CN105237523A - 嘧啶衍生物及其制备方法、用途 - Google Patents
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Abstract
本发明的嘧啶衍生物含有芳香五元杂环，杂原子S、O或N上的孤电子对一方面与不饱和五元环形成共轭体系，另一方面由于这些杂原子的孤电子对效应，对血管内皮生长因子受体VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3具有抑制作用，因此该嘧啶衍生物是一类很好的激酶抑制剂。本发明的嘧啶衍生物对VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3的抑制活性要强于现有技术的帕唑帕尼，其可用于抑制血管内皮生长因子(VEGF)信号通路的疾病如肺癌、肾细胞癌和其它实体瘤等的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物研发领域，具体涉及一类嘧啶衍生物及其制备方法、用途。
背景技术
式一：
在癌症治疗中，抑制血管内皮生长因子(VEGF)信号通路是最有希望的疗法之一。通过临床试验肾细胞癌和其它实体瘤，发现这种化合物是一种高效的全VEGF受体抑制剂(VEGFR)。
帕唑帕尼(Pazopanib，商品名：Votrient，式一)是由英国葛兰素史克公司研发的一种可干扰顽固肿瘤存活和生长所需的新血管生成的新型口服血管生成抑制剂，靶向作用于血管内皮生长因子受体(VEGFR)，通过抑制对肿瘤供血的新血管生成而起作用。适用于晚期肾细胞癌(一种在肾小管中发现癌细胞的肾癌类型)、软组织肉瘤(STS)、上皮性卵巢癌和非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗。于2009年10月获美国FDA批准上市用于治疗晚期肾细胞癌(汤仲明，国际医学研究杂志,(1):8-15,2010)。
实体瘤生长所依赖的营养和氧气是通过血管生成而接收的，这个过程中新的毛细血管由已存在的血管形成。在一系列的内源性蛋白中，VEGF被认为是关键蛋白促使这一过程。VEGF由癌细胞分泌，并且通过绑定它邻近的内皮细胞上的三个酪氨酸蛋白激酶受体(VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3)之一诱导有丝分裂。因此信号通路的抑制能阻断血管生成和随后的肿瘤生长。此假设的第一次临床验证来自于贝伐单抗，一种VEGF的单克隆抗体，与五氟尿嘧啶联用治疗转移性结直肠癌，与顺羧酸铂、紫杉醇联用治疗非小细胞型肺癌。
药物化学的焦点在于优化药物的生物化学活性和细胞基础的选择性，同时改善药代动力学方面以支持每日口服治疗。
发明内容
本发明提供了一种嘧啶衍生物及其用途，同时本发明还提供了几种具体的嘧啶衍生物及其制备方法。
本发明提供了一种嘧啶衍生物，具有如下结构的通式：
其中R1和R2中的任意一个为另外一个为H；
R3为H或烷基；
X为S、O或N杂原子。
当R3为烷基时，其优选为C1-10烷基；
上述嘧啶衍生物，具有以下结构：
上述嘧啶衍生物，具有以下结构：
上述嘧啶衍生物，具有以下结构：
本发明提供了一种嘧啶衍生物的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：2-磺酰氯噻吩与浓硝酸进行硝化反应，得到5-硝基噻吩-2-磺酰氯；
步骤二：将5-硝基噻吩-2-磺酰氯与氨水进行取代反应，得到5-硝基噻吩-2-磺酰氨；
步骤三：将5-硝基噻吩-2-磺酰氨进行SnCl2·2H2O或H2/RaneyNi还原，得到5-氨基噻吩-2-磺酰氨；
步骤四：将5-氨基噻吩-2-磺酰氨与2,3-二甲基-N-(2-氯嘧啶-4-基)-N-甲基-2H-吲唑-6-胺进行取代反应，得到5-[[4-[(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)甲基氨基]-2-嘧啶]氨基]-2-磺酰胺。
本发明提供了一种嘧啶衍生物的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：4-硝基噻吩-2-磺酰氯与氨水进行取代反应，反应得到4-硝基噻吩-2-磺酰氨；
步骤二：将4-硝基噻吩-2-磺酰氨进行SnCl2·2H2O或H2/RaneyNi还原，反应得到4-氨基噻吩-2-磺酰氨；
步骤三：将4-氨基噻吩-2-磺酰氨和2,3-二甲基-N-(2-氯嘧啶-4-基)-N-甲基-2H-吲唑-6-胺进行反应，得到4-[[4-[(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)甲基氨基]-2-嘧啶]氨基]-2-磺酰胺。
本发明提供了一种嘧啶衍生物的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：4-甲基噻吩-2-甲酸甲酯与氯磺酸进行氯磺化反应，得到5-氯磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸甲酯；
步骤二：5-氯磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸甲酯与氨气进行取代反应，得到5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸甲酯；
步骤三：将5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸甲酯进行水解反应，得到5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸；
步骤四：将5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸与叠氮磷酸二苯酯进行Curtius重排反应，得到氨基甲酸N-(5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩)-1,1-二甲基乙酯；
步骤五：将氨基甲酸N-(5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩)-1,1-二甲基乙酯进行水解反应，得到5-氨基-3-甲基-2-噻吩磺酰氨；
步骤六：将5-氨基-3-甲基-2-噻吩磺酰氨与2,3-二甲基-N-(2-氯嘧啶-4-基)-N-甲基-2H-吲唑-6-胺进行取代反应，得到5-[[4-[(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)甲基氨基]-2-嘧啶]氨基]-3-甲基-2-磺酰胺。
本发明提供了一种抑制剂，包括上述述的嘧啶衍生物。
本发明还提供了上述嘧啶衍生物，在制备治疗肿瘤药物中的应用，优选的，在制备治疗血管内皮生长因子VEGF信号通路的疾病的药物中的应用，所述疾病进一步优选为肺癌、肾细胞癌或其它实体瘤。
本发明的嘧啶衍生物含有芳香五元杂环，杂原子S、O或N上的孤电子对一方面与不饱和五元环形成共轭体系，另一方面由于这些杂原子的孤电子对效应，对血管内皮生长因子受体VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3具有抑制作用，因此该嘧啶衍生物是一类很好的激酶抑制剂。本发明的嘧啶衍生物对VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3的抑制活性要强于现有技术的帕唑帕尼，其可用于抑制血管内皮生长因子(VEGF)信号通路的疾病如肺癌、肾细胞癌和其它实体瘤等的治疗。
具体实施方式
本发明提供了一种嘧啶衍生物，具有如下结构的通式A：
其中R1和R2中的任意一个为另外一个为H；
R3为H或烷基，其中烷基优选为C1-10烷基；
X为S、O或N杂原子。
具体可以为具有如下结构式的化学物1：5-[[4-[(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)甲基氨基]-2-嘧啶]氨基]-2-磺酰胺。
或具有如下结构式的化学物2：4-[[4-[(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)甲基氨基]-2-嘧啶]氨基]-2-磺酰胺。
或具有如下结构式的化学物3：5-[[4-[(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)甲基氨基]-2-嘧啶]氨基]-3-甲基-2-磺酰胺。
上述化合物1的制备方法包括如下步骤：
步骤一：2-磺酰氯噻吩与浓硝酸进行硝化反应，得到5-硝基噻吩-2-磺酰氯；
步骤二：将5-硝基噻吩-2-磺酰氯与浓氨水进行取代反应，得到5-硝基噻吩-2-磺酰氨；
步骤三：将5-硝基噻吩-2-磺酰氨进行SnCl2·2H2O或H2/RaneyNi还原，得到5-氨基噻吩-2-磺酰氨；
步骤四：将5-氨基噻吩-2-磺酰氨与2,3-二甲基-N-(2-氯嘧啶-4-基)-N-甲基-2H-吲唑-6-胺进行取代反应，得到5-[[4-[(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)甲基氨基]-2-嘧啶]氨基]-2-磺酰胺。
上述化合物2的制备方法包括如下步骤：
步骤一：4-硝基噻吩-2-磺酰氯与氨水进行取代反应，反应得到4-硝基噻吩-2-磺酰氨；
步骤二：将4-硝基噻吩-2-磺酰氨进行SnCl2·2H2O或H2/RaneyNi还原，反应得到4-氨基噻吩-2-磺酰氨；
步骤三：将4-氨基噻吩-2-磺酰氨和2,3-二甲基-N-(2-氯嘧啶-4-基)-N-甲基-2H-吲唑-6-胺进行反应，得到4-[[4-[(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)甲基氨基]-2-嘧啶]氨基]-2-磺酰胺。
上述化合物3的制备方法包括如下步骤：
步骤一：4-甲基噻吩-2-甲酸甲酯与氯磺酸进行氯磺化反应，得到5-氯磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸甲酯；
步骤二：5-氯磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸甲酯与氨气进行取代反应，得到5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸甲酯；
步骤三：将5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸甲酯进行水解反应，得到5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸；
步骤四：将5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸与叠氮磷酸二苯酯进行Curtius重排反应，得到氨基甲酸N-(5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩)-1,1-二甲基乙酯；
步骤五：将氨基甲酸N-(5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩)-1,1-二甲基乙酯进行水解反应，得到5-氨基-3-甲基-2-噻吩磺酰氨；
步骤六：将5-氨基-3-甲基-2-噻吩磺酰氨与2,3-二甲基-N-(2-氯嘧啶-4-基)-N-甲基-2H-吲唑-6-胺进行取代反应，得到5-[[4-[(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)甲基氨基]-2-嘧啶]氨基]-3-甲基-2-磺酰胺。
本发明中通式A结构的嘧啶衍生物的合成采用的原料是市售商品，合成方法是采用相应的前驱体(氨基杂环磺酰胺)与2,3-二甲基-N-(2-氯嘧啶-4-基)-N-甲基-2H-吲唑-6-胺在酸性条件下的取代反应。合成化合物1、化合物2和化合物3的前驱体化合物分别为5-氨基噻吩-2-磺酰氨、4-氨基噻吩-2-磺酰氨和氨基甲酸N-(5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩)-1,1-二甲基乙酯。5-氨基噻吩-2-磺酰氨和4-氨基噻吩-2-磺酰氨均以2-磺酰氯噻吩为起始原料，依次经过硝化反应、与浓氨水的取代反应以及在SnCl2·2H2O或H2/RaneyNi等还原剂下的还原反应等经典反应来获得。前驱体氨基甲酸N-(5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩)-1,1-二甲基乙酯则是以4-甲基噻吩-2-甲酸甲酯为起始原料，依次经过氯磺化反应、与氨气的取代反应、酯的水解反应、Curtius重排反应和酰胺的水解反应来获得。该合成工艺具有合成步骤少、操作简单、副产物少、易分离等优点。
本发明的化合物1和化合物2的前驱体的合成均是以2-磺酰氯噻吩为起始原料，各经过(1)硝化反应，(2)与浓氨水的取代反应，(3)在SnCl2·2H2O或H2/RaneyNi等还原剂下的还原反应三个步骤来获得：
在本发明的化合物1和化合物2的前驱体的合成中，在步骤(1)中，2-磺酰氯噻吩在浓HNO3条件下进行硝化反应，可得到5-硝基噻吩-2-磺酰氯和4-硝基噻吩-2-磺酰氯两种异构体化合物，根据两个化合物的极性差异进行分离，也可以在随后的第(2)步或者第(3)步中进行分离，简化了实验操作中繁琐的分离步骤。硝基噻吩-2-磺酰氯依次经过(2)与浓氨水的取代反应和(3)在SnCl2·2H2O或H2/RaneyNi等还原剂下的还原反应，无其他有机杂质引入，分离简便。该合成工艺的一大优势为以一种化合物为起始原料，可以同时获得两个嘧啶衍生物的前驱体化合物，并且无分离上的困难。
本发明的化合物3的前驱体的合成是以4-甲基噻吩-2-甲酸甲酯为起始原料，包括以下步骤：依次经过(1)氯磺化反应，(2)与氨气的取代反应，(3)酯的水解反应，(4)Curtius重排反应和(5)酰胺的水解反应等五个步骤来获得：
在本发明的化合物3的前驱体的合成中，4-甲基噻吩-2-甲酸甲酯经过氯磺化反应后，在随后的(2)与氨气的取代反应和(3)酯的水解反应中，产率均可达到85％以上。在该合成工艺中，在第(4)步骤的反应中用到了Curtius重排反应，羧酸(5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸)与叠氮磷酸二苯酯反应得到中间体酰基叠氮化物(acylazide)，该中间体在受热条件下释放出氮气，噻吩环发生迁移，生成异氰酸酯中间体(isocyanate)，在叔丁醇作用下生成稳定的氨基甲酸盐(carbamate)。最后，氨基甲酸盐在三氟乙酸条件下水解得到化合物3的前驱体化合物5-氨基-3-甲基-2-噻吩磺酰氨。
本发明中的嘧啶衍生物化合物1、化合物2和化合物3是由以上所述的前驱体化合物分别与2,3-二甲基-N-(2-氯嘧啶-4-基)-N-甲基-2H-吲唑-6-胺在盐酸条件下进行取代反应完成。该步骤采用与Pazopanib的合成类似的反应条件，同样实现了化合物1、化合物2和化合物3的合成。
本发明提供的具有通式A结构式化合物的体外生物活性，血管内皮生长因子(VEGF)是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生。而肿瘤组织生长，必须依靠新生血管生成来提供足够的氧气和营养物质来维持。
本发明对所合成的化合物1、化合物2和化合物3进行了抑制VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3的活性测试，所有实验均以帕唑帕尼(Votrient，式一)作为阳性对照物。实验结果表明，在上述各抑制活性试验中，本发明中合成的三个具有通式A结构的嘧啶衍生物的抑制活性都要强于阳性对照物Pazopanib。因而，具有通式A结构的嘧啶衍生物化合物1、化合物2和化合物3具有可用于与抑制血管内皮生长因子(VEGF)信号通路的疾病的治疗，如肺癌、肾细胞癌和其它实体瘤等。
现结合具体实施例对本发明进行说明，所合成的最终化合物经高效液相色谱(HPLC)，薄层色谱(TLC)，熔点(m.p.)，液质联用(LC-MS)进行检测，采用核磁(1H-NMR)共振确证其结构。
实施例1
步骤一：2-磺酰氯噻吩与浓硝酸进行硝化反应，得到5-硝基噻吩-2-磺酰氯。
具体反应式如下：
将浓HNO3(19.8mL)加入100mL三口烧瓶中，体系温度维持0℃，然后将2-磺酰氯噻吩(5.0g，27.4mmol)的CH2Cl2(20mL)溶液通过恒压滴液漏斗缓缓加入反应体系中，滴加速度控制在体系温度不超过5℃。滴加完毕后，室温下反应2h。TLC追踪反应，待反应完全结束后，将反应液倒入冰水中，用CH2Cl2萃取，干燥，过滤后减压蒸除溶剂，残余物通过硅胶柱层析分离(PE:EA＝20:1)，分别得到产物5-硝基噻吩-2-磺酰氯1.6g(淡黄色油状物)和产物4-硝基噻吩-2-磺酰氯2.1g(黄色油状物)，总产率为60％。
步骤二：将5-硝基噻吩-2-磺酰氯与氨水进行取代反应，得到5-硝基噻吩-2-磺酰氨。
具体反应式如下：
室温下，将氨水(3mL)缓慢加入到5-硝基噻吩-2-磺酰氯(1.6g，7.03mmol)的丙酮(10mL)溶液中，滴加完毕后于室温下反应2h。TLC追踪反应，待反应完全结束后，减压蒸除溶剂，残余物通过硅胶柱层析分离(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)，得到产物5-硝基噻吩-2-磺酰氨1.0g，棕色固体，产率为68％，m.p.：129℃；1HNMR(400MHz,DMSO):δ＝8.17(s,2H),8.12(d,J＝4.4Hz,1H),7.59(d,J＝4.4Hz,1H)。
步骤三：将5-硝基噻吩-2-磺酰氨进行SnCl2·2H2O或H2/RaneyNi还原，得到5-氨基噻吩-2-磺酰氨。
具体反应式如下：
冰水浴下，将5-硝基噻吩-2-磺酰氨(500mg，2.40mmol)慢慢加入SnCl2·2H2O(1.9g，8.42mmol)的浓盐酸(6mL)溶液中，滴加完毕后升至室温，继续搅拌2h。冰浴下，加入NaOH(2mol/L)溶液调节PH＝8，减压蒸除溶剂，残余物通过硅胶柱层析分离(CH2Cl2:CH3OH＝10:1)，得到5-氨基噻吩-2-磺酰氨171mg，白色固体，产率为40％。
步骤四：将5-氨基噻吩-2-磺酰氨与2,3-二甲基-N-(2-氯嘧啶-4-基)-N-甲基-2H-吲唑-6-胺进行取代反应，得到5-[[4-[(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)甲基氨基]-2-嘧啶]氨基]-2-磺酰胺。
具体反应式如下：
依次将5-氨基噻吩-2-磺酰氨(100mg，0.56mmol)和2,3-二甲基-N-(2-氯嘧啶-4-基)-N-甲基-2H-吲唑-6-胺(177mg，0.62mmol)加入到异丙醇(4mL)中，抽空，用N2气置换，然后加入浓盐酸(0.3mL)，加热至90℃后反应4h，TLC追踪反应，待反应完全结束后，用三乙胺中和，调节PH＝8后，减压蒸除溶剂，残余物通过硅胶柱层析分离(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)，得到化合物190mg，灰白色固体，产率为37％，1HNMR(400MHz,DMSO):δ＝10.76(s,1H),7.88(d,J＝6.0Hz,1H),7.77(t,J＝8.8Hz,1H),7.46(d,J＝8.8Hz,1H),7.28-7.30(m,3H),6.89(d,J＝8.8Hz,1H),6.53–6.57(m,1H),5.78(d,J＝5.6Hz,1H),4.23(s,3H),3.41(s,3H),2.70(s,3H)；HPLC:98％；MS(ES-API)m/z:430.10[(M+1)+]。
实施例2
步骤一：4-硝基噻吩-2-磺酰氯与氨水进行取代反应，反应得到4-硝基噻吩-2-磺酰氨。
具体反应式如下：
将4-硝基噻吩-2-磺酰氯(2.1g，9.22mmol)溶解在丙酮(10mL)中，搅拌下于室温滴加入氨水(3mL)，滴加完后于室温下反应2h。TLC追踪反应，待反应完全结束后，减压蒸除溶剂，残余物通过硅胶柱层析分离(CH2Cl2:CH3OH＝30:1)，得到产物4-硝基噻吩-2-磺酰氨800mg，暗棕色固体，产率为42％，m.p.：156℃；1HNMR(400MHz,DMSO):δ＝8.96(s,1H),8.01(d,J＝2.0Hz,3H)。
步骤二：将4-硝基噻吩-2-磺酰氨进行SnCl2·2H2O或H2/RaneyNi还原，反应得到4-氨基噻吩-2-磺酰氨。
具体反应式如下：
冰水浴下，将4-硝基噻吩-2-磺酰氨(1.0g，4.80mmol)慢慢加入SnCl2·2H2O(3.8g，16.8mmol)的浓盐酸(6mL)溶液中，滴加完毕后升至室温，继续搅拌2h。冰浴下，加入NaOH(2mol/L)溶液调节PH＝8，减压蒸除溶剂，残余物通过硅胶柱层析分离(CH2Cl2:CH3OH＝10:1)，得到4-氨基噻吩-2-磺酰氨500mg，白色固体，产率为59％，m.p.：122℃；1HNMR(400MHz,DMSO):δ＝7.48(s,2H),7.02(d,J＝1.6Hz,1H),6.22(d,J＝1.6Hz,1H),5.06(s,2H)。
步骤三：将4-氨基噻吩-2-磺酰氨和2,3-二甲基-N-(2-氯嘧啶-4-基)-N-甲基-2H-吲唑-6-胺进行反应，得到4-[[4-[(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)甲基氨基]-2-嘧啶]氨基]-2-磺酰胺。
依次将4-氨基噻吩-2-磺酰氨(112mg，0.63mmol)和2,3-二甲基-N-(2-氯嘧啶-4-基)-N-甲基-2H-吲唑-6-胺(200mg，0.70mmol)加入到异丙醇(4mL)中，抽空，置换N2气，后加入浓盐酸(0.3mL)，加热至90℃后反应5h，TLC追踪反应，待反应完全结束后，用三乙胺中和，调节PH＝8后，减压蒸除溶剂，残余物通过硅胶柱层析分离(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)，得到化合物295mg，淡黄色固体，产率为35％，1HNMR(400MHz,DMSO):δ＝9.69(s,1H),7.86(d,J＝6.4Hz,1H),7.76(d,J＝8.4Hz,1H),7.61-7.63(m,4H),7.44(d,J＝0.8Hz,1H),6.88(dd,J＝1.6Hz&J＝8.8Hz,1H),5.82(d,J＝5.6Hz,1H),4.06(s,3H),3.39(s,3H),2.63(s,3H)；HPLC:100％；MS(ES-API)m/z:430.10[(M+1)+]。
实施例3
步骤一：4-甲基噻吩-2-甲酸甲酯与氯磺酸进行氯磺化反应，得到5-氯磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸甲酯。
具体反应式如下：
冰浴下，将4-甲基噻吩-2-甲酸甲酯(3.0g，19.2mmol)滴加至氯磺酸(10mL)中，反应体系缓缓恢复至室温，反应4h，TLC追踪反应，待反应完全结束后，反应液缓慢倒入100mL冰水中，用二氯甲烷萃取，干燥，减压蒸除溶剂，得到产物5-氯磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸甲酯1.5g，灰色固体，产率为49％。
步骤二：5-氯磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸甲酯与氨气进行取代反应，得到5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸甲酯。
具体反应式如下：
将5-氯磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸甲酯(2.5g，9.82mmol)溶于二氯甲烷(40mL)中，室温搅拌下通入氨气20min，TLC追踪反应，待反应完全结束后，减压蒸除溶剂，得到产物5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸甲酯2.1g，淡黄色固体，产率为91％。
步骤三：将5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸甲酯进行水解反应，得到5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸。
具体反应式如下：
将LiOH(4mL，2mol/L)加入至5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸甲酯(1.0g，4.25mmol)的THF/H2O(25mL，4:1)的混合溶液中，反应液45℃下搅拌8h，TLC追踪反应，待反应完全结束后，用2mol/L的盐酸酸化至PH约为4，用乙酸乙酯萃取，干燥，减压蒸除溶剂，残余物通过硅胶柱层析分离(CH2Cl2:CH3OH＝30:1)，得到产物5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸799mg，黄色固体，产率为85％，1HNMR(400MHz,DMSO):δ＝7.82(s,2H),7.58(s,1H),2.40(s,3H)。
步骤四：将5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸与叠氮磷酸二苯酯进行Curtius重排反应，得到氨基甲酸N-(5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩)-1,1-二甲基乙酯。
具体反应式如下：
依次将5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸(650mg，2.94mmol)，叔丁醇(40mL)，叠氮磷酸二苯酯(808mg，2.94mmol)和三乙胺(297mg)加入100mL单口烧瓶中，反应液加热至100℃，反应8h，TLC追踪反应，待反应完全结束后，将反应液倒入100mL水中，用二氯甲烷萃取，干燥，减压蒸除溶剂，残余物通过硅胶柱层析分离(CH2Cl2:CH3OH＝30:1)，得到产物氨基甲酸N-(5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩)-1,1-二甲基乙酯361mg，棕色固体，产率为42％。
步骤五：将氨基甲酸N-(5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩)-1,1-二甲基乙酯进行水解反应，得到5-氨基-3-甲基-2-噻吩磺酰氨。
具体反应式如下：
依次将氨基甲酸N-(5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩)-1,1-二甲基乙酯(180mg，0.62mmol)，三氯甲烷(20mL)，三氟乙酸(2mL)加入50mL单口烧瓶中，室温下反应4h，TLC追踪反应，待反应完全结束后，加入三乙胺(2mL)，室温下继续搅拌30min，减压蒸除溶剂，残余物通过硅胶柱层析分离(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)，得到产物5-氨基-3-甲基-2-噻吩磺酰氨89mg，棕色固体，产率为75％，m.p.：102-103℃。
步骤六：将5-氨基-3-甲基-2-噻吩磺酰氨与2,3-二甲基-N-(2-氯嘧啶-4-基)-N-甲基-2H-吲唑-6-胺进行取代反应，得到5-[[4-[(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)甲基氨基]-2-嘧啶]氨基]-3-甲基-2-磺酰胺。
具体反应式如下：
依次将5-氨基-3-甲基-2-噻吩磺酰氨(80mg，0.42mmol)和2,3-二甲基-N-(2-氯嘧啶-4-基)-N-甲基-2H-吲唑-6-胺(119mg，0.41mmol)加入到异丙醇(10mL)中，加入浓盐酸(0.5mL)，加热至90℃后反应4h，TLC追踪反应，待反应完全结束后，降至室温，加入三乙胺(2mL)，室温下继续搅拌30min，减压蒸除溶剂，残余物通过硅胶柱层析分离(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)，得到化合物3103mg，淡红色固体，产率为56％，1HNMR(400MHz,DMSO):δ＝10.64(s,1H),7.86(d,J＝6.0Hz,1H),7.77(dd,J＝0.4Hz&J＝8.4Hz,1H),7.47(d,J＝0.8Hz,1H),7.44(d,J＝0.8Hz,1H),7.21(s,2H),6.89(dd,J＝1.6Hz&J＝8.8Hz,1H),6.44(s,1H),5.75(dd,J＝3.2Hz&J＝7.2Hz,1H),4.05(s,3H),3.34(s,3H),2.62(s,3H),2.30(s,3H)；HPLC:100％；MS(ES-API)m/z:444.10[(M+1)+]。
实施例4
本实施例提供了化合物1、化合物2、化合物3、Pazopanib对VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3的生物活性的验证，其验证实验按照HTRFKinEASETK检测试剂盒(Cat.62TKPEC,Cisbio)的说明书进行，区别为：
上述试剂盒说明书中提到的KinaseBuffer1×分别采用了针对VEGFR1、VEGFR2或VEGFR3的KinaseBuffer1×，具体来说，针对VEGFR1的KinaseBuffer1×的配制是：200μL5×Enzymaticbuffer,5μL1MMgCl2,1μL1MDTT,1μL1MMnCl2,793μLddH2O；针对VEGFR2的KinaseBuffer1×的配制是：200μL5×Enzymaticbuffer,5μL1MMgCl2,1μL1MDTT,1μL1MMnCl2,10μLSEB,783μLddH2O.针对VEGFR3的KinaseBuffer1×的配制是：200μL5×Enzymaticbuffer,5μL1MMgCl2,1μL1MDTT,1μL1MMnCl2,793μLddH2O。由此，要使用KinaseBuffer1×做稀释剂的TK-Substrate-biotin、Kinase、ATP也应在此改变的基础上进行配制。
上述试剂盒说明书中提到的激酶储备液(kinasestocksolution)分别采用VEGFR1(Cat.14-562,Millipore)、VEGFR2(Cat.k2643,Sigma)或VEGFR3(FLT4)(Cat.PV4129,Invitrogen)来替代。
上述试剂盒说明书中提到的化合物储备液(compoundstocksolution)在本发明中用化合物1、化合物2、化合物3、Pazopanib或Staurosporine替代，其中化合物1、化合物2、化合物3、Pazopanib或Staurosporine的浓度分别为10μM，10μM，10μM，1μM，100μM，均以4倍比稀释，各取十个浓度。
其中酶反应步骤(Enzymaticstep)中针对VEGFR1室温孵育时间为20分钟，针对VEGFR2室温孵育时间为30分钟，针对VEGFR3室温孵育时间为35分钟。
其中检测步骤(Detectionstep)中体系反应后，室温孵育1h，用ENVISION(Perkinelmer)仪器检测荧光信号(激发波长320nm，发射波长665nm，615nm)。通过全活性孔和背景信号孔计算出每个孔的抑制率，复孔取平均值，抑制率通过以下公式进行计算：
EmissionRatio(ER)＝665nmEmissionsignal/615nmEmissionsignal
抑制率＝(ERpositive―ERsample)/(ERpositive―ERnegative)*100％
EmissionRatio(ER)＝520nmEmissionsignal/495nmEmissionsignal
抑制率＝(ERpositive―ERsample)/(ERpositive―ERnegative)*100％
其中ERpositive表示阳性对照组(positivecontrol)的665nm/615nm发射信号比值；ERsample表示加入待测样品组的665nm/615nm发射信号比值；ERnegative表示阴性对照组(negativecontrol)的665nm/615nm发射信号比值。
同时用专业的画图分析软件PRISM5.0进行半数抑制活性(IC50)的拟合，得到半数抑制浓度(IC50)的值，如表2所示。
表2
从表2可以看出，Staurosporine的半数抑制浓度(IC50)与预设的数据一致，证明本实验是可靠的。本发明中涉及到的嘧啶衍生物化合物1、化合物2和化合物3对VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3都有很好的抑制作用，且整体抑制活性水平均要强于Pazopanib。尤其是化合物3，对VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3均表现出极好的抑制作用。
Claims (10)
1.一种嘧啶衍生物，其特征在于，具有如下结构的通式：
其中R1和R2中的任意一个为另外一个为H；
R3为H或烷基；
X为S、O或N杂原子。
2.根据权利要求1所述的嘧啶衍生物，其特征在于，R3为烷基时，其为C1-10烷基。
3.根据权利要求1所述的嘧啶衍生物，其特征在于，具有以下结构：
4.根据权利要求1所述的嘧啶衍生物，其特征在于，具有以下结构：
5.根据权利要求1所述的嘧啶衍生物，其特征在于，具有以下结构：
6.一种嘧啶衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：2-磺酰氯噻吩与浓硝酸进行硝化反应，得到5-硝基噻吩-2-磺酰氯；
步骤二：将5-硝基噻吩-2-磺酰氯与氨水进行取代反应，得到5-硝基噻吩-2-磺酰氨；
步骤三：将5-硝基噻吩-2-磺酰氨进行SnCl2·2H2O或H2/RaneyNi还原，得到5-氨基噻吩-2-磺酰氨；
步骤四：将5-氨基噻吩-2-磺酰氨与2,3-二甲基-N-(2-氯嘧啶-4-基)-N-甲基-2H-吲唑-6-胺进行取代反应，得到5-[[4-[(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)甲基氨基]-2-嘧啶]氨基]-2-磺酰胺。
7.一种嘧啶衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：4-硝基噻吩-2-磺酰氯与氨水进行取代反应，反应得到4-硝基噻吩-2-磺酰氨；
步骤二：将4-硝基噻吩-2-磺酰氨进行SnCl2·2H2O或H2/RaneyNi还原，反应得到4-氨基噻吩-2-磺酰氨；
步骤三：将4-氨基噻吩-2-磺酰氨和2,3-二甲基-N-(2-氯嘧啶-4-基)-N-甲基-2H-吲唑-6-胺进行反应，得到4-[[4-[(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)甲基氨基]-2-嘧啶]氨基]-2-磺酰胺。
8.一种嘧啶衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：4-甲基噻吩-2-甲酸甲酯与氯磺酸进行氯磺化反应，得到5-氯磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸甲酯；
步骤二：5-氯磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸甲酯与氨气进行取代反应，得到5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸甲酯；
步骤三：将5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸甲酯进行水解反应，得到5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸；
步骤四：将5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩甲酸与叠氮磷酸二苯酯进行Curtius重排反应，得到氨基甲酸N-(5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩)-1,1-二甲基乙酯；
步骤五：将氨基甲酸N-(5-氨基磺酰基-4-甲基-2-噻吩)-1,1-二甲基乙酯进行水解反应，得到5-氨基-3-甲基-2-噻吩磺酰氨；
步骤六：将5-氨基-3-甲基-2-噻吩磺酰氨与2,3-二甲基-N-(2-氯嘧啶-4-基)-N-甲基-2H-吲唑-6-胺进行取代反应，得到5-[[4-[(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)甲基氨基]-2-嘧啶]氨基]-3-甲基-2-磺酰胺。
9.一种抑制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的嘧啶衍生物。
10.根据权利要求1至5任一项所述的嘧啶衍生物，其特征在于，在制备治疗肿瘤药物中的应用，优选的，在制备治疗血管内皮生长因子VEGF信号通路的疾病的药物中的应用，所述疾病进一步优选为肺癌、肾细胞癌或其它实体瘤。
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| CN102143953A (zh) * | 2008-03-26 | 2011-08-03 | 诺丁汉大学 | 嘧啶、三嗪类化合物以及它们作为药剂的用途 |
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