CN105211076A

CN105211076A - 一种抑制水稻细菌性谷枯病菌生长的化合物

Info

Publication number: CN105211076A
Application number: CN201510722564.0A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-10-31
Filing date: 2015-10-31
Publication date: 2016-01-06

Abstract

本发明发现对水稻细菌性谷枯病菌具有抑菌和杀菌活性的化合物。其水稻细菌性谷枯病菌的最小抑菌浓度MIC值为0.5μg/mL，最小杀菌浓度MBC值为1μg/mL。

Description

一种抑制水稻细菌性谷枯病菌生长的化合物

技术领域

本发明涉及化合物的新用途，阐明药物化学结构与细菌的生物活性之间的关系，更具体的说，是探索化合物对水稻细菌性谷枯病菌的抑菌和杀菌活性。

背景技术

水稻细菌性谷枯病（又称为水稻细菌性颖枯病）是一种严重的种传病害，是主要危害水稻的细菌性病害，叶部接种表明燕麦等禾本科作物、菊科、豆科、蓼科和车前科等植物也显示感病。

水稻细菌性谷枯病最早于1956年在日本九州被发现，1967年Kurita和Tabei首次将病原定名为颖壳假单胞菌，1994年改名为颖壳伯克氏菌。引起的水稻病害50年代首次被发现的是谷腐症状，故定名为细菌性谷枯病，但后来发现该病原菌主要引起严重的苗腐。20世纪70年代前该病一直是日本水稻上的次要病害，但到70年代后期由于日本实行机械化生产而进行大面积的工厂化育秧，导致水稻苗腐病大流行，成为日本水稻上最严重的病害之一。目前该病已经蔓延到印度尼西亚、泰国、越南、韩国、斯里兰卡、马来西亚、菲律宾等东南亚国家及南美洲的哥伦比亚。最近，非洲的坦桑尼亚及美国的路易安那州相继报道有该病发生。我国台湾地区在1983年简锦璋等曾报道过稻细菌性谷枯病的发生。

水稻细菌性谷枯病菌为革兰氏阴性细菌，杆状，大小（1.5~2.5）μm×（0.15~0.17）μm，1~7根极生鞭毛，好气性，有荚膜，不形成芽抱。在NA培养基上菌落生长慢，圆形、隆起、光滑、灰白色。在PDA培养基上菌落小，黄乳白色。在KB培养基上不产生荧光。明胶液化，吐温-80水解，牛乳凝固，石蕊还原，硝酸盐还原，过氧化氢酶和卵磷脂酶阳性。

水稻细菌性谷枯病菌可以通过胚芽鞘和叶片的气孔侵入寄主，另外也可以通过由第一片叶子或次生根的出现造成的伤口侵染寄主，一些昆虫咬食造成的伤口也可为病原菌的入侵提供方便。病原细菌侵染幼苗后潜伏在叶鞘等部位，随着稻株的不断生长渐向上位叶鞘扩展。水稻剑叶的叶舌被感染后，病原细菌在叶舌上繁殖，当稻穗抽出时接触叶舌，病原细菌极易附着在稻穗上而感染稻谷引起发病。孕穗期以喷雾法接种病原，得到非常高的发病率，叶舌被感染再传给稻穗，可能为其主要原因。为了解本病在田间的消长情形，日本后藤、渡边等将稻种接种病原细菌后播种，育成秧苗并移植于田间，结果发现幼苗期稻株上的病原细菌浓度很高，但插秋时稻株上几乎分离不到病原，直到分蘖最盛期以后，稻株上病原密度才逐渐提高。水稻细菌性谷枯病可经稻种传播，带菌种子是主要的初侵染源。浸种催芽时污染健康种子，在育苗期间感染发病，腐烂枯死或带菌苗再移栽本田，其病菌潜伏到孕穗开花时再侵染谷粒，形成轻重不同的谷枯病状和带菌种子;播种带菌谷粒，遇有适宜的发病条件，即抽穗期高温多日照，降雨量少易发病。土壤里病谷和病草中的病菌可存活到次年的7~8月间，秋苗移栽后进行侵染。将被去稻谷埋在田间越冬，下期作稻种秧苗时，被害谷粒的病原细菌可感染稻株发。

发明内容

本发明采用体外抗菌试验，研究化合物对水稻细菌性谷枯病菌的生物活性。

本发明的具体技术方案如下：

本发明的创新点是发现化合物对水稻细菌性谷枯病菌有良好的抑菌和杀菌活性，并测量得到其最小抑菌浓度MIC值和最小杀菌浓度MBC值，属于首次公开。

所述化合物结构特征如下式所示：

具体实施方式

下面结合具体实施实例，进一步详细地说明本发明。应理解下面实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施实例1

测量最小抑菌浓度MIC值。

（1）营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000mL蒸馏水即得。使用前121℃高压蒸汽灭菌20min待用。

（2）营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加1000mL蒸馏水即得。使用前121℃高压蒸汽灭菌20min待用。

（3）菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基l0mL，放在已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细菌培养24h，培养温度为28℃。

（4）菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取50μL，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为28℃。培养后，单个活细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。

计算公式为：菌液浓度=n×20×100cfu/mL

（5）药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存放于4℃冰箱保存待用。

（6）最小抑菌浓度（MIC）与最小杀菌浓度（MBC）的测定：采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度MIC（MinimalInhibitoryConcentration）。MIC为最小抑菌浓度，即药物与一定浓度的菌液作用后，能够抑制可见菌生长的最低浓度。

采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、32、64、128和256μg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100μL不同浓度的药液和100μL菌液，使最终菌液浓度为1~5×10⁵cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照，第12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于28℃培养24h，以肉眼观察药物最低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC，每个实验重复三次。

测得最小抑菌浓度MIC值为0.5μg/mL。

实施实例2

测量最小杀菌浓度MBC值。

（4）菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取50μL，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为28℃。培养后，单个活细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数；计算公式为：菌液浓度=n×20×100cfu/mL。

（6）最小抑菌浓度（MIC）与最小杀菌浓度（MBC）的测定：采用微量肉汤稀释法测定最小杀菌浓度MBC（MinimalBactericidalConcentration）。在MIC基础上，从每管吸取10μL溶液，点于固体培养基上，继续按MIC培养条件下培养，以完全杀灭细菌的最低浓度为最小杀菌浓度（菌落数小于等于5）。

采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、32、64、128和256μg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100μL不同浓度的药液和100μL菌液，使最终菌液浓度为1~5×10⁵cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照，第12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于28℃培养24h，以肉眼观察药物最低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC。将上述未见生长细菌的各孔中的肉汤取10μL接种于营养琼脂平板上，做好标记，于28℃培养24h，以仍无细菌生长的管内药物浓度记为该药的MBC，每个实验重复三次。

测得最小杀菌浓度MBC值为1μg/mL。

Claims

1.一种抑制水稻细菌性谷枯病菌生长的化合物，其特征在于：

（1）结构特征如下式所示：

（2）其可作为水稻细菌性谷枯病菌的抑制剂和杀菌剂；

（3）其对水稻细菌性谷枯病菌的最小抑菌浓度MIC值为0.5μg/mL；

（4）其对水稻细菌性谷枯病菌的最小杀菌浓度MBC值为1μg/mL。