CN105203651B

CN105203651B - 乳制品中糠氨酸的测定方法

Info

Publication number: CN105203651B
Application number: CN201510404963.2A
Authority: CN
Inventors: 韦晓群; 谢力; 易敏英; 庄林洲; 董洁; 陈文锐
Original assignee: Inspection and Quarantine Technology Center of Guangdong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Inspection and Quarantine Technology Center of Guangdong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2015-07-10
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2017-07-11
Anticipated expiration: 2035-07-10
Also published as: CN105203651A

Abstract

本发明提供了一种乳制品中糠氨酸的测定方法，包括如下步骤：(1)试样制备；(2)净化；(3)液相色谱‑串联质谱联用；试样制备前处理后在115℃下加热水解4h，冷却后干过滤，保留滤液供测定；0.10ml上清液于吹氮管，使用氮吹浓缩仪吹干后，用甲酸‑甲酸铵缓冲溶液定容至1.00ml，充分摇匀后用1mL注射器过滤膜转移至进样瓶，液相色谱串联质谱测定。本发明可检测的乳制品包括生乳、复原乳、巴氏杀菌乳或超高温瞬时杀菌乳，本发明的方法，缩短前处理时间，极大提高回收率，检测采用串联质谱，提高了特异性和灵敏度。

Description

乳制品中糠氨酸的测定方法

技术领域

本发明属于食品添加剂的检测领域，具体涉及一种乳制品中糠氨酸的测定方法。

背景技术

牛奶对我国居民营养健康的贡献正处于快速增长期，到2004年全国人均奶占有量达18.8kg，但近一个时期，一些企业使用复原乳生产加工液态奶，在产品标识上误导消费者，严重损害了广大消费者和农牧民的合法权益，造成了行业内的不公平竞争，扰乱了行业秩序，影响了我国奶业健康发展。复原乳因受高温处理及长时间干燥贮存，其蛋白质结构紧密，与鲜奶比降低了吸收率和营养成分。因此，为保护生产者的合法经营和消费者的正当权益，区分生鲜乳和UHT灭菌乳中是否掺入复原乳具有重要意义。

生鲜乳中掺入复原乳及其检测方法，国外从20世纪80年代就有报道。例如，利用复原乳的荧光特性(Jenness,1984)、乳清蛋白热变性程度(Burton,1984)，牛乳中可溶性核苷酸(Gil等1982)、牛乳中脱氧核糖核酸酶与核糖核酸酶活性(Cantafora等，1979)等方法进行测定。但上述方法在应用上存在很多困难，主要受乳成分之间差异和杀菌方法(温度和时间)不同而影响。

牛乳在加热过程中会发生美拉德反应，使蛋白质和糖生成特定产物——糠氨酸(ε-N-2-呋喃甲基-L-赖氨酸)。糠氨酸作为巴氏杀菌乳中复原乳成分的标示物质，可鉴定巴氏杀菌乳中是否掺入复原乳。所以我们可以通过测定糠氨酸的含量来判断灭菌乳中是否含有复原乳。通常国家规定超高温灭菌乳中的糠氨酸的含量190mg/100g(蛋白质)即判定为复原乳。生乳中糠氨酸含量应低于7mg/100g；乳粉中糠氨酸含量大于135mg/100g；不含复原乳的巴氏杀菌乳中糠氨酸含量应小于12mg/100g。使用高效液相色谱(HPLC)紫外检测糠氨酸平均偏差5％(n＝5)；回收率为98.2％。

在对样品品质检验过程中，往往要对样品进行前处理，根据处理得到的样品纯度情况，再采用高效液相色谱、色谱-质谱/质谱联用等仪器进行检测。但由于这类仪器对样品的纯度要求较高，进而对样品的前处理的要求也较高。常规情况下，一般采用高温、高压的条件，去除样品处理过程中残留的盐类等物质。复原乳中糠氨酸的测定要经过水解、干过滤和预萃取、HPLC分析等多个过程，该方法检测耗费时间长、检测限高、干扰大、回收率低。乳制品中糠氨酸测定，常规方法是将样品置于耐热试管中，加入盐酸溶液，通入高纯度氮气，再置于干燥箱中，在120℃下加热水解23h～24h，冷却后干过滤、稀释、过萃取小柱净化，再接着应用高效液相进行检测。

发明内容

为了克服上述技术缺陷，本发明提供了一种乳制品中糠氨酸的测定方法，前处理节省时间，极大提高回收率，检测采用串联质谱，提高了特异性和灵敏度。

本发明的乳制品中的糠氨酸的测定方法，包括如下步骤：(1)试样制备；(2)净化；(3)液相色谱-串联质谱联用；所述步骤(1)按如下方法操作：

吸取2.00mL试样，置于带密闭的耐热试管，加入6mL的11.9mol/L浓盐酸，混匀；向试管中缓慢通入高纯度氮气1min～2min，密闭试管，然后将其置于干燥箱中，在115℃下加热水解4h；刚加热约1h后，轻轻摇动试管；加热结束后，将试管从干燥箱中取出，冷却后干过滤，保留滤液供测定。

所述步骤(2)按如下方法操作：0.10ml上清液于吹氮管，使用氮吹浓缩仪吹干后，用甲酸-甲酸铵缓冲溶液定容至1.00ml，充分摇匀后用1mL注射器过滤膜转移至进样瓶，液相色谱串联质谱测定。

所述步骤(3)的测定条件如下：色谱条件：

a)色谱柱：AB Eclipse XDB-C18(粒径5μm，4.6×150mm)，或相当者；

b)进样量：5μL；

c)柱温：23℃；

d)流速：0.5mL/min；

e)流动相：水92％，甲醇5％，甲酸-甲酸铵缓冲溶液3％；

f)洗脱条件：平衡5min,等度洗脱10min；

质谱条件：

a)离子化方式：电喷雾电离；

b)扫描方式：正离子扫描；

c)检测方式：多反应监测(MRM)；

使用的雾化气、气帘气、辅助气和碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求。

本发明可检测的乳制品包括生乳、复原乳、巴氏杀菌乳或超高温瞬时杀菌乳。本发明的方法，前处理时间缩短，极大提高回收率，检测采用串联质谱，提高了特异性和灵敏度。

附图说明

图1是标准品的多反应监测(MRM)离子色谱图；

图2是糠氨酸的线性回归曲线及方程；

图3是液体乳的高效液相PDA谱图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

1、实施方式中用到的仪器和设备如下：

(1)液相色谱-质谱/质谱联用仪：API4000Q TRAP(AB SCIEX公司，美国)。

(2)电子天平：精确到0.01mg，0844cf0173-1(华南国家计量测试中心广东省计量科学研究院)。

(3)氮吹浓缩仪：Turbo Vap@LV(Biotage公司，瑞典)。

(4)干燥箱：0844cf0072(Binder公司，德国)。

(5)移液枪：5mL,1000μL,100μL, S(Brand公司，德国)。

(6)带螺盖耐热试管或者其他能够密封的耐热试管：20mL。

(7)注射器：1mL、2mL。

2、实施方式中用到的试剂与溶液如下：

所用试剂纯度如下所示，水为去离子水。

(1)甲醇：色谱纯。

(2)糠氨酸(呋喃素，ε-N-2-呋喃甲基-L-赖氨酸标准品)：购自上海安谱实验科技股份有限公司，纯度为99.3％，结构为

(3)甲酸：≥98.0％。

(4)盐酸：优级纯。

(5)甲酸铵：≥99.0％。

(6)高纯度氮气：99.99％。

(7)20mmol/L甲酸溶液：量取上述(3)中甲酸0.38mL，加水定容至500mL，摇匀备用。

(8)20mmol/L甲酸铵溶液：准确称取0.6306g上述(5)中描述的甲酸铵溶解于适量水中，定容至500mL，混匀后备用。

(9)610.00mg/L糠氨酸的标准储备溶液：准确称取上述(2)中描述的糠氨酸标准品6.10mg，溶于水中，完全溶解后定容至25ml，低温保存，保存期半年。

(10)糠氨酸的标准工作液：用水逐级稀释上述(9)中描述的标准储备溶液，分别配制成10.00mg/L、5.00mg/L、2.00mg/L、1.00mg/L、0.50mg/L、0.20mg/L、0.10mg/L和0.05mg/L各级标准工作溶液，保存期3个月。

(11)甲酸-甲酸铵缓冲溶液：将20mmol/L上述(7)中描述的甲酸溶液和20mmol/L(8)中描述的甲酸铵溶液按照8：1的体积比混合成缓冲溶液，pH为3左右。

实施例1：本发明检测方法的一个优选实施例

选择生乳、复原乳、巴氏杀菌乳和超高温(UHT)瞬时杀菌乳四种样品进行检测。其中生乳是从健康奶畜挤下的常乳，仅经过冷却，可能经过过滤，但未经过巴氏杀菌、低于巴氏杀菌的热处理、净乳和其他的杀菌处理；复原乳是炼乳或X和全脂乳粉与水勾兑成的原料乳；巴氏杀菌乳是经低温长时间保持(62℃～65℃，保持30min)或经高温短时间(72℃～76℃，保持15s；或80℃～85℃，保持10～15s)处理得到的；超高温(UHT)瞬时杀菌乳是经135℃以上保持数秒处理的。

(1)试样制备

用移液枪吸取2.00mL试样，置于带密闭的耐热试管，加入6mL的11.9mol/L浓盐酸，混匀。向试管中缓慢通入高纯度氮气1min～2min，密闭试管，然后将其置于干燥箱中，在115℃下加热水解4h。加热约1h后，轻轻摇动试管。加热结束后，将试管从干燥箱中取出，充分冷却后干过滤，保留滤液供测定。在抽样和制样的过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。

(2)净化

用移液枪取0.10ml上清液于吹氮管，使用氮吹浓缩仪吹干后，用甲酸-甲酸铵缓冲溶液定容至1.00ml，充分摇匀后用1mL注射器过滤膜转移至进样瓶，液相色谱串联质谱测定。

(3)仪器参数及测定条件

色谱条件：

a)色谱柱：AB Eclipse XDB-C18(粒径5μm，4.6×150mm)，或相当者；

b)进样量：5μL；

c)柱温：23℃；

d)流速：0.5mL/min；

e)流动相：水92％，甲醇5％，甲酸-甲酸铵缓冲溶液3％；

f)洗脱条件：平衡5min，等度洗脱10min。

质谱条件：

a)离子化方式：电喷雾电离；

b)扫描方式：正离子扫描；

c)检测方式：多反应监测(MRM)；

雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求。

d)监测离子对如表1所示，表1为糠氨酸监测离子对。

表1

注：*为定量离子对

(4)色谱分析

吸取5μL试样注入液-质联用仪，在上述质谱条件下测定试样的响应峰面积(应在仪器检测的线性范围内)。

按电喷雾正离子化ESI⁺选择离子模式进样，对标准进行扫描，得到标准品的多反应监测(MRM)离子色谱图，见图1，图1是标准品的多反应监测(MRM)离子色谱图。

(5)定性标准

在相同测试条件下，样品中待检测物质与同时检测的标准品应具有相同的保留时间，偏差在±2.5％之内；样品中待确证的化合物的二对特征离子的相对丰度比应与同时检测的标准品一致，相对误差在±30％。

(6)定量方法

以各标准品的特征离子中信号响应高且无干扰的离子为定量离子，进行外标法定量分析(定量离子对为255.1/130.4)。

以标准溶液的响应峰面积为纵坐标，标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。标准曲线应至少包含5个浓度点(包括零点)。依据测定的待测样品响应峰面积，在标准曲线上查出(或回归方程计算出)样品中糠氨酸的含量。

标准溶液在0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00和10.00mg/L浓度下，响应值与质量浓度呈良好的线性关系。见图2，图2是糠氨酸的线性回归曲线及方程。所得标准品的回归方程为y＝2.27×10⁵x+3.26×10³，相关系数大于0.998。

(7)空白试验：除不加试样外，按上述测定步骤进行。

结果计算按如下方法进行：

(1)确证分析

样品的LC-MS/MS数据符合下列要求时，可判定为阳性：

A.在相同试验条件下，样品中待测物质与标准品具有相同的保留时间，偏差在±2.5％以内。

B.监测离子的信噪比应≥3。

C.如果达到前两项要求，则计算3个不同的比值。并且在样品含量对应的水平下同时计算被测物标准响应离子的比值，对未知样品阳性结果的定性鉴定，所得到的离子比率应在如下规定范围内，表2为所应用的各种质谱相对离子强度最大允差。

表2

(2)计算公式及表述

结果按如下(1)式计算，计算结果需扣除空白值。

糠氨酸含量以样品质量分数计，数值以每100g蛋白质中所含毫克数表示，按如下公

式计算：

W＝b*D*100/m (1)

式中：

W——样品中每100g蛋白质中糠氨酸的含量，单位为毫克(mg/L)；

b——样品水解液中糠氨酸浓度，单位为毫克每升(mg/L)；

D——测定时稀释倍数；

m——样品水解液中蛋白质浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)。

(3)当巴氏杀菌乳每100g蛋白质中糠氨酸含量大于12mg时，则鉴定为含有复原乳。

当超高温UHT灭菌乳发生下列情况之一时，则鉴定为含有复原乳：

a)W-0.7*t>190；式中：

W——待测UHT灭菌乳样品中每100g蛋白质中糠氨酸的含量，单位为毫克(mg)；

t——待测UHT灭菌乳贮存时间，单位为天；

0.7——待测UHT灭菌乳每贮存一天每100g蛋白质中产生的糠氨酸量，单位为毫克(mg)。

b)当UHT灭菌结束时乳每100g蛋白质中糠氨酸含量为140mg～190mg时，乳果糖含量(mg/L)与糠氨酸含量(每100g蛋白质所含毫克数)比值小于2。

实施例2：测定低限的确定

实验以空白测量的3倍标准差为测定低限，10倍标准差为定量检测限，平行测定3次取平均值，得出所建立的高效液相色谱法的检出限LOD。

由实验结果，糠氨酸的测定低限为0.01mg/kg，定量检测限为0.04mg/kg。

实施例3：回收率的测定

准确量取2种已知糠氨酸含量(2.2mg/kg和2.7mg/kg)的供试样品，再分别加入一定量的标准样品(0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg)，按上述方法计算加标回收率，结果如表3所示，表3为糠氨酸测定方法的回收率。

由该实验结果得到，乳粉中糠氨酸回收率范围在93.4％～108.9％之间。

表3

实施例4：精密度的确定

对同一乳中糠氨酸含量样品，反复测定6次，根据样品的峰面积，计算该测定方法的精密度。添加浓度为0.50mg/kg、1.00mg/kg、2.00mg/kg，

实验结果见表4，表4为糠氨酸测定方法的精密度实验结果，由实验结果可见，本方法检测的变异系数小于10％。

表4

实施例5：对比实验

用本发明方法和常规方法对生乳、复原乳、巴氏杀菌乳和超高温(UHT)瞬时杀菌乳四种样品进行检测。本发明方法按实施例1中所述的步骤和条件来操作。常规方法如下：

取定量样品置于耐热试管中，加入盐酸溶液，通入高纯度氮气，再置于干燥箱中，在120℃下加热水解23h～24h，冷却后干过滤、稀释、过萃取小柱净化，再接着应用高效液相进行检测。

2004年，ISO发布《ISO 18329：2004》关于牛奶和奶制品中糠氨酸的含量的检测是运用反向离子对色谱法和在280nm处检测的UV法联合检测的，而2005年中国农业部发布中华人民共和国农业行业标准《NY/T 939-2005巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定》。这两个标准的主要区别有两个：一是洗脱液不同。ISO18329标准采用的是0.4％的冰醋酸和3g/L氯化钾，而NY/T 939采用的是0.1％的三氟乙酸和甲醇，前者对柱子的损害较大，后者干扰较大，因为吸收波长在280nm附近的物质很多，如图3所示，图3为液体乳的高效液相PDA谱图，保留时间为6.05，在该保留时间的特征吸收波长为205nm、220nm以及280nm的三峰，而且在5.5min、6.8min处有相类似的三峰。

回收率、特异性和灵敏度的检测和计算如上述实施例所述。

实验结果见表5，表5为本发明方法和常规方法对生乳、复原乳、巴氏杀菌乳和超高温(UHT)瞬时杀菌乳四种样品进行检测的实验结果对比数据表。

表5

由表5结果可见，本发明的方法与常规方法相比较，本发明方法前处理时间缩短，极大提高回收率，检测采用串联质谱，提高了特异性和灵敏度。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.乳制品中糠氨酸的测定方法，包括如下步骤：(1)试样制备；(2)净化；(3)液相色谱-串联质谱联用；其特征在于，所述步骤(1)按如下方法操作：

吸取2.00mL试样，置于带密闭的耐热试管，加入6mL的11.9mol/L浓盐酸，混匀；向试管中缓慢通入高纯度氮气1min～2min，密闭试管，然后将其置于干燥箱中，在115℃下加热水解4h；加热约1h后，轻轻摇动试管；加热结束后，将试管从干燥箱中取出，冷却后干过滤，保留滤液供测定；

所述步骤(2)按如下方法操作：

将0.10ml上清液于吹氮管中，使用氮吹浓缩仪吹干后，用甲酸-甲酸铵缓冲溶液定容至1.00ml，充分摇匀后用1mL注射器过滤膜转移至进样瓶，液相色谱串联质谱测定；

所述步骤(3)的测定条件如下：

色谱条件：

a)色谱柱：AB Eclipse XDB-C18，粒径5μm，4.6×150mm；

b)进样量：5μL；

c)柱温：23℃；

d)流速：0.5mL/min；

e)流动相：水92％，甲醇5％，甲酸-甲酸铵缓冲溶液3％；

f)洗脱条件：平衡5min,等度洗脱10min；

质谱条件：

a)离子化方式：电喷雾电离；

b)扫描方式：正离子扫描；

c)检测方式：多反应监测(MRM)；

使用的雾化气、气帘气、辅助气和碰撞气均为高纯氮气；

d)糠氨酸监测离子对如下表所示：

注：*为定量离子对；

e)色谱分析：吸取5μL试样注入液-质联用仪，在所述质谱条件下测定试样的响应峰面积。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述乳制品包括生乳、复原乳、巴氏杀菌乳或超高温瞬时杀菌乳。