CN105219670A - 一株用于降解多种亚硝胺的苏云金芽孢杆菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株用于降解多种亚硝胺的苏云金芽孢杆菌，属于水环境中亚硝胺类物质的微生物降解技术领域。本发明的技术方案要点为：一株用于降解多种亚硝胺的苏云金芽孢杆菌（<i>Bacillus？sp.</i>），于2014年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC？No.？10067。本发明的苏云金芽孢杆菌可用于被亚硝胺类物质污染的饮用水中，降解去除多种亚硝胺类物质，对亚硝胺类物质污染的饮用水进行生物处理，降低其健康安全风险水平。
Description
技术领域
本发明属于水环境中亚硝胺类物质的微生物降解技术领域，具体涉及一株用于降解多种亚硝胺的苏云金芽孢杆菌。
背景技术
由于大多数亚硝胺类物质具有潜在的致癌、致畸和致突变作用，因此供水系统中亚硝胺类物质的存在引起了较为严重的公共健康安全问题。美国环保局（UPEPA）将亚硝基二甲胺（NDMA）、亚硝基二乙胺（NDEA）、亚硝基甲乙胺（NMEA）、亚硝基二丙胺（NDPA）、亚硝基吡咯烷（NPyr）和亚硝基二丁胺（NDBA）等6种亚硝胺类物质列入非控制性污染物检测名单2（UCMR2）和污染物控制名单3。针对饮用水中存在的NDMA、NDEA和NDPA，部分国家和地区的暂定标准不超过10ng/L。但目前国内外许多饮用水厂水源及出水中检测到的亚硝胺浓度水平均超过此标准。
为有效去除亚硝胺物质，部分饮用水处理过程中采用反渗透（RO）、紫外（UV）和其它高级氧化技术（UV/H2O2，O3/H2O2）进行控制，但实际处理中只有部分亚硝胺类物质得到去除，而且这些处理单元普遍存在费用高及装置复杂等问题而不能普遍推广。另外，由于国内外水厂普遍采用预氧化技术降低后续处理单元的负荷，导致亚硝胺类物质在过滤和消毒处理单元之前提前产生。目前普遍存在的后续处理单元不能有效去除。与化学氧化及其它常规水处理技术相比，生物处理法因具有去除率高、处理成本低和操作简便等特点在水处理的生物过滤单元得到广泛应用；另外，生物处理法不但能有效提高活性炭过滤单元中炭的再生周期，而且由于不添加任何外来化学物质而能有效避免化学处理引起的二次污染，从而降低饮用水的健康安全风险水平。针对饮用水处理过程中采用的生物处理技术，首要任务是筛选针对亚硝胺类物质的有效降解菌株并进行降解效果评价。
关于亚硝胺类物质的生物降解方面的研究国内外进展较少。为此，从自然界中筛选出对亚硝胺类物质有高效降解能力的菌株并且应用于饮用水中亚硝胺类物质的去除将有实际的应用价值。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题，从自然界中筛选出一株苏云金芽孢杆菌，该苏云金芽孢杆菌能够有效降解多种亚胺类物质，并且该菌株能够有效降解饮用水氯胺消毒过程中出现的亚硝胺及被亚硝胺污染的饮用水中的亚硝胺类物质，在饮用水净化处理方面具有良好的应用前景。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一株用于降解多种亚硝胺的苏云金芽孢杆菌（Bacillussp.），于2014年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCCNo.10067。
所述的苏云金芽孢杆菌（Bacillussp.）具有以下特征：
（1）苏云金芽孢杆菌革兰氏染色反应为阳性，细胞形态为长杆状，生芽孢，无荚膜，长度为1.5-3.0μm，形成芽胞膨大为圆形，大小在(0.8-0.9)×2.0μm，伴孢晶体为长方形或菱形；
（2）苏云金芽孢杆菌菌株在固体富集培养基的琼脂平板上的菌落形态一致，培养3天的菌落形态为滴蜡状，淡黄色，不透明，边缘不规则并伴有略微凸起，呈齿状；
（3）16SrRNA基因序列特征为：苏云金芽孢杆菌菌株的16SrRNA序列长度为1167bp。
本发明所述的苏云金芽孢杆菌在降解亚硝胺类物质中的应用。
进一步限定，所述的亚硝胺类物质为亚硝基甲乙胺（NMEA）、亚硝基二丙胺（NDPA）、亚硝基二丁胺（NDBA）、亚硝基吡咯烷（Npyr）和亚硝基哌啶（NPip）中的一种或多种。
进一步限定，所述的苏云金芽孢杆菌在降解亚硝胺类物质中的应用，其具体通过以下方式实现：（1）苏云金芽孢杆菌湿细胞的制备，用接种环取苏云金芽孢杆菌的新鲜斜面菌种，划线接种于固体富集培养基中，25℃培养5天后得到长有明显菌落的培养基平板，获得新鲜的苏云金芽孢杆菌湿细胞；（2）取苏云金芽孢杆菌湿细胞接种于含有亚硝胺类物质的矿物盐培养基中，在避光条件下于25℃对矿物盐培养基中的亚硝胺类物质进行降解，其中每100mL矿物盐培养基中接种0.6g苏云金芽孢杆菌湿细胞。
进一步限定，所述的含有亚硝胺类物质的矿物盐培养基中的亚硝胺类物质为亚硝基二甲胺、亚硝基甲乙胺、亚硝基二乙胺、亚硝基二丙胺、亚硝基吗啉、亚硝基吡咯烷、亚硝基哌啶、亚硝基二丁胺和亚硝胺二苯胺。
本发明所述的苏云金芽孢杆菌在降解饮用水中亚硝胺类物质中的应用。
进一步限定，所述的亚硝胺类物质为亚硝基甲乙胺（NMEA）、亚硝基二丙胺（NDPA）、亚硝基二丁胺（NDBA）、亚硝基吡咯烷（Npyr）和亚硝基哌啶（NPip）中的一种或多种。
进一步限定，所述的苏云金芽孢杆菌在降解饮用水中亚硝胺类物质中的应用，其具体通过以下方式实现：（1）苏云金芽孢杆菌湿细胞的制备，用接种环取苏云金芽孢杆菌的新鲜斜面菌种，划线接种于固体富集培养基中，25℃培养5天后得到长有明显菌落的培养基平板，获得新鲜的苏云金芽孢杆菌湿细胞；（2）取苏云金芽孢杆菌湿细胞接种于饮用水中，在避光条件下于25℃对饮用水中的亚硝胺类物质进行降解，其中每100mL饮用水中接种0.6g苏云金芽孢杆菌湿细胞，并且饮用水在接种苏云金芽孢杆菌湿细胞之前用磷酸盐缓冲液调节饮用水的pH=7.3。
进一步限定，所述的磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的混合溶液，其具体配制过程为：于800mL蒸馏水中加入8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠和0.24g磷酸二氢钾，用盐酸调节pH至7.2，加水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌20分钟后保存于室温备用。
本发明具有以下有益效果：
（1）本发明筛选的苏云金芽孢杆菌对多种亚硝胺类物质具有较好的降解效果，特别是对于饮用水中痕量浓度（≤200ng/L）的亚硝胺类物质在短时间内的降解去除率范围为38%-80%；
（2）本发明筛选的苏云金芽孢杆菌用于处理饮用水中经预氯化提前生成的亚硝胺类物质，能有效降解亚硝基甲乙胺（NMEA）、亚硝基二丙胺（NDPA）、亚硝基二丁胺（NDBA）、亚硝基吡咯烷（Npyr）和亚硝基哌啶（NPip）5种亚硝胺，有效提高饮用水的安全性；
（3）本发明筛选的苏云金芽孢杆菌可用于被亚硝胺类物质污染的水中，降解去除亚硝胺类物质，对亚硝胺类物质污染的水进行生物修复，降低其健康安全风险水平；
（4）本发明筛选的苏云金芽孢杆菌可投加于生物活性炭工艺单元，作为对亚硝胺类物质进行生物降解的深度强化处理手段，方法简单，运行及维护成本较低，在规模化处理亚硝胺类物质中具有良好的应用前景。
附图说明
图1是本发明筛选的苏云金芽孢杆菌在培养基上的菌落图；
图2是本发明苏云金芽孢杆菌菌株的细胞形态图；
图3是本发明中苏云金芽孢杆菌在矿物盐培养基以亚硝胺作为碳源降解5种亚硝胺类物质的质量浓度变化曲线；
图4是本发明实施例3中苏云金芽孢杆菌对饮用水中5种亚硝胺类物质降解的质量浓度变化曲线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1菌株的分离与纯化
1、培养基的制备
（1）液体富集培养基
TryptonyeSoyaBroth（OxoidLTD,England）30g，超纯水1000mL，固体富集培养基使用前在121℃下恒温灭菌20分钟。
（2）固体富集培养基
TryptonyeSoyaBroth（OxoidLTD,England）30g，琼脂20g，超纯水1000mL，固体富集培养基使用前在121℃下恒温灭菌20分钟。
（3）选择性矿物盐培养基
K2HPO4·3H2O：4.25.00g，NaH2PO4·H2O：1.00g，MgSO4·7H2O：0.20g，FeSO4·7H2O：0.012g，MnSO4·H2O：0.003g，ZnSO4·7H2O：0.003g，CoSO4·7H2O：0.001g，NH4Cl2.0g，超纯水1000mL，pH=7.3，矿物盐培养基在121℃下恒温灭菌20分钟。
2、磷酸盐缓冲液
磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的混合溶液，pH为7.2。
在800mL蒸馏水中加入8g氯化钠，0.2g氯化钾，1.44g磷酸氢二钠和0.24g磷酸二氢钾，用盐酸调节pH至7.2，加水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌20分钟后保存于室温，备用。
3、驯化富集培养
在生物活性炭过滤装置进行微生物驯化富集培养，该驯化处理装置中用水取自饮用水处理厂生物活性炭滤池出水，在水中加入亚硝基二甲胺（NDMA）、亚硝基甲乙胺（NMEA）、亚硝基二乙胺（NDEA）、亚硝基二丙胺（NDPA）、亚硝基吗啉（NMor）、亚硝基吡咯烷（Npyr）、亚硝基哌啶（NPip）、亚硝基二丁胺（NDBA）和亚硝胺二苯胺（NDphA）等9种亚硝胺类物质，活性炭为饮用水处理厂运营三年以上的生物活性炭。在驯化柱中填充活性炭，用蠕动泵使进水在驯化处理装置中循环流动，保持水力停留时间20min，水流经活性炭吸附柱，进行吸附和生物降解处理，其中驯化处理装置在常温（25℃）条件下连续运行2个月，生物活性碳吸附柱的总容积为500mL，进水的亚硝胺类物质的质量浓度为10μg/L，DOC含量为0.6mg/L，DO含量为3.0mg/L。
称取采集于驯化装置中生物活性炭10g，放入250mL三角瓶中，加入50mL磷酸盐缓冲液，并加适量玻璃珠，置于振荡器快速震荡4-5h。所得到的生物膜悬液为附着生物膜悬液，取5mL所得生物膜悬液，接种于事先灭菌的250mL亚硝胺类物质的质量浓度为1.0μg/L的液体富集培养基中，25℃避光培养7天，获得第一代培养液，共传代3次。
4、分离纯化培养
将第三代培养液稀释106倍后接种于固体富集培养基平板，放入恒温培养箱中于25℃下培养5天。挑取平板上形成的单个菌落，划线接种于固体培养基中，进行分离培养，于25℃下培养5天后对平板培养物进行显微镜检查，如果获得的培养物菌种不纯，则按上述方法挑取平板培养物划线接种于平板分离、纯化培养基中继续纯化，直到显微镜检查结果表明为纯菌为止，经纯化得到纯苏云金芽孢杆菌菌株。
实施例2苏云金芽孢杆菌菌株的微生物学特性研究
1、菌落形态观察
将分离纯化培养得到的苏云金芽孢杆菌菌株株划线接种于固体富集培养基中，于25℃下培养至长出菌落，观察菌落形态，结果如下表明菌株的菌落特征为：在固体富集培养基平板上培养5天的菌落形态为滴蜡状，直径大小约为1-2mm，淡黄色，不透明，边缘不规则并伴有略微凸起，呈齿状，如图1所示。
2、细胞形态观察
挑取在固体富集培养基平板上培养5天的菌株菌落，依次用戊二醛固定、磷酸盐缓冲液（pH=7.3）漂洗、梯度乙醇脱水、醋酸异戊酯处理以及二氧化碳临界点干燥、喷金、将样品放入观察室后进行电镜扫描，电镜扫描结果如图2，表明细胞形态为长杆状，生芽孢，无荚膜，长度为1.5-3.0μm，形成芽胞膨大为圆形，大小在(0.8-0.9)×2.0μm。
3、16SrRNA基因序列测定
将接种于液体富集培养基中的单胞菌株于25℃，180rpm培养5天后的细胞收集后采用DNA提取试剂盒（FastDNASPINkit,TakaraBiotechnologyCo.,Ltd.,Japanese）提取单胞菌的DNA，送测序公司进行测序，将测序结果在NCBI基因文库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行比对。其中，菌株的16SrRNA（SEQIDNO.1）序列长度为1167bp。
根据菌株的菌落形态特征，细胞形态特征以及其16SrRNA基因序列的比对结果，鉴定菌株属于苏云金芽孢杆菌属Bacillusspecies。
实施例3苏云金芽孢杆菌的应用
1、制备苏云金芽孢杆菌单胞菌株的湿细胞
用接种环取苏云金芽孢杆菌的新鲜斜面菌种，划线接种于固体富集培养基上，25℃温度下，培养5天后得到长有明显菌落的培养基平板，获得新鲜苏云金芽孢杆菌湿细胞。
2、以亚硝胺为碳源进行降解试验
挑取菌种苏云金芽孢杆菌的湿细胞接种于矿物盐培养基中，在避光条件下，于25℃进行培养，其中，每100mL矿物盐培养基中接种0.6g湿细胞；矿物盐培养基中的9种亚硝胺类物质的质量浓度分别为200ng/L，每隔1h震荡1min。检测方法根据前期研究，采用超高液相串联质谱（UPLC/MS/MS）测定，测定接种前和接种后第5天中矿物盐培养基中亚硝胺的质量浓度值，测定结果如图3所示。
同时准备无苏云金芽孢杆菌的矿物盐培养基，在121℃下恒温灭菌20分钟，得到无生物活性的对照组，其余条件相同，测定培养前和培养第5天的相应矿物盐培养基中亚硝胺类物质的质量浓度。
测定结果表明：扣除空白对照，本发明中筛选的苏云金芽孢杆菌以其中5种亚硝胺为碳源进行降解，具有很好的效果，在接种量为0.6g苏云金芽孢杆菌菌湿细胞/100mL矿物盐培养基时，接种5天后亚硝基甲乙胺（NMEA）、亚硝基二丙胺（NDPA）、亚硝基二丁胺（NDBA）、亚硝基吡咯烷（Npyr）和亚硝基哌啶（NPip）的去除率分别为41.4%、15%、14.6%、8.8%和11.8%，进而表明矿物盐培养基中亚硝胺类物质的变化是由苏云金芽孢杆菌引起的，且以亚硝胺为碳源降解效率高于以其为氮源，因此，苏云金芽孢杆菌以亚硝胺为碳源能够有效地进行降解，可用于亚硝胺类物质的降解。
3、去除饮用水中亚硝胺类物质试验
1）用接种环取苏云金芽孢杆菌菌株的新鲜斜面菌种，划线接种于固体富集培养基上，于25℃温度下，培养5天后得到长有明显菌落的培养基平板，获得新鲜的苏云金芽孢杆菌湿细胞，备用；
2）将加入磷酸盐缓冲液的饮用水高压灭菌处理，饮用水的pH=7.3；
3）向饮用水中加入9种亚硝胺类物质，使饮用水中每种亚硝胺类物质的质量浓度均为200ng/L；
4）取灭菌后的饮用水500mL置于500mL棕色瓶中，接种苏云金芽孢杆菌湿细胞，密封后在避光条件下，于25℃温度下培养，每隔1h震荡1min，降解饮用水中的亚硝胺类物质，接种量为每100mL的饮用水中加入0.6g苏云金芽孢杆菌湿细胞；
5）检测方法根据前期研究，采用超高液相串联质谱（UPLC/MS/MS）测定接种后第1天、3天、5天、7天、10天的饮用水中亚硝胺类物质的质量浓度，测定结果如图4所示。
测定结果显示：在接种苏云金芽孢杆菌之后，苏云金芽孢杆菌从第三天开始明显降解其中5种亚硝胺类物质，饮用水中的亚硝胺类物质的质量浓度迅速下降，接种10天后饮用水中亚硝基甲乙胺（NMEA）、亚硝基二丙胺（NDPA）、亚硝基二丁胺（NDBA）、亚硝基吡咯烷（Npyr）和亚硝基哌啶（NPip）5种亚硝胺降解率分别为51.6%、40%、37.1%、24.9%和23.6%，进而表明苏云金芽孢杆菌对饮用水中多种亚硝胺具有较高的降解率。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
Claims (9)
1.一株用于降解多种亚硝胺的苏云金芽孢杆菌（Bacillussp.），于2014年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.10067。
2.权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌在降解亚硝胺类物质中的应用。
3.根据权利要求2所述的苏云金芽孢杆菌在降解亚硝胺类物质中的应用，其特征在于：所述的亚硝胺类物质为亚硝基甲乙胺、亚硝基二丙胺、亚硝基二丁胺、亚硝基吡咯烷和亚硝基哌啶中的一种或多种。
4.根据权利要求2或3所述的苏云金芽孢杆菌在降解亚硝胺类物质中的应用，其特征在于具体通过以下方式实现：（1）苏云金芽孢杆菌湿细胞的制备，用接种环取苏云金芽孢杆菌的新鲜斜面菌种，划线接种于固体富集培养基中，25℃培养5天后得到长有明显菌落的培养基平板，获得新鲜的苏云金芽孢杆菌湿细胞；（2）取苏云金芽孢杆菌湿细胞接种于含有亚硝胺类物质的矿物盐培养基中，在避光条件下于25℃对矿物盐培养基中的亚硝胺类物质进行降解，其中每100mL矿物盐培养基中接种0.6g苏云金芽孢杆菌湿细胞。
5.根据权利要求4所述的苏云金芽孢杆菌在降解亚硝胺类物质中的应用，其特征在于：所述的含有亚硝胺类物质的矿物盐培养基中的亚硝胺类物质为亚硝基二甲胺、亚硝基甲乙胺、亚硝基二乙胺、亚硝基二丙胺、亚硝基吗啉、亚硝基吡咯烷、亚硝基哌啶、亚硝基二丁胺和亚硝胺二苯胺。
6.权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌在降解饮用水中亚硝胺类物质中的应用。
7.根据权利要求6所述的苏云金芽孢杆菌在降解饮用水中亚硝胺类物质中的应用，其特征在于：所述的亚硝胺类物质为亚硝基甲乙胺、亚硝基二丙胺、亚硝基二丁胺、亚硝基吡咯烷和亚硝基哌啶中的一种或多种。
8.根据权利要求6或7所述的苏云金芽孢杆菌在降解饮用水中亚硝胺类物质中的应用，其特征在于具体通过以下方式实现：（1）苏云金芽孢杆菌湿细胞的制备，用接种环取苏云金芽孢杆菌的新鲜斜面菌种，划线接种于固体富集培养基中，25℃培养5天后得到长有明显菌落的培养基平板，获得新鲜的苏云金芽孢杆菌湿细胞；（2）取苏云金芽孢杆菌湿细胞接种于饮用水中，在避光条件下于25℃对饮用水中的亚硝胺类物质进行降解，其中每100mL饮用水中接种0.6g苏云金芽孢杆菌湿细胞，并且饮用水在接种苏云金芽孢杆菌湿细胞之前用磷酸盐缓冲液调节饮用水的pH=7.3。
9.根据权利要求7所述的苏云金芽孢杆菌在降解亚硝胺类物质中的应用，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的混合溶液，其具体配制过程为：于800mL蒸馏水中加入8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠和0.24g磷酸二氢钾，用盐酸调节pH至7.2，加水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌20分钟后保存于室温备用。
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| CN105219670B (zh) | 2018-08-17 |
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