贝格(Ler参考号NW20)和染色质重塑ATP酶突变体(CHR1参考号N30937)、染色质甲基化酶(cmt3参考号N6365)和结构域重排甲基转移酶1/2(drm1/drm2参考号N6366)和Kryptonite2(KYP-2参考号N6367)的种子从欧洲拟南芥库存中心获得。

根据ARBC指南，植物于24孔盘（每个4cmx4cm孔中有1株植物）幼苗堆肥(英国林肯市的辛克莱（Sinclair）)中生长，在受控环境生长箱(英国柴郡布雷德伯里的Saxcil,R.K.Saxton)中发芽和生长直到收获。除去一个孔使底部注水。在转移到受控环境生长室中的实验条件前，种子在4°C发芽，并且在玻璃下生长1周。所述植物在22°C8小时光周期（约70μmol/m²/s）下生长以抑制开花。64天后，阶段9.70，从每个个体收获种子。通过一系列分层网格脱粒后，称重单个收获植物的全部干生物质和种子质量并且种子计数，使用爱普生(Epson)Perfection3170扫描仪捕获收集种子的数字图像(英国赫默尔亨普斯特德的爱普生(Epson)(英国))然后使用ImageJ软件1.37版本分析颗粒(美国的免费软件NIH)。

零代(G0)

为了均化和标准化跨植物材料中甲基化的水平，0代（每个基因型5个植物）在标准条件下生长：在100μmol m-2s-1光强度下24°C短天数(8h光/16h黑暗)。这使得排除了由于可变种子存储条件产生的任何可能表观遗传学变化。从每个0代基因型的各单个植物获得的种子用于后续部分实验-第一代(G1)生长。从单个个体收集种子以保证跨植物材料的最大水平遗传均匀性。收获的Ler种子、提供的Ler种子和收获的突变种子提供突变体的种子。除了交换生长箱外，种子如前播种、发芽和生长。

第一代(G1)

种植4个盘（92株植物）。种植盘就两个不同的处理（用灰葡萄孢菌和对照接种）随机分配。发芽后五周，植物用死体营养型灰霉病真菌（灰葡萄孢菌(Botrytis cynerea)）(菌株iMi169558,英国裘园的国际真菌学研究所)接种。植物用1x10⁵孢子mL^-1悬浮液处理，通过使用移液管将2滴液滴直接置于5号叶（leaf number five）的上面(为了确保其在同一发育阶段)。接种后7天，从每个处理的一半植物中取样叶6，并且弃去取样的植物。从剩余个体中的5个收集种子，并且集合以获得处理诱导的表观遗传学变异性的显著代表。收获的Ler种子、提供的Ler种子和收获的突变种子提供突变体的种子。除了在后续部分实验-第一代(G2)生长中交换生长箱外，种子如前播种、发芽和生长。

第一代(G2)

种植8个盘（184株植物）。如上所述，种植盘就两个不同的处理（用灰葡萄孢菌和对照接种）随机分配。如上所述，再接种从处理和未处理植物所得种子产生的植物（见表6）。接种5天后，对每个基因型-G1-G2处理组，对全植物和接种叶拍照用以存档和图像分析。通过测量灰葡萄孢菌接种产生伤口的大小和强度，评价真菌感染的易感性或抗性。接种后7天，从每个处理的一半植物中取样叶6，并且弃去取样的植物。从剩余个体中的5个收集种子，并且集合以获得处理诱导的表观遗传学变异性的显著代表。观察第2代植物，特别是在相同G2处理组中与不同背景（G1处理）有关的形态学改变。

表7.

处理/世代	对照G1	葡萄孢属G1
			对照G2	CC	BC
葡萄孢属G2	CB	BB

方法-DNA提取

使用Qiagen的试剂盒按照生产商说明书进行所有的DNA提取。

植物小试剂盒用于从每个处理46株植物中23株的拟南芥样品中提取DNA。下面讨论的试剂都来自这个试剂盒。

在1.5ml微量离心管中于液氮内使用一把剪刀破坏约100mg植物组织。立刻，不使组织融化，每管加入预热到65°C的400μl裂解液AP1和4μl RN酶A。通过翻转混合内容物，并且在65°C孵育10分钟，每2-3分钟偶尔混合。

然后，130μl AP2缓冲液加入到每个样品中，并且所述管在冰上孵育5分钟以沉淀蛋白和多糖。然后在13,000rpm离心管5分钟以沉淀粘稠层和其他固体。

然后上清液转移到QIAshredder^TM柱（有硅胶基质）并且在13,000rpm离心2分钟以除去沉淀和细胞碎片。收集柱流出液并转移到新鲜管中，然后与0.5体积洗涤缓冲液和1体积乙醇混合。这个混合物转移到第二DNeasy小离心柱和在8,000rpm离心1分钟。由于DNA分子保留在柱中，丢弃所述流出液。通过8,000rpm离心1分钟，使500μl洗涤缓冲液AW流过柱来洗涤结合的DNA两次。

然后，在加入预热到65°C的100μl缓冲液AE和室温孵育5分钟后，通过13,000rpm离心1分钟来干燥所述膜。

方法-琼脂糖凝胶定量

等分试样DNA(1-5μl)进行1%(w/v)琼脂糖凝胶电泳以测定存在的DNA质量和数量。在合适体积的1x TAE缓冲液（40mM tris-乙酸酯,1mM EDTA）中溶解合适量的琼脂糖，然后微波炉中加热直到琼脂糖熔化以制备所述凝胶。所述凝胶溶液冷却到约50°C后，加入10mg/ml溴化乙啶溶液到终浓度0.35μg/ml，并且然后倒入灌胶盘中，放置合适的梳子以产生点样孔。

当设置时，所述凝胶转至水平电泳设备，凝胶梳在阴极末端。移出所述凝胶梳，向电极室加入充足1x TAE缓冲液以覆盖凝胶约1mm。制备的DNA样品(5μl DNA:1μl蓝色上样染料[0.23%(w/v)溴酚蓝,60mM EDTA,40%(w/v)蔗糖])随后加入到凝胶孔中。HyperLadderII(比奥立，BIO-33040)大小标记加入到侧面泳道。所述凝胶用恒定电压3-5V/cm进行电泳15-60分钟。所述DNA用UV透照器(320nm波长)观察。

方法-甲基化敏感扩增片段长度多态性

甲基化敏感扩增片段长度多态性(AFLP)在每个处理随机选择的8个DNA样品中进行，并且基于Vos等(1995)描述的AFLP方案，但使用同裂酶靶向相同识别基序。

所述技术的基础是通过聚合酶链反应(PCR)扩增来检测基因组DNA的限制性片段。这能使用有限的基因引物组从任何来源或复杂性的DNA中创建指纹，并且不需要序列的先验知识。使用对甲基化敏感的限制性酶使此方法适于检测甲基化。

用2个限制性酶限制DNA，一个酶罕见且一个是对胞嘧啶甲基化敏感的常见切割酶。使用对不同胞嘧啶甲基化类型敏感的常见切割酶的同裂酶进行2种不同的限制。所有酶获自加拿大的Fermentas公司。

MspI酶：在序列5’CCGG3’的两个胞嘧啶之间切割，并且通过在第一个C而不是第二个C上甲基化来防止其作用。

HpaII酶：在序列5’CCGG3’的两个胞嘧啶之间切割，并且通过在第二个C而不是第一个C上甲基化来防止其作用。

表8–限制性反应

将对限制性位点特异的衔接子连接到DNA上以使用基因引物扩增片段，而不首先需要获得序列信息。所有酶来自Fermentas，而衔接子来自西格玛吉诺思有限公司（Sigma-Genosys）。

表9–衔接子结构

通过组合1nM EcoRI衔接子和10nM MspI/HpaII衔接子生成衔接子混合物。

表10–连接反应

使用对应EcoRI末端的一个寡核苷酸引物和对应MspI/HpaII末端的一个寡核苷酸引物进行扩增轮。通过在引物的3’末端加入一个多余的碱基，第一轮扩增降低可能的片段数目，而通过在引物的3’末端加入一个或两个其他碱基，第二轮扩增进一步降低可能的片段数目。第二轮EcoRI引物用6-Fam（羧基荧光素）标记以能观察所述产物。

表11–预扩增引物

表12–预扩增PCR混合物

限制酶切+连接DNA(1/5)	3μl
		PCR待用混合物	10μl
EcoRI引物+A(10μM)	0.8μl
		HpaII/MspI引物+A(10μM)	0.8μl
水	5.4μl

表13–预扩增PCR程序

表14–选择性扩增引物

表15–选择性扩增PCR混合物

扩增前DNA(1/15)	5μl
		PCR待用混合物	10μl
EcoRI引物+AX(10μM)	0.8μl
		HpaII/MspI引物+AXX(1μM)	1μl
水	3.2μl

表16–选择性扩增的降落PCR程序

在应用生物系统公司（Applied Biosystems）的遗传分析仪上运行选择性扩增步骤的产物。所述结果使用GeneMapper分析软件观察和解释，并且输出到Microsoft Excel用于进一步分析。

AFLP方案中的每个条带认为是单个基因座的单个等位基因。就每个处理而言，每个基因座的等位基因特性首先以简单定性方式1(出现)或0(消失)对每个重复个体赋值。如果三个或更多个体的基因座的个体等位基因概况不同(例如11111111对比11111000会视作不同，而11111111对比00111111则不会)，认为基因座在应激处理对之间或者对照和应激处理之间不同。使用GenAlex(http://www.kovcomp.co.u/mvsp/)进行多变量分析(主坐标分析)。

由于AFLP标记的主导本性，在出现/消失评分中没有捕获个体之间的表观遗传学变化部分(例如，由于细胞类型特异性甲基化改变)。然而，这些改变可能对片段峰值强度中有意义的变化起作用。尽管起始片段拷贝数目和峰高度的关系不是线性(例如由于AFLP方案中的PCR步骤)(Rodriguez Lopez等2004,Verhoeven等2009)，强度数据可以包含至少一些能用定量分析捕获的表观遗传学变化的生物学信息(Castiglioni等,1999;Klahr等,2004)。因此第二方法用于定量分析更小组的MS-AFLP标记(出现/消失评分中的单形性)，其中使用GeneMapper_软件获得片段强度评分。通过将每个片段峰高度评分除以每个样品获得的所有片段的总荧光值来标准化原始强度评分。这个标准化说明样品之间强度评分的整体差异，例如由样品之间起始DNA浓度的轻微不同引起。标准化的强度使用Minitab15进行主成分分析(http://www.minitab.com/en-GB/default.apsx?WT.srch=1&WT.mc_id=SE004815)。

应当理解，本领域技术人员清楚了解可以对本文所述的目前优选的实施方式进行各种改变和改良。可以在不偏离本发明精神和范围并且不减少本发明伴随优势的情况下，进行这些改变和改良。因此意在所附权利要求书包括这些变化和改良。

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Claims

1.一种生产抗逆植物或其前体的方法，所述方法包含

(ii)从所述一种或多种亲本植物生成后代，

其中所述后代显示对一种或多种逆压条件的耐受性相对于一种或多种亲本植物增加，所述逆压条件选自与下面有关的不适宜条件：相对湿度、水可利用性、周期性干旱、营养、日光、风、温度、pH、外源性化学物质、化学毒素如盐、食草作用（herbivory）、预防性化学物质、肥料、病原体侵袭如细菌、真菌或病毒感染和害虫侵扰（infestation）。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述后代是成株植物或其前体。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述后代是种子或营养(vegetative)繁殖体。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述后代对一种或多种亲本植物经历的一种或多种逆压条件有耐受性。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述后代对一种或多种亲本植物未经历的一种或多种逆压条件有耐受性。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述一种或多种亲本植物经历选自低相对湿度、周期性干旱和葡萄孢菌属（Botrytis）感染（如灰葡萄孢菌（Botrytis cynerea））的一种或多种逆压条件，和/或其中所述后代对选自低相对湿度、周期性干旱和葡萄孢菌属（Botrytis）感染（如灰葡萄孢菌（Botrytis cynerea））的一种或多种逆压条件显示增加的耐受性。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述一种或多种亲本植物选自高等植物、开花植物和双子叶植物。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述一种或多种亲本植物是作物。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述一种或多种亲本植物属于真双子叶植物，优选其中所述一种或多种亲本植物是十字花科（Brassicacea）或锦葵科（Malvaceae）家族的成员，优选其中所述一种或多种亲本植物选自拟南芥属（Arabidopsis）植物和梧桐科（Theobroma）植物，例如选自拟南芥（Arabidopsis thaliana）和可可树（Theobroma cacao）。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述后代在选定收获时间显示相对于一种或多种亲本植物增加的生物质生产、开花数目、种子数目和/或种子重量。

11.一种如前述权利要求中任一项所述方法生产的植物或其前体。

12.一种鉴定由权利要求1-10中任一项所述方法生产的植物或其前体的试验，其中所述试验包含分析怀疑由所述方法生产的植物或其前体中一个或多个基因组甲基化位点的出现或缺失，其中在所述一个或多个位点甲基化的出现或缺失指示由所述方法生成的植物或其前体。

13.如权利要求12所述的试验，其特征在于，所述在SPEECHLESS或FAMA基因或者其中之一的功能同源物上或约10kb内出现基因组甲基化指示为耐受低相对湿度和/或周期性干旱的植物或其前体。

14.一种鉴定植物或其前体的试验，所述植物或其前体对选自与下面有关的不适宜条件的逆压条件耐受：相对湿度、水可利用性、周期性干旱、营养、日光、风、温度、pH、外源性化学物质、化学毒素如盐、食草作用（herbivory）、预防性化学物质、肥料、病原体侵袭如细菌、真菌或病毒感染和害虫侵扰，其中所述试验包含分析植物或其前体中一个或多个基因组甲基化位点的出现或缺失，其中在所述一个或多个位点甲基化的出现或缺失指示对所述一种或多种逆压条件耐受的植物或其前体。

15.如权利要求14所述的试验，其特征在于，所述在SPEECHLESS或FAMA基因或者其中之一的功能同源物上或10kb内出现基因组甲基化指示为耐受低相对湿度和/或周期性干旱的植物或其前体。