CN105219750A - 自然酶活性脂蛋白相关磷脂酶a2及制备过程 - Google Patents

自然酶活性脂蛋白相关磷脂酶a2及制备过程 Download PDF

Info

Publication number
CN105219750A
CN105219750A CN201510525323.7A CN201510525323A CN105219750A CN 105219750 A CN105219750 A CN 105219750A CN 201510525323 A CN201510525323 A CN 201510525323A CN 105219750 A CN105219750 A CN 105219750A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pla2
flag
pvl1392
enzymic activity
carrier
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510525323.7A
Other languages
English (en)
Inventor
关大伟
李宝民
刘木清
于顺
蔡燕宁
高大松
关恒
赵雪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Changchun Hengxiao Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Changchun Hengxiao Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Changchun Hengxiao Biotechnology Co Ltd filed Critical Changchun Hengxiao Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201510525323.7A priority Critical patent/CN105219750A/zh
Publication of CN105219750A publication Critical patent/CN105219750A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01004—Phospholipase A2 (3.1.1.4)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

一种自然酶活性脂蛋白相关磷脂酶A2及制备过程，属于生物技术领域。本发明的目的是提供LP-PLA2-N端抗体，能特异性LP-PLA2-N端，不干扰LP-PLA2？C端酶催化结构区域酶活性，适合进行抗体扑获LP-PLA2酶活性测定试验，扑获出血液中LP-PLA2，或LP-PLA2-小分子复合物，再特异性测定LP-PLA2酶活性的自然酶活性脂蛋白相关磷脂酶A2及制备过程。本发明的步骤是：构建pVL1392-Flag-LP-PLA2载体，与线性AcNPV？DNA？共转染产生重组Flag-LP-PLA2？AcNPV，表达出带有8个氨基酸残基短肽LP-PLA2，纯化出具有自然酶活性和抗原性Flag-LP-PLA2蛋白，构建pVL1392-His-LP-PLA2-N载体，制备成His-LP-PLA2-N端蛋白亲和层析柱，分离和纯化出抗LP-PLA2-N端抗体。本发明测定LP-PLA2酶活性方法具有特异性强，应用广泛，检测灵敏度高的优点。

Description

自然酶活性脂蛋白相关磷脂酶A2及制备过程
技术领域
本发明属于生物技术领域。
背景技术
脂蛋白相关磷脂酶A2（Lipoprotein-associatedphospholipaseA2，LP-PLA2）是磷脂酶家族中PLA2的一种，有441个氨基酸残基的分泌蛋白（45KDa），以酶活性形式循环在血液中。LP-PLA2是丝氨酸依赖的磷脂酶,其催化活性不需要钙离子。LP-PLA2酶活性区域位于蛋白C端，S273，D296，H351氨基酸残基组成酶催化活性核心位点；189-239氨基酸残基形成片成结构，参与控制酶底物的特异性，并为低密度脂蛋白（LDL）结合区域；367-370氨基酸残基参与高密度脂蛋白（HDL）结合。
血液中LP-PLA2来源有两类，一是由单核细胞、淋巴细胞以及肥大细胞产生和分泌到血液中；另一来源是由处于活动状态动脉血管硬化灶中的单核细胞，吞噬细胞产生并分泌到血液中，其分泌量与动脉血管硬化灶活动程度相关。血液中LP-PLA2与LDL和HDL相关，其中80%LP-PLA2与氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）结合，10-20%LP-PLA2与DHL结合。LP-PLA2磷脂酶能水解磷酯sn-2位短酯酰链中的酯键，血液中LP-PLA2能水解血小板活化因子（Platelet-activatingfactor,PAF），短链磷脂和氧化磷脂等。
心脑血管疾病是最常见的中老年疾病,现在也是首位引起人类死亡原因。近些年,随着生活水平的提高,心脑血管发病率呈年轻化趋势。研究表明，动脉硬化可累及冠状动脉、脑动脉及其它动脉，是冠状动脉性心脏病，脑血栓和其它血栓疾病的病理基础。动脉硬化是一种慢性炎症反应性疾病，炎症反应在动脉粥样斑块形成的起始、发展、破裂，脱落等过程中起着重要作用，而LP-PLA2参与在动脉硬化炎症反应全过程并加重炎症反应。组织学研究发现，活动性动脉硬化斑块内，斑块坏死中心、易损及破裂斑块周围，LP-PLA2浓度显著升高。活动性动脉血管硬化灶内LP-PLA2水解与LDL结合氧化卵磷酯（OX-PC），成为溶血磷脂酰胆碱（lysoPC）和氧化游离脂肪酸（oxNEPAS）。这两个分解物是很强的炎症因子，有单核巨噬细胞趋化因子作用，又能诱导血管内皮细胞分泌细胞粘附因子，促进单核细胞移动到动脉血管硬化灶内，转化为巨噬细胞和泡沫细胞，损伤血管功能；这些聚集的巨噬细胞和泡沫细胞产生更多的LP-PLA2，加重动脉硬化灶部位发炎,增生,导致血小板在此部位积聚,脱落，形成血栓；同时，动脉血管硬化灶中的LP-PLA2大量分泌到血液中，增加血液中LP-PLA2浓度。由此可见，LP-PLA2直接参于动脉硬化灶内炎症反应过程，血液中增高LP-PLA2浓度和酶活性代表动脉硬化灶活动程度，也能代表血栓发生的可能性。
流行病学研究发现，血液中LP-PLA2浓度或酶活性增高人群，其心血管疾病发病率增加。去除其它心血管疾病危险因素，与低浓度LP-PLA2人群相比，高浓度LP-PLA2人群发生心血管疾病可能性增加2倍以上。又有研究发现，高血压人群，同时血液中LP-PLA2浓度增高，发生心血管疾病可能性增加7倍以上。绝经后的妇女，伴有血液中LP-PLA2浓度增高，发生血栓可能性增加64%。Gerber等人测定病人心肌梗死发生时血液中LP-PLA2酶活性，比低LP-PLA2酶活性心肌梗死病人，高LP-PLA2酶活性心肌梗死病人死亡率增加5.35倍；有高LP-PLA2酶活性心肌梗死病人复发率增加两倍多。这些结果表明，血液中增高LP-PLA2酶活性和浓度能预测心肌梗塞和脑血栓的发生，预后，及复发，需要开发测定血液中LP-PLA2酶活性或浓度的试剂盒。
LP-PLA2是激发动脉硬化灶内炎症反应重要因子，促发血栓形成。开发LP-PLA2酶活性抑制剂是阻断脉硬化灶内炎症反应有效途径，能减少血栓发生。在国外,葛兰素史克公司研发出LP-PLA2酶活性抑制剂（Darapladib），能与LP-PLA2酶活性功能区丝氨酸残基作用，并有效阻断血液中LP-PLA2酶活性，降低动脉硬化灶内炎症反应，减少血栓的发生。在国内，需要开发LP-PLA2酶活性抑制剂，用于预防和减少血栓发生。
在临床检验中，检测血液中LP-PLA2浓度方法主要是夹心酶联免疫法，及直接测定血液LP-PLA2酶活性方法，两个测定方法都需要纯化LP-PLA2作为标准品，此标准品要有LP-PLA2自然酶活性和抗原性。制备出具有自然酶活性和抗原性纯化LP-PLA2蛋白有几个途径。一是从人体血液中大量提取自然LP-PLA2，这种方法是不可行，原因是血液来源受限制，血液中有多种感染因子，制备过程和标准品是不安全。再用基因工程方法表达和纯化LP-PLA2标准品，用基因工程细菌表达LP-PLA2蛋白没有酶活性，蛋白结构与自然LP-PLA2有很大差异，不能作为LP-PLA2标准品；用人体细胞表达LP-PLA2基因重组蛋白符合LP-PLA2标准品的要求，但培养人体细胞要求条件高，产量低，生产成本高；而本发明采用昆虫细胞系统表达LP-PLA2，昆虫细胞近似于人体细胞，但产量高，成本低，适合大量生产，纯化出LP-PLA2具有自然酶活性和抗原性，作为检测LP-PLA2酶活性和浓度的标准品。
测定血液中LP-PLA2浓度方法是双抗体夹心酶联免疫法，利用抗原和抗体特异性结合的原理。此法简单，易操作，得到广泛应用。但这种方法测定血液中LP-PLA2的含量，间接表明血液中LP-PLA2酶活性，而动脉硬化活动状况与血液中LP-PLA2酶活性相关，有时LP-PLA2含量与LP-PLA2活性是不相关，如LP-PLA2基因变异人群及血液中有LP-PLA2抑制物的人群；另外，制备测定LP-PLA2双抗体夹心酶联免疫法试剂盒需要几种LP-PLA2单克隆抗体，成本高；同时，双抗体夹心酶联免疫法步骤多，需要时间较长，准确性差等缺点。
直接测定血液LP-PLA2酶活性方法是利用LP-PLA2为磷脂酶，能水解氧化磷酯sn-2位短酯酰链中的酯键，在实验研究工作中，用合成LP-PLA2酶底物，直接测定LP-PLA2酶活性。其方法是直接加LP-PLA2酶底物到血清/血浆中，其中LP-PLA2分解合成反应底物，生成颜色反应产物，再测算出LP-PLA2酶活性。这种方法优点为简洁，快速。缺点是血液一些成分直接影响检测LP-PLA2酶活性法的结果，如血红素，胆红素，代谢产物，药物等；血液或细胞液中还有LP-PLA2类似PLA2磷脂酶存在，也能水解LP-PLA2酶底物，测定酶活性结果一部分为PLA2磷脂酶的活性，降低检测血液LP-PLA2酶活性的特异性。
一些植物提取物中的小分子能与LP-PLA2-C端酶活性区结合形成复合物，并抑制LP-PLA2酶活性，成为LP-PLA2酶活性抑制剂，为了开发出植物中小分子LP-PLA2酶抑制剂，需要一种检测LP-PLA2-小分子复合物酶活性方法。
双抗体夹心酶联免疫法是用于测定样品中LP-PLA2含量，不能测定LP-PLA2酶活性，不能用于筛选LP-PLA2酶活性抑制剂。用酶底物直接测定样品中LP-PLA2酶活性方法，可用于筛选植物提取物LP-PLA2酶活性抑制剂，但有很大缺陷，主要是植物提取物可能降低LP-PLA2酶活性检测结果，不能确定这些物是干扰酶底物，还是影响LP-PLA2酶功能，不能确定是LP-PLA2特异性抑制物。
发明内容
本发明的目的是提供LP-PLA2-N端抗体，能特异性LP-PLA2-N端，不干扰LP-PLA2C端酶催化结构区域酶活性，适合进行抗体扑获LP-PLA2酶活性测定试验，扑获出血液中LP-PLA2，或LP-PLA2-小分子复合物，再特异性测定LP-PLA2酶活性的自然酶活性脂蛋白相关磷脂酶A2及制备过程。
本发明的步骤是：
提取THP-1RNA，合成THP-1cDNA基因库，用PCR扩增出LP-PLA2DNA，构建pVL1392-Flag-LP-PLA2载体；
pVL1392-Flag-LP-PLA2载体与线性AcNPVDNA共转染到SF9细胞，产生重组Flag-LP-PLA2AcNPV；
重组Flag-LP-PLA2AcNPV感染SF9细胞并表达出带有8个氨基酸残基短肽LP-PLA2；
用Anti-FlagM2affinityagarose纯化出具有自然酶活性和抗原性Flag-LP-PLA2蛋白；
构建pVL1392-His-LP-PLA2-N载体，产生重组His-LP-PLA2-NAcNPV，感染SF9细胞并表达出带有6个氨基酸残基短肽LP-PLA2-N；
His-SelectHFNickelaffinityGel纯化出His-LP-PLA2-N端蛋白并制备成His-LP-PLA2-N端蛋白亲和层析柱；
Flag-LP-PLA2免疫动物产生LP-PLA2抗血清，用His-LP-PLA2-N端蛋白亲和层析柱，分离和纯化出抗LP-PLA2-N端抗体。
本发明pVL1392-Flag-LP-PLA2载体的构建：提取THP-1细胞RNA,用于合成cDNA，用PCR扩增出LP-PLA2DNA，其核酸序列84-1326；选用昆虫细胞表达载体pVL1392-Flag-----9.64kb,有Polyhedrin启动子，在昆虫细胞中表达外源性蛋白；带有部分AcNPVDNA序列，用于产生基因重组昆虫病毒；此载体插入8个氨基酸残基----DYKDDDDK短肽DNA序列,用于表达Flag融合蛋白；用内切酶NdeI/XbaI切割LP-PLA2DNA和pVL1392-Flag，将LP-PLA2DNA连接到pVL1392-FlagNdeI/XbaI部位，构建成pVL1392-Flag-LP-PLA2载体。
本发明pVL1392-His-LP-PLA2-N载体构建：pVL1392-His载体插入6个组氨基酸残基短肽DNA序列,用于表达His融合蛋白，用内切酶NdeI/BglII切割pVL1392-Flag-LP-PLA2，将获得LP-PLA2-N端DNA连接到pVL1392-HisNdeI/BamHI部位，构建成pVL1392-His-LP-PLA2-N载体。
本发明His-LP-PLA-N端蛋白亲和层析柱的制备：pVL1392-His-LP-PLA2-N载体与AcNPV线性DNA共转染SF9细胞，产生重组His-LP-PLA2-NAcNPV；用此病毒感染SF9细胞，表达出His-LP-PLA2-N端蛋白，用纯化His-LP-PLA2-N端蛋白进行SDS-PAGE电泳，再做银染法，连接His-LP-PLA2-N端蛋白到NHS活化亲和层析柱上，制备His-LP-PLA-N端蛋白亲和层析柱。
本发明表达LP-PLA2-N端蛋白呈现32-183氨基酸残基，N端带有His标记短肽，用His-SelectHFNickelaffinityGel纯化出His-LP-PLA2-N端蛋白。
本发明提供测定LP-PLA2酶活性方法能快速，简单，高效地从植物提取物或合成小分子混合物中筛选出特异性LP-PLA2酶活性抑制剂。测定LP-PLA2酶活性方法具有特异性强，应用广泛，检测灵敏度高的优点。
附图说明
图1是DNA内切酶切割pVL1392-Flag-LP-PLA2DNA载体；
Lane1；EcoRI切割pVL1392-Flag-LP-PLA2DNA载体
Lane2；BamHI切割pVL1392-Flag-LP-PLA2DNA载体
Lane3；DNAMarker；
图2是银染法测定Lp-PLA2纯度和浓度；
Lane1-6;0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/mlBSA；
Lane7;纯化Flag-LP-PLA2蛋白；
Lane8;纯化His-LP-PLA2-N端蛋白；
Lane9;蛋白标准品；
图3是BSA浓度曲线；
图4是WesternBlotting测定Flag-LP-PLA2蛋白；
Lane1；SF9细胞裂解液；
Lane2；Flag-LP-PLA2-SF9细胞裂解液；
Lane3；SF9细胞裂解液中纯化蛋白；
Lane4；Flag-LP-PLA2-SF9细胞裂解液中纯化蛋白；
图5是P-Nitrophenol浓度与OD值相关曲线；
图6是银染法测定抗Lp-PLA2-N抗体纯度和浓度；
Lane1-2;5ul纯化抗LP-PLA2-N端抗体；
Lane3;蛋白标准品；
图7是用纯化抗LP-PLA2-N端抗体测定LP-PLA2；
Lane1；纯化Flag-TRF2；
Lane2；纯化Flag-LP-PLA2；
图8是Flag-LP-PLA2-OD值标准曲线；
图9是Flag-LP-PLA2酶活性抑制值（UI）曲线；
图10是LP-PLA2蛋白功能区；
图11是测定抗体扑获LP-PLA2酶反应原理图；
图12是LP-PLA2酶反应法筛选LP-PLA2抑制剂原理图；
图13是PL-PLA2水解l-myristoyl-2-(4-nitrophenylsuccinyl)phosphatidylcholine形成终产物(4-nitrophenol)原理图。
具体实施方式
本发明的步骤是：
提取THP-1RNA，合成THP-1cDNA基因库，用PCR扩增出LP-PLA2DNA，构建pVL1392-Flag-LP-PLA2载体；
pVL1392-Flag-LP-PLA2载体与线性AcNPVDNA共转染到SF9细胞，产生重组Flag-LP-PLA2AcNPV；
重组Flag-LP-PLA2AcNPV感染SF9细胞并表达出带有8个氨基酸残基短肽LP-PLA2；
用Anti-FlagM2affinityagarose纯化出具有自然酶活性和抗原性Flag-LP-PLA2蛋白；
构建pVL1392-His-LP-PLA2-N载体，产生重组His-LP-PLA2-NAcNPV，感染SF9细胞并表达出带有6个氨基酸残基短肽LP-PLA2-N；
His-SelectHFNickelaffinityGel纯化出His-LP-PLA2-N端蛋白并制备成His-LP-PLA2-N端蛋白亲和层析柱；
Flag-LP-PLA2免疫动物产生LP-PLA2抗血清，用His-LP-PLA2-N端蛋白亲和层析柱，分离和纯化出抗LP-PLA2-N端抗体。
本发明pVL1392-Flag-LP-PLA2载体的构建：提取THP-1细胞RNA,用于合成cDNA，用PCR扩增出LP-PLA2DNA，其核酸序列84-1326；选用昆虫细胞表达载体pVL1392-Flag-----9.64kb,有Polyhedrin启动子，在昆虫细胞中表达外源性蛋白；带有部分AcNPVDNA序列，用于产生基因重组昆虫病毒；此载体插入8个氨基酸残基----DYKDDDDK短肽DNA序列,用于表达Flag融合蛋白；用内切酶NdeI/XbaI切割LP-PLA2DNA和pVL1392-Flag，将LP-PLA2DNA连接到pVL1392-FlagNdeI/XbaI部位，构建成pVL1392-Flag-LP-PLA2载体。
本发明pVL1392-His-LP-PLA2-N载体构建：pVL1392-His载体插入6个组氨基酸残基短肽DNA序列,用于表达His融合蛋白，用内切酶NdeI/BglII切割pVL1392-Flag-LP-PLA2，将获得LP-PLA2-N端DNA连接到pVL1392-HisNdeI/BamHI部位，构建成pVL1392-His-LP-PLA2-N载体。
本发明His-LP-PLA-N端蛋白亲和层析柱的制备：pVL1392-His-LP-PLA2-N载体与AcNPV线性DNA共转染SF9细胞，产生重组His-LP-PLA2-NAcNPV；用此病毒感染SF9细胞，表达出His-LP-PLA2-N端蛋白，用纯化His-LP-PLA2-N端蛋白进行SDS-PAGE电泳，再做银染法，连接His-LP-PLA2-N端蛋白到NHS活化亲和层析柱上，制备His-LP-PLA-N端蛋白亲和层析柱。
本发明表达LP-PLA2-N端蛋白呈现32-183氨基酸残基，N端带有His标记短肽，用His-SelectHFNickelaffinityGel纯化出His-LP-PLA2-N端蛋白。
以下对本发明做进一步详细描述：
提取THP-1细胞RNA,用于合成cDNA，用PCR扩增出LP-PLA2DNA（核酸序列84-1326）。选用昆虫细胞表达载体pVL1392-Flag（9.64kb）,有Polyhedrin启动子，在昆虫细胞中表达外源性蛋白；带有部分AcNPVDNA序列，用于产生基因重组昆虫病毒；此载体插入8个氨基酸残基（DYKDDDDK）短肽（Flag）DNA序列,用于表达Flag融合蛋白。用内切酶NdeI/XbaI切割LP-PLA2DNA和pVL1392-Flag，将LP-PLA2DNA连接到pVL1392-FlagNdeI/XbaI部位，构建成pVL1392-Flag-LP-PLA2载体；②此载体与AcNPV线性DNA共转染SF9细胞，产生重组Flag-LP-PLA2AcNPV；用此AcNPV感染SF9细胞，表达出Flag-LP-PLA2蛋白，LP-PLA2蛋白有441氨基酸残基，LP-PLA2-N端1-21氨基酸残基为分泌蛋白信号引导序列，提取血液中LP-PLA2，已切除信号引导序列1-21氨基酸残基或切出更长序列到42氨基酸残基。本发明表达LP-PLA2呈现32-441氨基酸残基，与血液中的LP-PLA2相近。表达LP-PLA2-N端带有Flag标记短肽，可用Anti-FlagM2affinityagarose纯化出Flag-LP-PLA。纯化Flag-LP-PLA2进行SDS-PAGE电泳，再做银染法，测定Flag-LP-PLA2纯度达到99%以上；用抗LP-PLA2抗体进行WesternBlot，证实抗LP-PLA2抗体能特异性结合Flag-LP-PLA2。
LP-PLA2酶活性单位（IU）为每分钟LP-PLA2水解1.0nmol/ml酶底物。本发明用人工合成酯类物质l-myristoyl-2-(4-nitrophenylsuccinyl)phosphatidylcholine（MNP）为酶底物，1.0IULP-PLA2水解MNP后，将产生1.0IU（1.0nmol/ml/min）p-Nitrophenol终产物，p-Nitrophenol呈颜色反应，选用波长405nm，测定OD值。用纯p-Nitrophenol为标准品，制备出0,10,20,40,80,120nmol/mlp-Nitrophenol标准品，测定出不同浓度p-Nitrophenol标准品OD值，绘制出p-Nitrophenol标准品浓度与OD值关系标准曲线，计算出曲线斜率（K）：如K=(p-Nitrophenol80nmol-40nmol/ml)/(80nmol/mlOD值-40nmol/mlOD值)。为了测定Flag-LP-PLA2酶活性，50,100,200,400ng/ml浓度Flag-LP-PLA2与酶底物（MNP）反应，产生p-Nitrophenol，呈颜色反应，测定不同反应时间（2，3，4，5，6，7，8min）OD值，根据以下公式算出LP-PLA2酶活性单位：如LP-PLA2酶活性单位（IU,nmol/ml/min）=K(OD3min-OD2min)/0.02ml。
pVL1392-His载体插入6个组氨基酸残基（HHHHHH）短肽（His）DNA序列,用于表达His融合蛋白。用内切酶NdeI/BglII切割pVL1392-Flag-LP-PLA2，将获得LP-PLA2-N端DNA连接到pVL1392-HisNdeI/BamHI部位，构建成pVL1392-His-LP-PLA2-N载体，与AcNPV线性DNA共转染SF9细胞，产生重组His-LP-PLA2-NAcNPV；用此病毒感染SF9细胞，表达出His-LP-PLA2-N端蛋白，本发明表达LP-PLA2-N端蛋白呈现32-183氨基酸残基，N端带有His标记短肽，用His-SelectHFNickelaffinityGel纯化出His-LP-PLA2-N端蛋白。用纯化His-LP-PLA2-N端蛋白进行SDS-PAGE电泳，再做银染法，测定His-LP-PLA2-N端蛋白纯度达到99%以上。连接His-LP-PLA2-N端蛋白到NHS活化亲和层析柱上，制备His-LP-PLA-N端蛋白亲和层析柱。
用纯化Flag-LP-PLA2免疫兔产生抗LP-PLA2血清，用LP-PLA2-N端蛋白亲和层析柱，分离出抗LP-PLA2-N端抗体，抗LP-PLA2-N端抗体包被微量滴定板或共价键连接到固相载体上(琼脂糖，琼脂糖凝胶，树脂等)，LP-PLA2-N端抗体能结合到血液中LP-PLA2，通过洗涤过程，去除非结合物，排除干扰LP-PLA2酶活性物质；加入LP-PLA2酶底物（MNP），Lp-PLA2-N端抗体结合LP-PLA2水解酶底物，完全代表样品中LP-PLA2的酶活性，迅速生成颜色反应终产物，用波长405nm测出OD值。同时，用0，50，100，200，400，800UIFlag-LP-PLA2与酶底物进行反应，测定出不同UIFlag-LP-PLA2标准品OD值，绘制出Flag-LP-PLA2UI与OD值关系标准曲线，利用标准曲线，进一步计算出血液样品中LP-PLA2酶活性单位。
纯化Flag-LP-PLA2与植物提取物混合反应；同时，用纯化Flag-LP-PLA2与植物提取物相同液体混合反应，作为阳性对照组；加反应物到LP-PLA2-N端抗体包被微量滴定板孔中，通过洗涤后，去除非结合物，排除干扰LP-PLA2酶活性物质；加入LP-PLA2酶底物（MNP），Lp-PLA2-N端抗体结合LP-PLA2-小分子复合物水解酶底物（MNP），生成终产物，用波长405nm测出OD值。利用下列公式，计算出LP-PLA2酶活性抑制单位，酶活性抑制值（UI）=阳性对照样品UI-植物提取物样品UI
本发明制备Flag-LP-PLA2具有自然酶活性和抗原性，作为测定LP-PLA2酶活性和浓度标准品。能用于免疫动物产生抗LP-PLA2多克隆抗体，用His-LP-PLA2-N端蛋白亲和分离出抗LP-PLA2-N端抗体，特异性结合血液中LP-PLA2，测定出LP-PLA2酶活性；LP-PLA2-N端抗体特异性结合LP-PLA2-小分子复合物，用于筛选出植物提取物中LP-PLA2酶活性抑制剂。
结合具体实验，对本发明原理和结果作进一步说明，以下列出本发明多步实验过程：
一、提取THP-1细胞RNA
用RNeasyMinikit(QIAGEN),过程如下：
1.用RPMI1640培养液，含10%胎牛血清（FBS）,培养THP-1细胞
2.用含100nmol/lPMA新鲜细胞培养液，培养THP-1细胞3天
3.收集2X106细胞，加到15ml离心管中，加10mlPBS，用吸管吹吸混匀，离心（5000g，5分钟），去除上清液
4.用1mlPBS转移细胞到1.5ml微量离心管中，离心（5000g，3分钟），去除PBS
5.加300ulBufferRLT,微量移液器吹吸，混匀
6.带有20-gauge(直径0.9mm)针头的注射器，抽吸混合液5次
7.加300ul70%乙醇到混合溶解液中，微量移液器吹吸，混匀
8.RNeasy微型柱放在2ml收集管中，加上述700ul混合溶解液到RNeasy微型柱中
9.离心（8000g30秒）,去除收集管中液体
10.加700ulBufferRW1到RNeasy微型柱中
11.离心（8000g30秒）,去除收集管中液体
12.放RNeasy微型柱在新2ml收集管中，加500ulBufferRPE到RNeasy微型柱中
13.离心（8000g30秒）,去除收集管中液体
14.再加500ulBufferRPE到RNeasy微型柱中
15.离心（8000g2分钟）,去除收集管
16.放RNeasy微型柱在新2ml收集管中，最大速度离心(13000rpm)，1分钟
17.放RNeasy微型柱在新1.5ml微量离心管中，加30ulH2O到RNeasy微型柱中
18.放置3分钟，离心，8000g1分钟
19.1.5ml微量离心管中液体为RNA提取液，
20.用NanodropSpectrophotometer测定RNA浓度。
二.合成cDNA和PCR扩增LP-PLA2DNA
1.合成cDNA用随机引物法（cDNAsynthesiskit,LifeTechnologies,Inc.）
RNA2ul（600ng）
10mMdNTP1ul
随机引物(50ng/ul)2ul
H2O5ul
放在0.5ml微量离心管中,混匀。放置在65条件下，5分钟，放在冰块中5分钟
2.离心后，加下列物质到上述0.5ml微量离心管中
5XSSIVbuffer4ul
100mMDTT1ul
RNaseout1ul
RT1ul
H2O4ul
3.混匀，离心后，放置在5条件下，反应10分钟
4.放置在8条件下，灭活10分钟
5.加1ulE.coilRNaseH，37条件下，反应20分钟，获得cDNA
6.合成引物，引物-1，5’-CCTGTTGCCCATATGAAATCATC-3’；
引物-2，5’-AAAAATCTAGACTAATTGTATTTCTCTATTCCTG-3’
7.进行PCR
10XPCRbuffer5ul
50mMMgCl2ul
10mMdNTP1ul
25pm/ul引物-11ul
25pm/ul引物-11ul
cDNA2ul
PlatinumTaqDNAPolymerase
HighFidelity(5U/ul)0.2ul
H2O40ul
8.PCR条件如下：
A．952分钟
B．951分钟
C．561分钟
D．721分钟30秒
重复B-D步骤30次
E．951分钟30秒
F．561分钟30秒
G．726分钟
冷却到15，完成PCR
9.吸取5ulPCR产物，加2ul5XDNAloadingbuffer
10.放在1%Agarose/TBE凝胶电泳孔中，进行电泳
11.用EB进行DNA染色，紫外线下观察1.5kbDNA条带
12.其余PCR产物，加100ulH2O，再加150ul苯酚/氯仿/异戊醇（25/24/1），混合
13.离心，13000rpm,5分钟
14.收取上清液，加15ul5MNaCl,600ul乙醇，混合，-20，过夜
15.4条件下离心，13000rpm,20分钟
16.去除上清液，加600ul70%乙醇，4条件下离心，13000rpm,10分钟
17.去除上清液，干燥微量离心管底部DNA，加50ulH20溶解DNA。
三.构建pVL1392-Flag-LP-PLA2载体
1.用NdeI/XbaI内切酶（NewEnglandBiolabs）切割DNA
PCRDNA产物48ul
Cutsmartbuffer6ul
NdeI3ul
XbaI3ul
pVL1392-Flag载体DNA3ul（3ug）
Cutsmartbuffer6ul
NdeI3ul
XbaI3ul
H2045ul
混均，37反应2小时，
2.放在1%Agarose/TBE胶电泳孔中，进行电泳
3.EB进行DNA染色，紫外线下观察1.5kb（PCR产物）和9.6kb（载体）DNA条带，分别切割下DNA条带,分别放到1.5ml微量离心管中
4.用QIAquickGelExtractionKit(QIAGEN),提取Agarose条带中DNA
步骤如下：
a.加700ulBufferQG到含DNAAgarose条带微量离心管中，放在50，10分钟，每2分钟震荡一次，溶解Agarose条带
b.放QIAquick离心柱在2ml收集管中，加上述溶解液700ul到QIAquick离心柱中，放置2分钟
c.离心，3000g1分钟,去除收集管中液体
d.再离心一次，3000g1分钟
e.加700ulBufferPE到QIAquick离心柱
f.离心，12000g1分钟,去除收集管中液体
g.再离心一次，12000g1分钟，
h.放QIAquick离心柱在新微量离心管中，室温下，放置5分钟
i.加40ulH2O到QIAquick离心柱中，室温下，放置3分钟
j.离心，15000g1分钟
k.1.5ml微量离心管收集液中含有DNA，
l.用NanodropSpectrophotometer测定DNA浓度
5.用T4DNAligase(NewEnglandBiolabs.)，连接DNA片段pVL-1392-Flag载体中，
在1.5ml微量离心管中加入以下物质
PCRDNA（NdeI/XbaI）50ng
载体DNA（NdeI/XbaI）50ng
10XT4DNALigaseBuffer1ul
T4DNALigase0.5ul
H2O到10ul
混均，25反应4小时，
6.放微量离心管在冰块上，加100ul感受态细菌（XL10Gold细菌株），轻轻混合，冰块上放置30分钟
7.放微量离心管在4250秒，再放到冰块上3分钟
8.加700ulLB培养液，37摇动1小时
9.离心，10000g,5分钟，去除上清液，收集微量离心管底部细菌
10.涂种在100ug/mlAmpicillinLB-琼脂板上，37，培养过夜
11.挑选单个菌落，接种到3ml100ug/mlAmpicillinLB培养液中，37，摇动，过夜
12.提取细菌质粒DNA，用PureLinkQuickPlasmidMiniprepKits(LifeTechnologiesInc.)
a.加1.5ml细菌液到微量离心管中，离心，13000rpm3分钟,去除上清液,
b.加250ul悬浮BufferR3到微量离心管中,均匀悬浮细菌
c.加250ul溶解BufferL7到微量离心管中,上下倒置微量离心管，放置微量离心管，室温下，5分钟
d.加350ul沉淀BufferN4到微量离心管中,上下倒置微量离心管，放置微量离心管在冰块中，10分钟
e.离心，13000rpm，10分钟
f.放离心柱在2ml收集管中，转移上述离心上清液到离心柱中，放置1分钟，离心，12000g，1分钟，去除收集管中液体
g.加洗涤500ulBufferW10到离心柱中，放置1分钟，离心，12000g，1分钟，去除收集管中液体
h.加洗涤700ulBufferW9到离心柱中，放置1分钟，离心，12000g，1分钟，去除收集管中液体
i.离心，12000g，1分钟
j.放离心柱在新微量离心管中，室温下，放置3分钟
k.加75ulTEbuffer到离心柱中，室温下，放置3分钟
l.离心，12000g2分钟
m.1.5ml微量离心管收集液中含有DNA
n.用NanodropSpectrophotometer测定DNA浓度
13.用EcoRI和BamHI内切酶（NewEnglandBiolabs），切割pVL1392-Flag-LP-PLA2DNA
DNA0.5ug
Cutsmartbuffer1ul
BamHI1ul
H2O到10ul
DNA0.5ug
Cutsmartbuffer1ul
EcoRI1ul
H2O到10ul
混均，37,反应2小时，
14.放在1%Agarose/TBE胶电泳孔中，进行电泳
15.EB进行DNA染色，紫外线下观察形成DNA条带
16.选出正确大小DNA条带质粒DNA，进行LP-PLA2DNA序列测序,LP-PLA2DNA测序引物
(5’-CCTGTTGCCCATATGAAATCATC-3’;5’-AAAAATCTAGACTAATTGTATTTCTCTATTCCTG-3’)
选择出正确LP-PLA2DNA序列的pVL-1392-Flag-LP-PLA2载体，用于转染SF9细胞。
四.构建pVL1392-His-LP-PLA2-N端载体
1.用NdeI,BamHI,BglII内切酶（NewEnglandBiolabs）切割DNA
pVL1392-Flag-LP-PLA2DNA6ul（3ug）
Cutsmartbuffer6ul
NdeI3ul
BglII3ul
H2O42
pVL1392-HisDNA6ul（3ug）
Cutsmartbuffer6ul
NdeI3ul
BamHI3ul
H2042ul
混均，37反应2小时，
2.放在1%Agarose/TBE胶电泳孔中，进行电泳
3.EB进行DNA染色，紫外线下观察0.5kb（LP-PLA2-N端）和9.6kb（载体）DNA条带，并分别切割下DNA条带,分别放到1.5ml微量离心管中
4.用QIAquickGelExtractionKit(QIAGEN),从Agarose条带胶提取DNA
5.用T4DNAligase(NewEnglandBiolabs.)，连接DNA片段pVL-1392-His载体中，
在1.5ml微量离心管中加入以下物质
DNA片段（NdeI/BglII）50ng
载体DNA（NdeI/BamHI）50ng
10XT4DNALigaseBuffer1ul
T4DNALigase0.5ul
H2O到10ul
混均，25反应4小时，
6.转染连接DNA到放XL10Gold感受态细菌，获得细菌克隆，
7.用PureLinkQuickPlasmidMiniprepKits提取细菌质粒DNA。
五.制备LP-PLA2昆虫病毒（AcNPV）
1.溶液A：1.7ulBaculoGold线状杆状病毒DNA(0.17ug)（BDBiosciencesPharmingen),3ulpVL1392-Flag-LP-PLA2DNA(1.5ug),32ulTNM-FH培养液
2.溶液B：12ulCellfectin(LifeScienceCorp),28ulTNM-FH培养液
3.混合溶液A和溶液B，用微量移液器轻轻吹吸3次，室温下，放置10分钟后，加430ulTNM-FH培养液,混合均匀,成为DNA细胞转染液
4.吸出SF9细胞培养皿TNM-FH培养液，加2mlTNM-FH培养液，洗涤SF9细胞一次
5.加DNA细胞转染液到SF9细胞培养皿中，放在摇床上缓慢摇动，室温下，过夜
6.次日，从SF9细胞培养皿吸出DNA细胞转染液，加2ml含有10%FBS的TNM-FH培养液,28，培养4天
7.吸取细胞培养液到试管里，3000rpm,离心10分钟，吸出上清液，作为Flag-LP-PLA2AcNPV液
8.加2X106SF9细胞到100mm细胞培养皿中,加5ml含10%FBS的TNM-FH培养液,28，放置2小时
9.吸出旧TNM-FH培养液,加5ml含10%FBS的TNM-FH培养液，100ulFlag-LP-PLA2AcNPV液到SF9细胞培养皿中
10.室温下，轻轻摇动SF9细胞培养皿，1小时
11.加5ml含10%FBS的TNM-FH培养液到SF9细胞培养皿中，28，培养3天
12.吸取细胞培养液到试管里，3000rpm,离心10分钟，吸取上清液，为扩增Flag-LP-PLA2AcNPV液
13.用相同的步骤制备出His-LP-PLA2-N端AcNPV。
六.表达和纯化Flag-LP-PLA2蛋白
1.加8X106SF9细胞到150mm细胞培养皿中,加20ml含10%FBS的TNM-FH培养液,28，放置2小时
2.吸出旧TNM-FH培养液,加10ml含10%FBS的TNM-FH培养液，300ulFlag-LP-PLA2AcNPV到SF9细胞培养皿中
3.室温下，轻轻摇动SF9细胞培养皿，1小时
4.加20ml含10%FBS的TNM-FH培养液到SF9细胞培养皿中，28，培养3天
5.收集SF9细胞到50ml离心管中，离心，3000rpm,5分钟
6.去除上清液，加20mlPBS到离心管中，离心，3000rpm,5分钟，
7.加1mlPBS到离心管中,转移SF9细胞到1.5ml微量离心管中
8.离心，3000rpm,5分钟，去除上清液
9.加1.0ml低盐溶液(10mMHepes.pH7.5,10mMKCl,0.5%NP-40,1mMEDTA,1mMDTT,1mMPMSF,10ug/mlleupetine,10ug/mlampi)到微量离心管中,用微量移液器轻轻吹吸，混均，放置在冰块中5分钟
10.在4条件下，离心，3000rpm,5分钟，转移上清液到新1.5ml微量离心管中
11.加30ul5MNaCl到1.0mlSF9细胞上清液中，NaCl浓度调到150mM
12.在4条件下，离心，13000rpm,20分钟，转移上清液（SF9细胞溶解液）到新1.5ml微量离心管中
13.取30ulAnti-FlagM2affinityagarose（Sigma-Aldrich）放到1.5ml微量离心管中
14.加1.2ml洗涤液(20mMTris,pH8.0,500mMNaCl,5%Glycerol,0.01%NP-40,1mMEDTA,1mMDTT,1mMPMSF,10ug/mlleupetine,10ug/mlampi)到Anti-FlagM2affinityagarose微量离心管中
15.离心，3000g,1分钟，吸出上清，重复洗涤2次
16.加SF9细胞溶解液到Anti-FlagM2affinityagarose微量离心管中
17.在4条件下，摇动微量离心管，1.5小时
18.在4条件下，离心，3000rpm,1分钟，吸除上清液
19.加1.2ml洗涤液到Anti-FlagM2affinityagarose微量离心管中，在4条件下，摇动微量离心管，20分钟
20.在4条件下，离心，3000rpm,1分钟，吸除洗涤液,相同条件，重复洗涤3次
21.加20ul洗脱液（0.1MGlycine-HCl,pH3.5）到Anti-FlagM2affinityagarose微量离心管中,用微量移液器轻轻吹吸，混均，放置在冰块中5分钟
22.在4条件下，离心，6000rpm,30秒，吸取上清液，到新微量离心管中，含1ul中和液(1MTris,pH8.0,3MNaCl),混均，相同条件，重复洗脱3次
23.结合4次洗脱液，转入到透析袋(Spectra/Pro)中，放在透析液(50mMHepes,pH7.6,150mMNaCl,10%Glycerol,1mMDTT,1mMEDTA)中，在4条件下，缓慢搅动，过夜
24.收集透析袋中蛋白液体移到微量离心管中，在4条件下，离心，13000rpm,10分钟，
25.分装蛋白液到不同微量离心管中，4-20长期保存。
七.表达和纯化His-LP-PLA2-N端蛋白
1.用以上相同的步骤用His-LP-PLA2-N端AcNPV感染SF9细胞和制备SF9细胞溶解液，但溶液中不加DTT和EDTA
2.获得1.0mlSF9细胞溶解液在1.5ml微量离心管中
3.取30ulHis-SelectHFNickelaffinityGel（Sigma-Aldrich）放到1.5ml微量离心管中
4.加1.2ml洗涤液(20mMTris,pH8.0,500mMNaCl,5%Glycerol,0.01%NP-40,1mMPMSF,10ug/mlleupetine,10ug/mlampi)到NickelaffinityGel微量离心管中
5.离心，3000g,1分钟，吸出上清，重复洗涤2次
6.加1.0mlSF9细胞溶解液到NickelaffinityGel微量离心管中
7.在4条件下，摇动微量离心管，1.5小时
8.在4条件下，离心，3000rpm,1分钟，吸除上清液
9.加1.2ml洗涤液到NickelaffinityGel微量离心管中，在4条件下，摇动微量离心管，20分钟
10.在4条件下，离心，3000rpm,1分钟，吸除洗涤液,相同条件，重复洗涤3次
11.加30ul洗脱液（20mMTris,pH8.0,300mMNaCl,300mMImidazole,1mMDTT，1mMEDTA）到NickelaffinityGel微量离心管中,用微量移液器轻轻吹吸，混均，放置在冰块中10分钟
12.在4条件下，离心，6000rpm,1分钟，吸取上清液，到新微量离心管中，相同条件，重复洗脱1次
13.结合2次洗脱液，转入到透析袋(Spectra/Pro)中，放在透析液(50mMHepes,pH7.6,150mMNaCl,10%Glycerol,1mMDTT,1mMEDTA)中，在4条件下，缓慢搅动，过夜
14.收集透析袋中蛋白液体移到微量离心管中，在4条件下，离心，13000rpm,10分钟，
15.分装蛋白液到不同微量离心管中，4-20长期保存。
八.测定纯化LP-PLA2蛋白浓度和纯度
（一）银染法测定Lp-PLA2纯度和浓度
1.冻存10ul蛋白液放到37水浴中，快速溶化，放到冰块中，
2.加3ul4X蛋白样本buffer（50mMTris，pH6.8，2%SDS,10%Glycerol,1%β-mercaptoethanol,12.5mMEDTA,0.02%Bromophenolblue）,1003分钟
3.10ul牛血清白蛋白（BSA）,浓度分别为0.1，0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mg/ml加3ul4X蛋白样本buffer到不同浓度BSA样本中，1003分钟
4.加10ul蛋白液样本和10ul不同浓度BSA样本到10%SDS-PAGE凝胶的孔中，进行电泳
5.完成电泳后，获取SDS-PAGE凝胶，进行银染色，步骤如下：
a.加100ml50%Methanol到SDS-PAGE凝胶的容器中，室温下，缓慢摇动，15分钟，
去除Methanol液体
b.加100ml5%Methanol到SDS-PAGE凝胶容器中，室温下，缓慢摇动，10分钟，去除Methanol液体,用水洗涤SDS-PAGE凝胶1次
c.加10ulDTT到SDS-PAGE胶容器中,有200ml水，室温下，缓慢摇动，10分钟，去除DTT液体,用水洗涤SDS-PAGE凝胶1次
d.加100ml0.1%AgNO3到SDS-PAGE凝胶容器中，室温下，缓慢摇动，15分钟，去除AgNO3液体,用水洗涤SDS-PAGE凝胶2次
e.加100ml3%Na2CO3&0.05%Formaldehyde到SDS-PAGE凝胶容器中，室温下反应，看到清晰蛋白条带为止
f.加CriticAcid到SDS-PAGE凝胶容器中,终止反应
g.用水清洗SDS-PAGE胶后，干躁SDS-PAGE凝胶,判断Flag-LP-PLA2纯度和浓度。
（二）Bradford法测定Flag-Lp-PLA2浓度
1．取1ml浓缩染料试剂（Bio-RadProteinAssayDyeReagentConcentrate）与4mlH2O
混合均匀
2.制备BSA标准液,浓度分别为0，0.125，0.25,0.5,0.75,1.0mg/ml
3.加95ulPBS到微量滴定板孔中，加5ul不同浓度BSA标准液，5ul纯化Flag-LP-PLA2，
His-LP-PLA2-N蛋白到微量滴定板孔中，每个样本加3个孔
4.加100ul稀释染料试剂到微量滴定板孔中，反应5分钟
5.放微量滴定板到Victor3V1420MultilabelCounter，选用波长495nm,测定吸收值
6.根据BSA浓度标准曲线，计算出Flag-LP-PLA2浓度为0.22mg/ml,His-LP-PLA2-N
浓度为0.73mg/ml
（三）用Westernblotting测定纯化Flag-LP-PLA2
1.冻存Flag-LP-PLA2蛋白液放到37水浴中，快速溶化，放到冰块中，用PBS1:10稀释蛋白液
2.10ul稀释蛋白液加3ul4X蛋白样本buffer,1003分钟
3.加10ul稀释蛋白液样本加到10%SDS-PAGE凝胶的孔中，进行电泳，100V，2小时
4.完成电泳后，获取SDS-PAGE凝胶
5.转移SDS-PAGE凝胶上蛋白到硝基纤维素膜上用蛋白转移Buffer，30V，2小时
6.用5%脱脂牛奶粉在TBSBuffer(20mMTris,pH7.5,150mMNaCl,0.05%Tween-20),封闭硝基纤维素膜，室温，1小时，用TBSBuffer洗涤硝基纤维素膜一次，
7.加1：2000稀释兔抗LP-PLA2抗体（SantaCruzBiotech）在1%脱脂牛奶粉-TBSBuffer到硝基纤维素膜容器中，在4条件下，缓慢摇动，过夜
8.倒出抗体液，用TBSBuffer洗涤硝基纤维素膜3次，每次20分钟
9.加1：5000稀释抗兔IgG抗体-HRP（Promega）在1%脱脂牛奶粉-TBSBuffer到硝基纤维素膜容器中，室温下，缓慢摇动，1.5小时
10.倒出抗体液，用TBSBuffer洗涤硝基纤维素膜3次，每次20分钟
11.加ECLWesternblotting底物（Pierce）液到硝基纤维素膜上，反应2分钟
用ImageReaderLAS-4000(FUJIFILM)测定Westernblot结果。
九、测定Flag-LP-PLA2酶活性
1.13.9mgP-Nitrophenol溶解在1ml乙醇中(100mM)，用H2O稀释P-Nitrophenol浓度到
0,50,100,200,400，600nmol/ml
2.加80ul反应液（200mMHepespH7.6,150mMNaCl,5mMEDTA)和20ul不同稀释
浓度P-Nitrophenol到微量滴定板孔中（P-Nitrophenol浓度稀释5倍）
3.放微量滴定板反到Victor3V1420MultilabelCounter，选用波长405nm，测定OD值
4.获得不同浓度P-NitrophenolOD值，制出P-Nitrophenol浓度与OD值相关曲线
5.计算出相关曲线斜率（K）
K=80-40nmol/OD80nmol–OD40nmol
K=80-40nmol/0.922-0.452=85.1nmol
6.用稀释液(50mMHepes,150mMNaCl,1mMEDTA)稀释Flag-LP-PLA2浓度到50,
100,200，400ng/ml
7.加60ul反应液和20ul不同稀释浓度Flag-LP-PLA2到微量滴定板孔中，再加20ul
底物反应液（20mMCitricacidmonohydrate,pH4.5,10%Ethanol,
3.5mMl-myristoyl-2-(4-nitrophenylsuccinyl)phosphatidylcholine,MNP）
8.立即放微量滴定板Victor3V1420MultilabelCounter，选用波长405nm，在2,3,4,5,6,
7,8分钟，测定OD值
9.获得不同浓度Flag-LP-PLA2,不同时间点OD值
10.计算出不同浓度Flag-LP-PLA2酶活性（UI，nmol/ml/min）
例1：100ng/mlFlag-LP-PLA2酶活性(IU)=K(OD4min–OD3mim/4min-3mnin)/0.02ml
100ng/mlFlag-LP-PLA2酶活性(IU)=85.1nmol(0.294-0.218/4-1min)/0.02ml=323nmol/min/ml。
十、产生LP-PLA2抗体
1.(Day0)采集2mlNewZealand兔血液
2.(Day1)1mlFlag-Lp-PLA2(0.4mg/ml)与1ml福氏完全佐剂(CFA)混合,10点皮下注射到NewZealand兔（0.2ml/每点）
3.(Day14)0.5mlFlag-Lp-PLA2(0.4mg/ml)与0.5ml福氏不完全佐剂(IFA)混合,5点皮下注射到NewZealand兔（0.2ml/每点）
4.(Day28)0.5mlFlag-Lp-PLA2(0.4mg/ml)与0.5ml福氏不完全佐剂(IFA)混合,5点皮下注射到NewZealand兔（0.2ml/每点）
5.(Day35)采集25mlNewZealand兔血液
6.(Day42)0.5mlFlag-Lp-PLA2(0.4mg/ml)与0.5ml福氏不完全佐剂(IFA)混合,5点皮下注射到NewZealand兔（0.2ml/每点）
7.(Day56)采集25mlNewZealand兔血液,
8.(Day60)采集50mlNewZealand兔血液,终止实验
9．测定LP-PLA2-N端抗体的特异性，效价和滴度
a.100ulHis-Lp-PLA2-N蛋白（10ug/ml）在50mmol碳酸盐缓冲液,pH9.6,加到
微量滴定板孔中；同时，加His-WRN-N蛋白（10ug/ml）作为对照组，在4℃条件下过夜,
吸出蛋白液
b.加100μlBSA(100ug/ml)溶液到微量滴定板孔中，在4℃条件下，
封闭2小时，吸出BSA液，用TBS（50mmolTris，150mmolNaCl,pH7.6）洗涤1次。
c.加入100ul不同稀释度的抗血清（1:100,1:500,1:1000，1:2000）
到微量滴定板孔中,在室温下,缓慢摇动60分钟,吸除反应液，
d.用TBS,含0.005%Tween-20洗涤微量滴定板3次，每次10分钟
e.加1:5000稀释100ul抗兔IgG抗体-HRP（Promega）
到微量滴定板孔中,在室温下,缓慢摇动60分钟,吸除抗体液，
f.用TBS,含0.005%Tween-20洗涤微量滴定板3次，每次10分钟
g.加100ulHRP底物(TMBSubstratebuffer,SantaCruzBiotechInc.),反应10分钟
h.加50ul2NH2so4,终止反应，
i．10分钟后，放微量滴定板到Victor3V1420MultilabelCounter，选用波长405nm或450nm，
测定OD值
。
十一、亲和层析法分离抗LP-PLA2-N端抗体
1.纯化His-LP-PLA2-N端蛋白（5mg）溶解在5ml连接Buffer(0.2MNaHCO3,0.5MNaCl,pH8.3)中
2.用30ml低温1mMHCl，反复加到NHS活化亲和柱(5mlHiTrap,Pharmacia)，洗出异丙醇
3.立即加连接Buffer蛋白溶解液到NHS活化亲和柱中，封闭NHS活化亲和柱，室温下，30分钟
4.加30mlBuffeA(0.5MEthanolamine,0.5MNaCl,pH8.3)洗涤蛋白亲和柱
5.加30mlBuffeB(0.1MAcetate,0.5MNaCl.,pH4.0)洗涤蛋白亲和柱
6.再加30mlBuffeA洗涤蛋白亲和柱，室温下，BufferA条件下，放置30分钟
7.再加30mlBuffeB洗涤蛋白亲和柱
8.再加30mlBuffeA洗涤蛋白亲和柱
9.再加30mlBuffeB洗涤蛋白亲和柱
10.加20ml中性Buffer（50mMNa2HPO4）洗涤蛋白亲和柱
11.15mlLP-PLA2抗血清与15ml稀释Buffer（20mMTrispH7.5）混合，并通过0.22um滤膜
12.加30mlLP-PLA2抗血清稀释液通过蛋白亲和柱，反复这一步10次
13.加100ml洗涤bufferA(20mMTris,pH7.5)洗涤蛋白亲和柱
14.加100ml洗涤bufferB(20mMTris,pH7.5，0.5MNaCl)洗涤蛋白亲和柱
15.加1ml洗脱buffer(100mMGlycine,pH2.2)通过蛋白亲和柱，收集洗脱液，放到有
40ul2MTris,pH9.0微量离心管中，混均，反复这一步15次
16.每个微量离心管中，取出10ul洗脱液，3ul4X蛋白样本Buffer1003分钟
17.加10ul洗脱液样本到10%SDS-PAGE凝胶孔中，进行电泳,100V,2小时
18．完成电泳后，获取SDS-PAGE凝胶，进行银染色，观察抗体纯度和浓度
19.抗体含量高的洗脱液混合一起，转入透析袋中，用2000mlPBS透析洗脱液，4，过夜
20．用纯化LP-PLA2-N端抗体进行ELIAS确定纯化抗体的效价和特异性
21.用纯化LP-PLA2-N端抗体（40ng/ml）进行WesternBlotting，确定纯化抗体特异性。
十二、测定血液样品中LA-PLA2酶活性
1.100ul抗Lp-PLA2-N端抗体（5ug/ml）在50mM碳酸盐缓冲液,pH9.6,加到
微量滴定板每孔中，在4℃条件下,过夜
2.吸除抗体反应液,加200μlBSA(100ug/ml)溶液到每孔中，在4℃条件下，封闭2小时
3．吸除封闭液，用200ulTBSBuffer（50mmolTris，150mmolNaCl,pH7.6）洗涤一次
4．加80ulTBSBuffer和20ul血清或血浆样品到孔中,在室温下,反应30分钟,
5．吸除反应液，用200ulTBSBuffer,含0.005%Tween-20，洗涤反应孔二次
6.加80ul溶液A（200mMHepespH7.6,150mMNaCl,5mMEDTA)+20ul
溶液B（3.0mM酶底物（MNP），10%Ethanol,20mMCitricacidmonohydrate,pH4.5）,反应
5分钟
7.立即放微量滴定板到Victor3V1420MultilabelCounter，选用波长405nm，测定OD值
8.用0，50，100，200，400，800UIFlag-LP-PLA2做出酶活性-OD值标准曲线，计算出血液样品中
LP-PLA2酶活性UI
。
十三、测定植物提取物中小分子抑制LA-PLA2酶活性
1.100ul抗Lp-PLA2-N端抗体（5ug/ml）在50mM碳酸盐缓冲液,pH9.6,加到
微量滴定板每孔中，在4℃条件下,过夜
2.吸除抗体反应液,加200μlBSA(100ug/ml)溶液到每孔中，在4℃条件下，封闭2小时
3．吸除封闭液，用200ulTBSBuffer洗涤一次
4．500ng纯化Flag-LP-PLA2加100ulDarapladib（MedChemExpress），植物提取物，或阳性对照液体中,混合均匀
5．加100ul混合液到孔中,在室温下,反应30分钟,
5．吸除混合液，用200ulTBSBuffer,含0.005%Tween-20，洗涤反应孔二次
6.加80ul溶液A（200mMHepespH7.6,150mMNaCl,1mMEDTA)+20ul
溶液B（3.0mM酶底物（MNP），10%Ethanol,200mMHepespH7.6）,反应
6分钟
7.立即放微量滴定板到Victor3V1420MultilabelCounter，选用波长405nm，测定OD值
8.用纯化Flag-LP-PLA2做出酶活性标准曲线，计算出植物提取物和阳性对照样品中LP-PLA2酶活性
9．测算出植物提取物小分子对LP-PLA2酶活性抑制作用，酶活性抑制值（UI）=阳性对照样品UI-
植物提取物样品UI
。

Claims (5)

1.一种自然酶活性脂蛋白相关磷脂酶A2及制备过程，其特征在于：
提取THP-1RNA，合成THP-1cDNA基因库，用PCR扩增出LP-PLA2DNA，构建pVL1392-Flag-LP-PLA2载体；
pVL1392-Flag-LP-PLA2载体与线性AcNPVDNA共转染到SF9细胞，产生重组Flag-LP-PLA2AcNPV；
重组Flag-LP-PLA2AcNPV感染SF9细胞并表达出带有8个氨基酸残基短肽LP-PLA2；
用Anti-FlagM2affinityagarose纯化出具有自然酶活性和抗原性Flag-LP-PLA2蛋白；
构建pVL1392-His-LP-PLA2-N载体，产生重组His-LP-PLA2-NAcNPV，感染SF9细胞并表达出带有6个氨基酸残基短肽LP-PLA2-N；
His-SelectHFNickelaffinityGel纯化出His-LP-PLA2-N端蛋白并制备成His-LP-PLA2-N端蛋白亲和层析柱；
Flag-LP-PLA2免疫动物产生LP-PLA2抗血清，用His-LP-PLA2-N端蛋白亲和层析柱，分离和纯化出抗LP-PLA2-N端抗体。
2.权利要求1所述自然酶活性脂蛋白相关磷脂酶A2及制备过程，其特征在于：pVL1392-Flag-LP-PLA2载体的构建：提取THP-1细胞RNA,用于合成cDNA，用PCR扩增出LP-PLA2DNA，其核酸序列84-1326；选用昆虫细胞表达载体pVL1392-Flag-----9.64kb,有Polyhedrin启动子，在昆虫细胞中表达外源性蛋白；带有部分AcNPVDNA序列，用于产生基因重组昆虫病毒；此载体插入8个氨基酸残基----DYKDDDDK短肽DNA序列,用于表达Flag融合蛋白；用内切酶NdeI/XbaI切割LP-PLA2DNA和pVL1392-Flag，将LP-PLA2DNA连接到pVL1392-FlagNdeI/XbaI部位，构建成pVL1392-Flag-LP-PLA2载体。
3.权利要求1所述自然酶活性脂蛋白相关磷脂酶A2及制备过程，其特征在于：pVL1392-His-LP-PLA2-N载体构建：pVL1392-His载体插入6个组氨基酸残基短肽DNA序列,用于表达His融合蛋白，用内切酶NdeI/BglII切割pVL1392-Flag-LP-PLA2，将获得LP-PLA2-N端DNA连接到pVL1392-HisNdeI/BamHI部位，构建成pVL1392-His-LP-PLA2-N载体。
4.权利要求1所述自然酶活性脂蛋白相关磷脂酶A2及制备过程，其特征在于：His-LP-PLA-N端蛋白亲和层析柱的制备：pVL1392-His-LP-PLA2-N载体与AcNPV线性DNA共转染SF9细胞，产生重组His-LP-PLA2-NAcNPV；用此病毒感染SF9细胞，表达出His-LP-PLA2-N端蛋白，用纯化His-LP-PLA2-N端蛋白进行SDS-PAGE电泳，再做银染法，连接His-LP-PLA2-N端蛋白到NHS活化亲和层析柱上，制备His-LP-PLA-N端蛋白亲和层析柱。
5.权利要求1或4所述自然酶活性脂蛋白相关磷脂酶A2及制备过程，其特征在于：表达LP-PLA2-N端蛋白呈现32-183氨基酸残基，N端带有His标记短肽，用His-SelectHFNickelaffinityGel纯化出His-LP-PLA2-N端蛋白。
CN201510525323.7A 2015-08-25 2015-08-25 自然酶活性脂蛋白相关磷脂酶a2及制备过程 Pending CN105219750A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510525323.7A CN105219750A (zh) 2015-08-25 2015-08-25 自然酶活性脂蛋白相关磷脂酶a2及制备过程

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510525323.7A CN105219750A (zh) 2015-08-25 2015-08-25 自然酶活性脂蛋白相关磷脂酶a2及制备过程

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105219750A true CN105219750A (zh) 2016-01-06

Family

ID=54989020

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510525323.7A Pending CN105219750A (zh) 2015-08-25 2015-08-25 自然酶活性脂蛋白相关磷脂酶a2及制备过程

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105219750A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106290190A (zh) * 2016-08-05 2017-01-04 长春恒晓生物科技有限责任公司 测定mpo卤化酶活性的方法
CN106872687A (zh) * 2017-02-22 2017-06-20 海格德生物科技（深圳）有限公司 脂蛋白相关磷脂酶Lp‑PLA2活性及总量检测试剂盒及其制备方法
CN108840918A (zh) * 2018-06-14 2018-11-20 浙江农林大学 蟾蜍磷脂酶a2抑制剂pli及其编码基因与克隆方法
CN109239334A (zh) * 2018-09-10 2019-01-18 吉林大学 建立时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1556114A (zh) * 2004-01-08 2004-12-22 �Ϻ���ͨ��ѧ 人干细胞因子巨噬细胞集落刺激因子双功能蛋白及制备
CN104231052A (zh) * 2013-06-18 2014-12-24 深圳市安群生物工程有限公司 人Lp-PLA2抗原表位肽、抗原、抗体、用途及试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1556114A (zh) * 2004-01-08 2004-12-22 �Ϻ���ͨ��ѧ 人干细胞因子巨噬细胞集落刺激因子双功能蛋白及制备
CN104231052A (zh) * 2013-06-18 2014-12-24 深圳市安群生物工程有限公司 人Lp-PLA2抗原表位肽、抗原、抗体、用途及试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
周游: "基于B细胞表位的抗体制备新技术研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106290190A (zh) * 2016-08-05 2017-01-04 长春恒晓生物科技有限责任公司 测定mpo卤化酶活性的方法
CN106290190B (zh) * 2016-08-05 2019-01-25 长春恒晓生物科技有限责任公司 测定mpo卤化酶活性的方法
CN106872687A (zh) * 2017-02-22 2017-06-20 海格德生物科技（深圳）有限公司 脂蛋白相关磷脂酶Lp‑PLA2活性及总量检测试剂盒及其制备方法
CN108840918A (zh) * 2018-06-14 2018-11-20 浙江农林大学 蟾蜍磷脂酶a2抑制剂pli及其编码基因与克隆方法
CN109239334A (zh) * 2018-09-10 2019-01-18 吉林大学 建立时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Structural mechanism for GSDMD targeting by autoprocessed caspases in pyroptosis
Porrett et al. First clinical‐grade porcine kidney xenotransplant using a human decedent model
CN105219750A (zh) 自然酶活性脂蛋白相关磷脂酶a2及制备过程
Inoue et al. Overexpression of lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 induces intramyocardial vasculopathy in apolipoprotein E–null mice
Thorp et al. Mertk receptor mutation reduces efferocytosis efficiency and promotes apoptotic cell accumulation and plaque necrosis in atherosclerotic lesions of apoe−/− mice
Konishi et al. Hydrogen peroxide activates the Gas6-Axl pathway in vascular smooth muscle cells
CN1636594B (zh) 血管生成抑制素和用于抑制血管生成的方法
Muiño et al. Molecular and immunological characterization of Fasciola antigens recognized by the MM3 monoclonal antibody
Wootton et al. Lung cancer induced in mice by the envelope protein of jaagsiekte sheep retrovirus (JSRV) closely resembles lung cancer in sheep infected with JSRV
Whidby et al. Blocking hepatitis C virus infection with recombinant form of envelope protein 2 ectodomain
Kachko et al. Inhibition of hepatitis C virus by the cyanobacterial protein Microcystis viridis lectin: mechanistic differences between the high-mannose specific lectins MVL, CV-N, and GNA
CN101802188A (zh) 用于因子xa抑制剂的解毒剂和其使用方法
CN104792982B (zh) 一种阿司匹林耐药性监测试剂
KR20180056119A (ko) 지카 바이러스의 표피단백질과 비구조단백질 1에 특이적인 단클론항체를 이용한 지카 바이러스 항체의 검출방법 및 지카 바이러스 항체 검출을 위한 신속진단키트
KR20010024340A (ko) Ｃ형 간염 바이러스의 측정방법
de la Torre-Escudero et al. Molecular and functional characterization of a Schistosoma bovis annexin: fibrinolytic and anticoagulant activity
Yu et al. Protective effect of the silkworm protein 30Kc6 on human vascular endothelial cells damaged by oxidized low density lipoprotein (Ox-LDL)
Wang et al. Double-membraned liposomes sculpted by poliovirus 3AB protein
Chaimon et al. Molecular characterization and functional analysis of the Schistosoma mekongi Ca 2+-dependent cysteine protease (calpain)
KR19990022114A (ko) 추출되어 미처리된 폴리펩타이드를 사용하는 양성 스트랜드 ｒｎａ 바이러스의 진단 및 이에 대한 백신화 방법
US20080009442A1 (en) Therapeutic use for alpha1 proteinase inhibitor in hematopoiesis
CA2603615A1 (en) Methods of reducing viral infection and kits therefore
TW200427463A (en) Compositions and methods for the detection and treatment of methylthioadenosine phosphorylase deficient cancers
CN103969452A (zh) 索拉菲尼个性化治疗肝癌的分型诊断试剂盒
CN101687008A (zh) 用于动脉硬化性疾病的靶向Salusin的治疗剂和检测试剂

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160106

RJ01 Rejection of invention patent application after publication