CN105230616B

CN105230616B - 廿二碳五烯酸乙醇胺在提高植物灰霉病抗性中的应用

Info

Publication number: CN105230616B
Application number: CN201510622044.2A
Authority: CN
Inventors: 师恺; 史军营; 喻景权; 邵淑君; 吴爱芳
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2015-09-25
Filing date: 2015-09-25
Publication date: 2017-05-10
Anticipated expiration: 2035-09-25
Also published as: CN105230616A

Abstract

本发明公开了廿二碳五烯酸乙醇胺在提高植物灰霉病抗性中的应用以及在制备提高植物灰霉病抗性的制剂中的应用。本发明以廿二碳五烯酸乙醇胺为主要有效成分制备的制剂，通过诱导植物体内的茉莉酸以及乙烯的信号路径，可显著增强植物对灰霉病的抗性，减少因灰霉病给植株带来的经济损失。采用本发明制剂防治植物灰霉病简单易行，成本较低，可显著延迟和抑制灰葡萄孢病原菌在叶片上的生长及病害的扩散，大大提高了植株对灰霉病的抗性。

Description

廿二碳五烯酸乙醇胺在提高植物灰霉病抗性中的应用

技术领域

本发明涉及植物化学保护领域，尤其涉及廿二碳五烯酸乙醇胺在提高植物灰霉病抗性中的应用。

背景技术

由半知菌亚门的灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的灰霉病是一种世界性病害，在低温高湿等适宜条件下，萌发的分生孢子随气流、灌溉水和农具等传播，并从寄主伤口或枯死的组织上进行侵染。灰霉病属典型的流行病，潜育期短、流行速度快且间歇爆发，寄主广，尤其在番茄上危害较为严重。灰霉病菌能侵染番茄的叶、茎、花，果实等组织，造成严重减产减收，甚至绝收，也已成为当前我国乃至世界上番茄生产的限制性障碍。除番茄外，灰霉病菌还会侵染茄子、黄瓜、辣椒、草莓、葡萄、大蒜、生菜、柑橘等约200余种作物。

迄今为止，尚未发现对灰霉病菌具有抗性的作物品种，因此，生产上灰霉病防治一直依赖于化学防治。目前，用于防治灰霉病的药剂主要有苯并咪唑类(包括多菌灵和甲基硫菌灵)、二甲酰亚胺类(包括腐霉利和异菌脲等)、N-苯氨基甲酸酯类(主要为乙霉威)、百菌清和苯氨基嘧啶类杀菌剂(主要为嘧霉胺)。

其中，二甲酰亚胺类和乙霉威是目前防治灰菌霉病的骨干药剂。这些杀菌剂大多作用于病菌的微管蛋白或抑制病菌孢外蛋白酶，直接破坏病菌细胞的有丝分裂或功能，可有效防止灰霉病菌某些菌群的流行，减少灰霉病的发生。但是，长期以来，大量农药的不合理使用造成了水体、土壤、大气污染和农产品有毒物质残留，严重危及农业生态系统的稳定和人类健康。另外，灰霉病菌因具有寄主范围广、繁殖快和遗传变异频繁等特点，有研究表明流行灰霉病菌对常用的防治药剂均产生了不同程度的抗药性，进一步加大了相关化学农药的投用量，加剧了农产品及环境安全问题。因此，寻找一种高效无害的病害防治手段是今后农作物灰霉病害防治研究和发展的方向。

植物诱导抗病性是利用植物本身的防卫体系，借助于诱导因子激发植物整体抗性水平，使原来的感病反应产生局部的或系统的抗性，提高抵抗病害的能力，又称获得性免疫，是植物病害防治的一种新思路。诱导抗病性研究逐渐趋向于被作为与高等动物的免疫系统有类似功能的植物免疫机制来讨论，已在黄瓜炭疽病、大麦提取液诱导物中发现了免疫信号物质——免疫蛋白；在泡囊-丛枝(VA)菌根菌丝提取液等物质诱导物中分离到了病程相关蛋白，并涉及到生物多聚体在植物体内诱导、降解和在抗性中的作用。

随着植物防御基因的信号传导机制(如水杨酸信号转导系统)和过敏反应的调节及遗传机理的揭示，目前诱导抗病性被认为是发掘植物内在机制的一种新病害防治对策，已有不少诱导剂在生产上应用于农技服务。例如有研究表明，1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)和苯并噻二唑(BTH)能有效诱导水杨酸(SA)的合成，且诱导植物系统中诱导抗性(SAR)的发生，从而用于提高植物对细菌性、病毒性病害的抗性。但是，目前针对灰霉病真菌性病害的诱导抗性物质的研究及应用还相对较少。

廿二碳五烯酸乙醇胺(英文名称：Eicosapentaenoylethanolamide；简称：EPEA)，IUPAC名称为(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-N-(2-羟乙基)-5,8,11,14,17-戊烯酰胺。分子式为C₂₂H₃₅NO₂，分子量345.52g/mol；化学式为：

廿二碳五烯酸乙醇胺为植物天然存在的脂质生物活性化合物，为N-脂肪酰基乙醇胺(N-acylethanolamines，NAEs)家族的成员。NAEs是一类脂肪酸与乙醇胺以酰胺键相连而成的化合物。其在植物中的研究还相对较少，目前已知其参与了植物种子萌发及幼苗期的生长发育的调节过程(Blancaflor等“N-Acylethanolamines:lipid metabolites withfunctionsinplant growth and development.”The Plant Journal201479：568–583)，如参与植物细胞防御系统中的信号转导，抑制信号转导系统中重要组分磷脂酶Dα的活性，调节种子萌发等。

发明内容

本发明发现廿二碳五烯酸乙醇胺能够提高植物的茉莉酸(JA)和乙烯(ETH)信号途径，可提高植物对真菌病害的抗性，降低灰霉病的发生。

基于以上发现，本发明提供了廿二碳五烯酸乙醇胺在提高植物灰霉病中的应用。

本发明还提供了廿二碳五烯酸乙醇胺在制备提高植物灰霉病抗性的制剂中的应用。

所述的植物具体可以为番茄。

本发明还提供了一种提高植物灰霉病抗性的制剂，所述制剂的有效成分为廿二碳五烯酸乙醇胺。

廿二碳五烯酸乙醇胺(Eicosapentaenoylethanolamide，EPEA)为N-脂肪酰基乙醇胺(NAEs)中的一种，可诱导提高植物的茉莉酸(JA)和乙烯(ETH)合成及信号转导基因Coi1、PI1、PI2、ERF1、Ein2等的表达从而提高植物对真菌性病害的抗性。

作为优选，所述的制剂，以1L计，包括：廿二碳五烯酸乙醇胺1.7～3.5g；表面活性剂0.02～0.03L；有机溶剂0.3～0.7L；水0.25～0.7L。

所述的表面活性剂可使制剂在植物表面的湿润、分散、展着和渗透性能显著增强，有效减少制剂喷洒后随风漂移，提高制剂的抗雨水冲刷能力和药效、减少制剂的用量、延长制剂的有效期。

本发明中的表面活性剂可采用有机硅、吐温60或Silwet-L77中的一种，优选为有机硅，有机硅表面活性剂价格更为低廉，且在提高本发明制剂的延展性、降低制剂表面张力上效果更为显著，使制剂更易被植株吸收。

所述有机溶剂的作用在于溶解廿二碳五烯酸乙醇胺(EPEA)，使EPEA更易与其他组分混合，本发明中的有机溶剂可采用乙醇或二甲基甲酰胺，更优选为乙醇。

更优选，所述的制剂，以1L计，包括：廿二碳五烯酸乙醇胺2.76g；表面活性剂0.025L；有机溶剂0.553L；水0.422L。在上述各组分配比下制得的制剂中，廿二碳五烯酸乙醇胺(EPEA)充分溶解于有机溶剂中，且制剂在植物表面的分散性、展着性以及渗透性效果最佳。

所述的制剂通过如下方法进行制备：

(1)将廿二碳五烯酸乙醇胺溶解于有机溶剂后，加水，得到混合溶液；

(2)向混合溶液中加入表面活性剂，获得所述制剂。

在实际制剂配制中，廿二碳五烯酸乙醇胺通常已溶解于有机溶剂中，作为原料直接使用。

本发明还提供了一种提高植物灰霉病抗性的方法，包括以下步骤：将所述的制剂用水稀释后喷施于植物叶片表面或滴灌在植株根部附近。

本发明制剂可在高湿、寡照等易发灰霉病和细菌性叶斑病的环境下或已出现轻微病害症状的时期进行使用。制剂的使用浓度、次数，尤其是制剂中廿二碳五烯酸乙醇胺的浓度可根据植物的苗龄、具体生长情况以及植物生长环境情况、病害程度来确定。

作为优选，所述的制剂稀释后，喷施于植物叶片表面的廿二碳五烯酸乙醇胺的浓度为17.26～34.52mg/L。

本发明的优点在于：

(1)本发明对于已知化合物廿二碳五烯酸乙醇胺发掘了新的提高植物灰霉病抗性的用途，开拓了一个新的应用领域。

(2)本发明制剂中的廿二碳五烯酸乙醇胺为植物友好型物质，可在环境和生物体内降解，且长期使用该物质不会使灰霉病病原菌产生抗药性，使用后也无残留，对人畜和环境无毒害。

(3)本发明以廿二碳五烯酸乙醇胺为主要有效成分制备的制剂，通过诱导植物体内的茉莉酸(JA)以及乙烯(ETH)的信号路径，可显著增强植物对灰霉病的抗性，减少因灰霉病给植株带来的经济损失。

(4)采用本发明制剂防治植物灰霉病简单易行，成本较低，可显著延迟和抑制灰葡萄孢病原菌在叶片上的生长及病害的扩散，大大提高了植株对灰霉病的抗性。

附图说明

图1为实施例1中喷施过本发明制剂与喷清水对照间的番茄叶片抗性信号转导基因表达及病害发生情况的比较；

A为制剂喷施3天后，叶片茉莉酸(JA)及乙烯(ETH)信号路径相关基因的相对表达量；B为灰霉病原菌喷施接种3天后灰霉病发病率；C为灰霉病原菌喷施接种3天后叶片内病原菌Actin基因表达量；空心柱代表对照植株，斜纹柱代表处理植株；小写字母a、b代表不同处理间在5％水平上的差异显著。

图2为实施例2中喷施过本发明制剂与喷清水对照的植株进行灰霉病接种处理后，番茄叶片病害发生情况的比较；

A为灰霉病原菌喷施接种3天后灰霉病发病率；B为灰霉病原菌喷施接种3天后叶片内病原菌Actin基因表达量；空心柱代表对照植株，斜纹柱代表处理植株；小写字母a、b代表不同处理间在5％水平上的差异显著。

图3为实施例3中本发明制剂的田间效应，喷施过本发明制剂与喷清水对照的番茄病害发生率与发生严重情况的比较；

A番茄灰霉病发生率；B喷施与未喷施本发明制剂后健康与发病番茄叶片的光系统II电子传递量子效率(YII)；空心柱代表对照植株，斜纹柱代表处理植株；小写字母a、b、c代表不同处理间在5％水平上的差异显著。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。

实施例1

量取5mg/mL的廿二碳五烯酸乙醇胺(EPEA)的乙醇溶液103.7mL(药品购自SIGMA公司)；再缓慢加入190.3mL的水，并将混合溶液混合均匀，最后向混合溶液中加入6mL的有机硅溶液，搅拌均匀后获得制剂。

取本发明制剂100毫升，加清水10升混合均匀后，在傍晚均匀喷施于苗龄为三叶一心的番茄叶片表面，直至叶片湿润为止，持续喷施2天，以喷清水的番茄植株作为对照。随机取喷施制剂及对照的番茄叶片样品，利用美国Invitrogen公司生产的Trizol、SuperscriptII试剂盒进行RNA提取、纯化及cDNA的反转录，后利用美国Applied Biosystems公司生产的Step ONE Plus Real-TimePCR System仪器及该公司的SYBR RT-PCR Kit荧光染料试剂盒对JA、ETH信号转导相关基因表达进行荧光定量PCR检测，发现经制剂处理过的植株叶片JA(Coi1、PI1、PI2)及ETH(ERF1、Ein2)的信号转导基因表达较对照植株均显著大幅提高，提高幅度在7～40倍之间(图1A)。

对经过本发明制剂处理及对照植株进行灰霉病喷施接种处理，使病菌悬浮液均匀分布在叶片上，灰霉病病原菌接种浓度为2×10⁵孢子/毫升。将上述处理的所有植株置于25℃、95％湿度、12h光照/12h黑暗、光强为200μmol m^-2s^-1的环境下放置3天后观察植株发病情况。同时，随机取叶片样品，利用上述荧光定量PCR的方法对叶片内灰霉病原菌的Actin基因表达情况进行检测。

结果如图1B和C所示：接种第3天后，本发明制剂处理的植株叶片比对照的植株叶片具有明显较强的灰霉病抗性，在对照植株中，人工接种后灰霉病的发病率为100％，而该制剂处理后的植株灰霉病的发病率则下降了65％，叶片灰霉病原菌的Actin平均表达量也比对照下降了70％。

实施例2

量取5mg/mL的廿二碳五烯酸乙醇胺(EPEA)的乙醇溶液165.9mL(药品购自SIGMA公司)；再缓慢加入126.6mL的水，并将混合溶液混合均匀，最后向混合溶液中加入7.5mL的有机硅溶液，搅拌均匀后获得制剂。

取本发明制剂100毫升，加清水10升混合均匀后，在傍晚均匀喷施于苗龄为五叶一心的番茄叶片表面，直至叶片湿润为止，持续喷施2天，以喷清水的番茄植株作为对照。对经过制剂处理及对照植株进行灰霉病病原菌喷施接种处理，使病菌悬浮液均匀分布在叶片上，灰霉病病原菌接种浓度为2×10⁵孢子/毫升。将上述处理的所有植株置于25℃、95％湿度、12h光照/12h黑暗、光强为200μmol m^-2s^-1的环境下放置3天后观察植株发病情况。同时，随机取叶片样品，利用美国Applied Biosystems公司生产的Step ONE Plus Real-TimePCRSystem仪器及该公司的SYBR RT-PCR Kit荧光染料试剂盒对叶片内灰霉病原菌的Actin基因表达情况进行检测。

结果如图2A和B所示：接种第3天后，本发明制剂处理的植株叶片比对照的植株叶片具有明显较强的灰霉病抗性，在对照植株中，人工接种后灰霉病的发病率为100％，而该制剂处理后的植株灰霉病的发病率则下降56％，叶片灰霉病原菌的Actin平均表达量也比对照下降了54％。

实施例3

量取5mg/mL的廿二碳五烯酸乙醇胺(EPEA)的乙醇溶液207.3mL(药品购自SIGMA公司)；再缓慢加入83.7mL的水，并将混合溶液混合均匀，最后向混合溶液中加入9.0mL的有机硅溶液，搅拌均匀后获得制剂。

选取栽培技术及管理完全一致的两个相邻的塑料大棚，在春末梅雨季节，对处理棚使用本发明制剂，取本发明制剂200毫升，加清水20升混合均匀后，在清晨和傍晚分两次均匀喷施于苗龄为七叶一心的番茄叶片表面至叶片湿润为止，持续喷施2天。而对照棚仅喷施相同体积的水。10天后随机统计处理棚与对照棚中各60株番茄的发病率，并通过叶绿素荧光参数比较处理棚与对照棚发病植株的发病程度。叶绿素荧光采用德国Heinz-Walz公司生产的Imaging-PAM调制荧光成像系统测定。

结果如图3所示：在灰霉病高发阶段处理本发明制剂10天后，明显增强了番茄植株对灰霉病的抗性，本发明制剂处理的植株比对照植株的病株率下降了59％。处理植株较对照植株中未发病健康植株的光系统II电子传递量子效率(YII)无显著差异，本发明制剂处理后仍然发病的植株也比对照条件下发病植株的光系统II电子传递量子效率(YII)平均提高48％。

Claims

1.廿二碳五烯酸乙醇胺在提高植物灰霉病抗性中的应用。

2.廿二碳五烯酸乙醇胺在制备提高植物灰霉病抗性的制剂中的应用。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物为番茄。

4.一种提高植物灰霉病抗性的制剂，其特征在于，所述制剂的有效成分为廿二碳五烯酸乙醇胺，以1L计，包括：

5.如权利要求4所述的制剂，其特征在于，以1L计，包括：

6.一种提高植物灰霉病抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求4～5任一所述的制剂用水稀释后喷施于植物叶片表面或滴灌在植物根部附近。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的制剂稀释后，喷施于植物叶片表面的廿二碳五烯酸乙醇胺的浓度为17.26～34.52mg/L。