CN105188716B - 钙通量激动剂及其方法 - Google Patents

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Abstract

使用钙通量激动剂增强TLR‑或NOD‑介导的刺激，并从而增加宿主的免疫应答和减少愈合时间。优选的钙通量激动剂包括Ca2+离子载体和SERCA抑制剂，且在有TLR或NOD受体的配体存在下以协同量使用。

Description

钙通量激动剂及其方法
本申请要求于2012年11月13日提交的我们的共同未决的临时申请系列号61/725881的优先权，该申请通过引用并入本文。
技术领域
本发明技术领域是药物化合物的组合物和方法，特别是局部施用的钙通量激动剂的组合物和方法。
背景技术
多种钙通量激动剂是本领域已知的且具有非常不同的起源。例如，某些化合物作为离子载体起作用且通常通过将钙离子输入进细胞中而升高细胞内钙水平，而其它化合物通过增加从细胞内储存体（如内质网和线粒体）的钙分泌而升高细胞内钙水平。
在多种其它已知的离子载体中，卡西霉素(A23187)和离子霉素是在数十年前最初被描述为抗生素的天然产物(分别得自革兰氏阳性细菌Streptomyces chartreusensis和密团链霉菌（Streptomyces conglobatus）)。更具体地，如在US 3960667和US 3873693中所报道的，A23187和离子霉素表现出针对多种潜在微生物病原体的直接抗生素活性。不同于抑制微生物增殖（诸如细菌细胞壁合成或细菌核糖体功能）特有的生化途径的经典抗生素(例如，青霉素或四环素)，A23187和离子霉素属于以相对较高的特异性结合作为底物的二价阳离子的单独一类抗生素化合物。例如，A23187结合亲和力的特征在于Mn2+>Ca2+=Mg2+>Sr2+>Ba2+，而离子霉素结合亲和力的特征在于Ca2+>Mg2+> Ba2+ >Sr2+。
另一方面，毒胡萝卜内酯（thapsigargin）是一种典型的ER促分泌剂，且可以被表征为倍半萜内酯。毒胡萝卜内酯分离自植物(毒胡萝卜(Thapsia garganica))且作为各种肌质网/内质网Ca2+ ATP酶(SERCA)的非竞争性抑制剂起作用。毒胡萝卜内酯:SERCA结合表现出在低皮摩尔范围内的亲和常数，且对分裂中的细胞和非分裂的细胞具有毒性。在动物中，与毒胡萝卜内酯的有限皮肤接触可以导致炎症，且慢性重复局部暴露可以导致非恶性的乳头状瘤形成（当与强DNA损伤剂结合使用时）。除了毒胡萝卜内酯(和结构类似物如毒胡萝卜辛(thapsigargicin)等)以外，其它SERCA抑制剂包括环匹阿尼酸(CPA)和2,5-二叔丁基氢醌(DBHQ)。
由于以下几个原因，难治的皮肤感染代表一个新出现的公共卫生担忧：所述原因包括不断增长的遭受慢性皮肤溃疡的糖尿病患者的数目，抗生素抗性的微生物菌群(例如，甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）或MRSA)的存在，和增加的坏死性筋膜炎(或“食肉细菌病”)的暴发频率。除了细菌以外，许多真菌和病毒也可以造成皮肤的重大感染。尽管抗生素仍然是这些障碍中的许多障碍的最佳治疗选择，合乎需要的是，刺激患者自身的细胞和它们的有关功能以进一步改善患者从进行中的感染恢复，且可能甚至刺激针对讨厌生物的长期免疫以限制在以后遇到时的发病机制。
在高等生物中，包括皮肤在内的上皮组织充当针对基于病原体的损害、化学损害和物理损害的关键屏障。皮肤的表皮层包含角质形成细胞、免疫细胞诸如朗格汉斯细胞和CD8+ T细胞、梅克尔细胞和黑素细胞。除了朗格汉斯细胞（其为负责疾病监测的树突细胞(DC)的一种亚型）以外，角质形成细胞(其占总表皮群体的约95%)也通过它们的不同模式识别受体（诸如toll-样受体(TLR)蛋白的成员、C-型凝集素受体(CLR)、炎性体等）的表达而充当免疫哨兵。
它们的同源配体对角质形成细胞中的这些受体的活化会导致趋化因子（诸如白介素-8 (IL-8)、CCL2和CCL20，以募集其它免疫细胞）以及调节免疫的细胞因子（诸如TGF-β和IL-10）的释放。在表皮下面，真皮包含更大种类的细胞类型，包括CD4+ (Th1、Th2、Th17等)和非经典的(例如γδ, NK-、等) T淋巴细胞的不同子集、多种抗原呈递细胞(诸如巨噬细胞和真皮DC和浆细胞样DC)、肥大细胞和成纤维细胞，其中的许多表达上述的多种模式识别蛋白。这样，表皮细胞和真皮细胞协作以防止微生物侵入或可能导致重大疾病的其它物理损害。
TLR蛋白(在人类中的TLR 1-10)是I型膜蛋白，其充当与疾病和组织体内稳态有关的特定类别的配体的模式识别受体(PRR)，且因此同样在多种免疫和非免疫细胞类型上表达。与所有受体一样，TLR信号转导由配体结合触发，且可以将配体分组成病原体相关的分子模式(或PAMP)和疾病相关的分子模式(DAMP)。
识别TLR的PAMP包括细菌脂蛋白/脂肽、脂糖、鞭毛蛋白和未甲基化的CpG DNA、真菌细胞壁组分(例如酵母多糖)和病毒核酸(dsRNA、ssRNA和CpG DNA)，而DAMP直接衍生自宿主，可以在没有感染存在下发生，且主要被TLR家族蛋白的仅2个成员(TLR2和/或TLR4)识别。
一旦被它们的适当配体活化，TLR会开始信号传递级联，该级联用于限制感染/疾病的程度和触发组织修复。就后者而言，TLR配体识别会导致抗微生物活性的上调，并造成多种免疫学参与者的活化/成熟以完成入侵病原体的破坏。例如，TLR活化可以导致活性氧(ROS)、抗微生物肽的释放、以及先天细胞诸如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、角质形成细胞等中的吞噬功能的上调。除了它们在对抗疾病中的作用以外，TLR也涉入组织修复和再生，如在组织损伤(包括由化学试剂、辐射、外科手术和传染性损伤诱发的那些)的不同模型中所证实的。
另一类模式识别受体由NOD-样受体蛋白家族形成，且包括NOD1和NOD2作为最突出的成员。NOD1和NOD2是细胞内模式识别受体，其在结构上类似于植物的抗性蛋白，并通过识别分别含有D-谷氨酰基-内消旋-二氨基庚二酸和胞壁酰基二肽的细菌分子而介导先天性和获得性免疫。在被它们各自的配体刺激以后，两种NOD蛋白通过各自的识别结构域与RIPK2相互作用，这最终导致转录因子NF-κB的活化。
以前的表征完整皮肤对信号转导的小分子激动剂(诸如蛋白激酶C激动剂TPA/PMA或持续的钙通量激动剂如A23187、离子霉素或毒胡萝卜内酯)的局部施用的应答的努力证实了一系列下游结果。例如，佛波醇酯TPA的局部施用会造成血管舒张、微血管渗透性改变、炎症细胞募集和促炎症因子从多种细胞类型的释放。与PKC激动剂不同，使用持续的钙通量激动剂(SCFA)的局部治疗会导致皮肤炎症和增殖过度。另一方面，在有相对较高量的钙离子载体(离子霉素)存在下细胞向TLR配体(LPS)的暴露不会导致任何可测量的免疫刺激作用(Proc Natl Acad Sci U S A. 2012年7月10日;109(28): 11282-7)。如在US 2012/0272700A1和US 2013/0183343A1中讨论的，当以相对较高的剂量个别地施用时，已知钙离子载体和TLR配体会刺激分化或活化树突细胞。
因此，尽管钙通量激动剂和/或TLR/NOD的配体的众多组合物和应用是本领域已知的，仍然需要提供会提供改善的免疫调节活性的组合物和方法。
发明内容
本发明主题涉及钙通量激动剂的多种组合物和方法，其中使用这些化合物来调节对TLR-或NOD-介导的事件的免疫应答，特别是协同地增加对TLR和/或NOD配体结合的应答。值得注意的是，在钙通量激动剂以次优浓度存在的情况下，观察到就免疫刺激而言的协同效应。
从不同的角度看，发明人预见到钙通量激动剂用于放大细胞内Ca2+ 依赖性的TLR/NOD信号传递的用途。因此，且在其它合适的用途中，特别预见到的用途包括：预调节组织以允许增强的对TLR/NOD依赖性的刺激(例如，感染或损伤)的应答，和/或用钙通量激动剂治疗上皮的局部或其它感染以放大细胞内Ca2+ 依赖性的TLR/NOD信号传递。结果，发明人也预见到局部药用和化妆用组合物，其用于预防和/或治疗皮肤感染和其它病症(例如，糖尿病性溃疡)以刺激伤口愈合和/或减少瘢痕形成。
在本发明主题的一个方面，发明人预见到钙通量激动剂用于增强免疫感受态细胞对模式识别受体的配体的免疫应答的用途。例如，在钙通量激动剂是钙离子载体的情况下，优选的激动剂包括离子霉素、卡西霉素、白僵菌素、钙离子载体II、钙离子载体IV、钙离子载体V和钙离子载体VI，且在激动剂是SERCA抑制剂的情况下，优选的SERCA抑制剂包括DBHQ(2,5-二叔丁基氢醌)、毒胡萝卜内酯、钌红、姜酚、蕈青霉素和环匹阿尼酸。在其它可观察的现象中，通常通过增加的IL-8分泌和/或增加的NF-κB信号传递的活化来证实增强的免疫应答，且优选的是，在有配体存在下，特别是在以次优浓度(就在没有配体存在下钙通量激动剂的最大作用而言)使用钙通量激动剂的情况下，钙通量激动剂协同地增强免疫应答。
就合适的细胞而言，通常预见到，所述细胞是免疫感受态细胞，其优选地存在于皮肤的表皮层或真皮层中。此外，免疫感受态细胞通常表达TLR受体和/或NOD受体作为模式识别受体。因而，配体通常包括PAMP和DAMP配体。
结果，发明人也预见到钙通量激动剂在制备局部施用以增强皮肤的免疫应答的药物中的用途。在这样的用途中，免疫应答通常与免疫感受态细胞中(PAMP或DAMP)配体对模式识别受体的结合有关，且所述模式识别受体最通常是TLR受体或NOD受体。如上面所指出的，优选的钙通量激动剂包括钙离子载体(例如，离子霉素、卡西霉素、钙离子载体II、钙离子载体IV、钙离子载体V或钙离子载体VI)和SERCA抑制剂(例如，2,5-二叔丁基氢醌、毒胡萝卜内酯、钌红、姜酚、蕈青霉素或环匹阿尼酸等)，和/或所述钙通量激动剂以这样的浓度存在于药物中：所述浓度使得所述激动剂存在于有次优浓度的配体存在的细胞中。
结果，和从不同的角度看，发明人也预见到钙通量激动剂在制备局部施用以增强皮肤的伤口愈合的药物中的用途。在这样的用途中，所述钙通量激动剂通常以有效地活化创伤中的细胞的NF-κB信号传递的量存在。在所述创伤被细菌病原体(通常表达或产生TLR受体和/或NOD受体的配体)感染的情况下，这样的用途是特别有利的。
在本发明主题的另一个方面，发明人也预见到药物组合物，其包含在药学上可接受的载体中的钙通量激动剂(例如，钙离子载体或SERCA抑制剂)，其中所述药物组合物被配制成用于局部施用至受损伤的或被感染的皮肤，且其中所述钙通量激动剂以这样的量存在：在将所述制剂施用于受损伤的或被感染的皮肤以后，其增强受损伤的或被感染的皮肤中的免疫感受态细胞对模式识别受体的配体(例如，TLR受体或NOD受体)的免疫应答。尽管这样的药物组合物可以配制例如为液体、喷雾剂或凝胶，也预见到所述药物组合物被配制成用于经由施加于受损伤的或被感染的皮肤的固体载体(例如，浸有药物组合物的创伤敷料或带状辅助物)而局部施用至所述受损伤的或被感染的皮肤。例如，皮肤可能被包含TLR受体或NOD受体的配体的(例如，细菌)病原体感染。
在特别优选的药物组合物中，与在没有配体存在下的免疫应答相比，所述量的钙通量激动剂(例如，离子霉素、卡西霉素或毒胡萝卜内酯)在有配体存在下协同地增强免疫应答。
因此，发明人也预见到增强表达模式识别受体(例如，TLR受体或NOD受体)的细胞对所述模式识别受体的配体(例如，PAMP)的免疫应答的方法，其中所述方法包括将有配体存在的细胞暴露于增强免疫应答的量的钙通量激动剂(例如，SERCA抑制剂或钙离子载体)的步骤。
最典型地，将免疫应答显示为增加的IL-8分泌和/或增加的NF-κB信号传递的活化，且特别优选的是，配体和钙通量激动剂以协同量存在。尽管不限于本发明主题，进一步优选的是，所述细胞位于皮肤(例如，受损伤的或被感染的皮肤)的真皮层或表皮层中。
从不同的角度看，发明人因此也预见到治疗受损伤的或被感染的皮肤的方法，其中在一个步骤中，使受损伤的或被感染的皮肤与一定量的钙通量激动剂(例如，钙离子载体或SERCA抑制剂)接触，所述量会增强免疫应答(例如，增加的IL-8分泌或增加的NF-κB信号传递的活化)和增加伤口愈合。
因而，发明人也预见到调节组织(例如，上皮组织)或细胞中对TLR-或NOD-介导的刺激的免疫应答的方法，其中在一个步骤中，使所述组织或细胞与一定浓度的钙通量激动剂接触(例如，局部施用)，与没有钙通量激动剂时的细胞内钙浓度相比，所述浓度会有效地增加细胞内钙浓度。最典型地，钙通量激动剂(例如，钙离子载体或SERCA抑制剂)的浓度可有效地调节对TLR-介导的刺激的免疫应答。在本发明主题的某些方面，TLR-或NOD-介导的刺激是细菌感染、病毒感染或真菌感染，而在其它方面，TLR-或NOD-介导的刺激是组织损害。
从优选实施方案的下述详细描述以及伴随的附图会更明白本发明主题的不同目的、特征、方面和优点，在附图中，相同的数字代表相同的部件。
附图说明
图1A-1C是描绘不同钙通量激动剂(1A: A23187; 1B: 离子霉素; 1C: 毒胡萝卜内酯)关于NF-κB信号传递和IL-8产生的强度的剂量响应曲线的图。
图2是描绘不同钙通量激动剂与示例性TLR配体(Pam2CYS)的协同效应的示例图。
图3A-3E显示的不同图解释了示例性钙通量激动剂(图3A: A23187；图3B: 离子霉素；图3C: 环匹阿尼酸；图3D: DBHQ；图3E: 毒胡萝卜内酯)与各种TLR和NOD受体的示例性TLR和NOD配体就IL-8产生的强度而言的协同效应。
图4显示的图解释了不同的Ca2+ 调节化合物对就NF-κB活化而言的协同作用的影响。
图5A-5E显示的图描绘了活细菌生长对κB-LUC THP-1报告细胞的影响(图5A)、毒胡萝卜内酯对NF-κB应答的增加(图5B)和钙通量激动剂信号放大对Ca2+的细胞外需求(图5C-5E)。
图6显示的图解释了为了吞噬的金黄色葡萄球菌的最佳杀死，人原代单核细胞和粒细胞对细胞外Ca2+的需求。
图7显示了使用选定的钙通量激动剂的伤口愈合的照片。
图8显示的图指示用对照和选定的钙通量激动剂进行创伤治疗以后的创伤大小和细菌负荷。
图9A-9C显示了金黄色葡萄球菌分别针对A23187、离子霉素和CPA的抗生素敏感性的图。
图10是描绘毒胡萝卜内酯对金黄色葡萄球菌的直接抗生素作用的缺乏的图。
图11的图显示了毒胡萝卜内酯处理过的细胞对细胞内金黄色葡萄球菌的杀死的改善。
详细描述
发明人已经发现，增加细胞内游离Ca2+ 浓度(特别是钙离子载体和SERCA抑制剂)的钙通量激动剂可以有效地用于调节和/或增强宿主对TLR-或NOD-介导的事件的免疫应答。在一个特别值得注意的方面，在钙通量激动剂以基本上次优浓度存在的情况下，钙通量激动剂协同地增加宿主对TLR和/或NOD配体结合的应答。
实际上，发明人已经发现，如下面进一步详述的，先天性免疫细胞如下帮助控制感染：以Ca2+依赖性的方式识别金黄色葡萄球菌细菌或它们的脱落产物(和其它病原体和病原体片段)以变得活化，其然后可以通过受影响的细胞向次优剂量的Ca2+通量激动剂的暴露而得到有效增强。由于许多普通病原体(例如，金黄色葡萄球菌)产物主要被TLR和NOD受体识别，发明人研究并也证实，病原体产物实际上在活化，并且这样的活化可以使用众多Ca2+通量激动剂(其可以用钙螯合剂废除或显著减少)进一步显著增强。此外，发明人也证实，对于吞噬的细菌的有效杀死而言，Ca2+是人单核细胞和粒细胞(特别是嗜中性粒细胞)中的关键因子。这样的发现也直接转移进活感染以后的皮肤感染和伤口愈合的哺乳动物(鼠)模型中。
在本发明主题的一个方面，发明人因此预见到用于(通常局部)治疗和/或预防的多种组合物和方法，其可有效地刺激宿主细胞对病原体的免疫应答能力且可有效地减少局部创伤的瘢痕形成和闭合时间，特别是在所述创伤被一种或多种表达或以其它方式包含TLR和/或NOD的配体的病原体感染的情况下。例如，发明人预见到SERCA抑制剂(例如，毒胡萝卜内酯)和/或离子载体(例如，离子霉素和/或A23187 (卡西霉素)用于预防或治疗浅表皮肤感染(例如，细菌感染)的局部施用。
在该背景下，发明人发现，SERCA抑制剂和/或离子载体的局部施用会在活动物感染模型中极大地减少浅表皮肤感染的细菌负荷(例如，金黄色葡萄球菌)并伴随伤口愈合动力学的改善。值得注意的是，在钙通量激动剂充当针对病原体的杀生物剂的情况下，抗细菌作用不是(在SERCA抑制剂毒胡萝卜内酯的情况下)或不完全是(在离子载体的情况下)归因于直接抗生素作用，而是归因于作为免疫学佐剂的钙通量激动剂的作用。尽管不希望受任何理论或假设约束，发明人预见到，抗细菌作用可能是由于当在有TLR或NOD配体存在下提供钙通量激动剂时细胞因子释放和核因子-κB (NF-κB)信号传递途径的活化的协同活化。
甚至更惊人的是，就IL-8产生和NF-κB信号传递的活化而言，观察到TLR和/或NOD活化和钙通量激动剂(离子载体/SERCA抑制剂)之间的非常强的协同作用。例如，将人前单核细胞THP-1细胞在有或没有次优剂量的TLR2配体Pam2CSK4存在下温育，并与也接受次优剂量的离子载体(这里：A23187和离子霉素)的类似地处理过的细胞对比。有趣的是，且如下面更详细地进一步证实的，发明人发现，两种激动剂会显著地增加产生的IL-8的量超过当将单个应答累加时产生的水平，从而指示真实的协同作用。在另一个实施例中，将κB-LUCTHP-1细胞(携带NF-κB-驱动的萤光素酶表达盒的、THP-1-衍生的转染子系)在有或没有次优剂量的TLR2配体Pam2CSK4存在下培养，并与也接受次优剂量的不同SERCA抑制剂的类似地处理过的细胞对比。值得注意的是，且也如在下面更详细地证实的，发明人发现，所有试验的激动剂(这里：毒胡萝卜内酯、环匹阿尼酸)显著地增加产生的萤光素酶的量超过当将单个应答累加时产生的水平，所以再次指示协同作用。
在该背景下，应当指出，NF-κB通过它在介导细胞活化、炎症性细胞因子分泌、增殖和存活中的涉入而影响适应性免疫，而IL-8是免疫细胞如嗜中性粒细胞（对于抗细菌和抗真菌应答而言关键的一种先天性免疫细胞类型）的强力化学引诱剂。令人感兴趣的是，在有Ca2+通量诱导剂离子霉素存在下TLR4的配体活化会导致花生四烯酸-衍生的类花生酸脂质在小鼠巨噬细胞系中的协同产生，从而指示为了预防效果和治愈效果将Ca2+通量诱导剂与TLR配体组合的可能性。
在本发明主题的一个方面，发明人因此预见到，离子载体(例如，A23187和/或离子霉素)将与感染/疾病有关的TLR和/或NOD配体一起在体内产生协同效应以改变原位免疫细胞应答和修复过程。这样的效应可容易地确定，如发明人通过使用局部施用的制剂在下面更详细地证实的，所述制剂含有不同的离子载体以改变浅表皮肤感染（例如，由作为模型系统的金黄色葡萄球菌诱导）的进程，其中使用细菌负荷和创伤大小作为预防和/或治疗成功的指标。
类似地，在本发明主题的另一个方面，发明人也预见到，毒胡萝卜内酯(和多种其它的SERCA抑制剂)会与感染/疾病有关的TLR和/或NOD配体一起在体内产生协同效应以改变原位免疫细胞和体内修复过程。如上面所指出的，这样的效应可容易地确定，如发明人通过使用局部施用的制剂在下面更详细地证实的，所述制剂含有不同的SERCA抑制剂(和特别是毒胡萝卜内酯)以改变浅表皮肤感染（例如，由作为模型系统的金黄色葡萄球菌诱导）的进程，其中使用细菌负荷和创伤大小作为预防和/或治疗成功的指标。
因此，应当理解，发明人特别预见到钙通量激动剂用于增强一种或多种免疫感受态细胞对模式识别受体的配体的免疫应答的用途。最典型地，合适的免疫感受态细胞是作为细胞免疫系统(例如，B-细胞、T-细胞、抗原呈递细胞或先天性哨兵细胞，且特别是树突细胞、巨噬细胞、肥大细胞、单核细胞等)的组成部分的细胞，且通常优选的是，这样的免疫感受态细胞是在皮肤的真皮层或表皮层中。结果，发明人也预见到钙通量激动剂用于制备局部施用的药物的用途，所述药物用于增强皮肤中的免疫应答和/或伤口愈合(例如，减小闭合时间)。在这样的用途中，通常预见到，免疫应答与免疫感受态细胞中配体对模式识别受体的结合有关。在其它模式识别受体中，特别是合适的模式识别受体包括TLR和NOD家族的那些，且尤其是TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13、以及NOD1、NOD2、NOD3、NOD4、NOD5和CIITA。因此，应当理解，所述配体可以大范围地变化，且预见到的配体包括所有已知会结合TLR和/或NOD受体的配体，且最优选病原体-相关的分子模式配体(PAMP)和损伤/疾病-相关的分子模式配体(DAMP)。结果，合适的PAMP配体将包括多种脂肽、糖脂、脂磷壁酸、热激蛋白、β-葡聚糖、纤维蛋白原、硫酸肝素片段、透明质酸片段、RNA (和特别是ssRNA)、DNA (和特别是CpG序列)、profiling等。同样地，合适的DAMP将包括多种细胞核蛋白和/或细胞溶质蛋白，且特别是热激蛋白、HMGB1、DNA、RNA和从细胞外基质衍生出的蛋白的片段。
在本发明主题的另一个方面，发明人也预见到增强细胞(其表达一种或多种上面指出的模式识别受体)对模式识别受体的配体的免疫应答的方法。如上面所指出的，配体的性质主要依赖于受体的类型，且如上面讨论的所有受体和配体适合用于预见到的方法。在特别优选的方法中，将所述细胞在有配体存在下暴露于增强免疫应答的量的钙通量激动剂。当然，应当指出，可以递送配体(例如，与钙通量激动剂一起)作为治疗方案的组成部分。但是，更一般而言，所述配体由存在于细胞中或附近的病原体提供，或由作为DAMP的宿主提供。尽管不限于本发明主题，增强的免疫应答通常特征在于增加的IL-8产生和增加的NF-κB信号传递中的至少一种(例如，与在没有钙通量激动剂存在下相同基因的表达相比，在有钙通量激动剂存在下在NF-κB的控制下的基因的表达增加)。如从下面的实验细节容易明白的，增强的免疫应答通常是协同增加。
因此，发明人也预见到如在下面更详细地进一步证实的通过使受损伤的或被感染的皮肤与增强免疫应答和增加伤口愈合的量的钙通量激动剂接触来(预防性地)治疗受损伤的或被感染的皮肤的方法。从不同的角度看，因而应当理解，可以采用一种或多种钙通量激动剂调节组织或细胞中对TLR-或NOD-介导的刺激的免疫应答。
预见到的钙通量激动剂
预见到适合用于本文中的化合物通常被视作可用于预防和/或治疗多种感染性疾病和创伤，特别是皮肤或其它上皮的传染性疾病，尤其是在宿主对疾病和/或创伤的应答与TLR或NOD应答途径有关的情况下。因此，通常优选的是，根据本发明主题的化合物将是钙通量介质(和特别是激动剂)，其导致至少暂时的、且更典型地持续的细胞内钙增加。
因此，特别优选的化合物包括本领域众所周知的离子载体和SERCA抑制剂。最优选地，合适的离子载体是钙离子载体，特别是离子霉素、卡西霉素、钙离子载体II、钙离子载体IV、钙离子载体V或钙离子载体VI，而特别优选的SERCA抑制剂包括2,5-二叔丁基氢醌(DBHQ)、毒胡萝卜内酯、钌红、姜酚、蕈青霉素或环匹阿尼酸。还应当指出，尽管上面是优选化合物的列表，该列表不是穷尽性的，且单一化合物可以组合以形成两种或更多种钙通量激动剂的混合物(例如，以提供细胞外和细胞内激动剂)，和/或可以加入额外的化合物。
当然，应当理解，(在适当的情况下)预见到的化合物可以具有一个或多个不对称中心或基团，其可以产生异构的、互变异构的或其它立体异形体(例如，R-和/或S-构型、E/Z构型、互变异构的异构体、对映异构体、非对映异构体等)，且在本文中明确地预见到每种这样的形式及其混合物。另外，应当理解，可以化学修饰预见到的钙通量激动剂以达到期望的物理化学参数(例如，在水性溶剂中的溶解性、膜渗透性、对Ca2+的选择性等)。因此，合适的钙通量激动剂可以是全合成的、半合成的，或分离自产生这样的离子载体的宿主菌株。
此外，也可以将预见到的化合物转化成前药以增加向受影响的组织或器官的递送和/或靶标特异性。本文中使用的术语“前药”表示预见到的化合物的修饰，其中所述经修饰的化合物表现出更少的药理学活性(与未修饰的化合物相比)，且其中所述经修饰的化合物在靶细胞或靶器官内转化回未修饰的形式。例如，在活性药物由于过高毒性而不能安全地全身施用的情况下，或在预见到的化合物被消化道较差吸收的情况下，或在预见到的化合物到达它的靶标之前就被身体分解的情况下，预见到的化合物向前药的转化可能是有用的。存在众多本领域已知的前药制备方法，且它们都在本文中预见到。例如，合适的前药方案描述于Kenneth B. Sloan的Prodrugs (Drugs and the Pharmaceutical Sciences: aSeries of Textbooks and Monographs) (ISBN: 0824786297)中或Bernard Testa的Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism: Chemistry, Biochemistry, andEnzymology (ISBN: 390639025X)中，它们在适当的范围内通过引用并入本文。
类似地，应当指出，预见到的化合物也可以在如本文中所述的形式具有更少的活性，且作为在体内形成的一种或多种代谢物而具有更多的活性。例如，预见到的化合物可以被肝I期和/或II期酶系统、或被胃液酸度、肠微生物环境或其它生化过程转化。因而，合适的化合物可以被氧化、羟基化、连接至碳水化合物等。
预见到的组合物
通常预见到，将预见到的钙通量激动剂提供在适合用于递送给细胞或组织的组合物中。因此，合适的组合物包括液体组合物、凝胶、固体组合物，它们都可以与载体结合或偶联，或直接施加于细胞或组织。最典型地，这样的组合物将包括水性溶剂或否则药学上可接受的载体以及一种或多种钙通量激动剂。在本发明主题的特别优选的方面，所述药物组合物被配制成用于局部施用至受损伤的或被感染的组织，更优选上皮组织，且最优选皮肤。此外，通常优选的是，所述钙通量激动剂以这样的量存在：在将所述制剂施用于细胞或组织以后，其增强受损伤的或被感染的细胞或组织中的免疫感受态细胞对模式识别受体(通常TLR和/或NOD受体)的一种或多种配体的免疫应答。更进一步优选的是，所述钙通量激动剂以这样的量存在：与在没有配体存在下的免疫应答相比，其在有配体存在下协同地增强免疫应答。
因此，应当理解，根据本发明主题的组合物可以使用多种途径施用，所述途径包括局部地、鼻地、通过吸入、口服地、胃肠外地等。其中本文中使用的术语“胃肠外的”包括皮下的、静脉内的、肌肉内的、关节内的、滑膜内的、鞘内的、肝内的、病灶内的和颅内的施用(通常注射或输注)。但是，最优选地，以液体、凝胶或固体形式局部地施用组合物。
例如，可以将本发明的药物组合物局部地施用于通过局部施用可容易地接近的区域或器官，包括眼、皮肤、下肠道或在外科手术干预过程中暴露的区域。存在众多本领域已知的局部制剂，且所有这样的制剂被认为适合用于本文中的用途。
例如，可以将预见到的组合物配制在合适的软膏剂中，所述软膏剂含有悬浮或溶解于一种或多种载体中的活性组分。用于局部施用本发明的化合物的载体包括矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。可替换地，可以将所述药物组合物配制在合适的洗剂或乳膏剂中，其含有悬浮或溶解于一种或多种药学上可接受的载体中的活性组分。合适的载体包括矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨酯60、十六烷基酯蜡、鲸腊硬脂醇、2-辛基十二醇、苯甲醇和水。由于至少一些活性化合物是高度疏水的，预见到，所述制剂将考虑相对较差的溶解性，且因而可以制备为乳剂、为纳米小泡颗粒，或在阻塞下在疏水性基质中施用。
可替换地，也可以将预见到的制剂注射进皮肤或其它施用部位中。最优选地，预见到的化合物的无菌的可注射形式将包括乳剂、水溶液或油性混悬液。这些混悬液可以按照本领域已知的技术，使用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂制备。也可以在无毒的胃肠外地可接受的稀释剂或溶剂中将无菌的可注射制剂制备为无菌的可注射的溶液或混悬液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。在其它可接受的媒介物和溶剂中，特别预见到的液体包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的、不挥发性油可以用作共溶剂或悬浮介质(例如，天然的或合成的甘油单酯或甘油二酯)。也可以使用脂肪酸，且合适的脂肪酸包括油酸和它的甘油酯衍生物、橄榄油、蓖麻油，特别是以它们的聚氧乙基化的形式。这样的油溶液或混悬液可以进一步含有长链醇稀释剂或分散剂。
在另一个实施例中，可以在任何口服地可接受的剂型中口服施用预见到的化合物，所述剂型包括胶囊剂、片剂、水性悬浮液或溶液。在用于口服使用的片剂的情况下，所有药学上可接受的载体(例如，乳糖、玉米淀粉等)被认为是合适的。类似地，可以加入多种润滑剂(例如，硬脂酸镁)。就胶囊形式的口服施用而言，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。
关于组合物中的预见到的化合物的量，应当认识到，特定量通常依赖于具体制剂、活性成分和期望的目的。因此，应当认识到，预见到的化合物的量将显著地变化。但是，通常优选的是，所述化合物以在体外和/或在体内有效地递送预防和/或治疗效果的最小量存在。从另一个角度看，钙通量激动剂通常以有效地在体外或在创伤或否则患病的(例如，感染的)组织中活化NF-κB信号传递和/或增加细胞的IL-8产生的量存在。
此外，通常优选的是，将钙通量激动剂提供给细胞或组织，使得激动剂将以次优浓度（就在没有配体存在下钙通量激动剂的最大作用而言）存在于细胞中(在有TLR或NOD配体存在下)。在该背景下，应当指出，钙通量激动剂的次优浓度是刚好低于用钙通量激动剂可得到的最大应答(就NF-κB和/或IL-8产生而言)的浓度。因而，钙通量激动剂的次优浓度将是这样的浓度：其提供等于或小于80%、等于或小于70%、等于或小于60%、20-60%之间、或10-50%之间的提供该钙通量激动剂的最大作用(就NF-κB和/或IL-8产生而言)的剂量。例如，从下面的实验数据可以看出，毒胡萝卜内酯的一种示例性次优浓度是在10-50nM之间(例如，约20nM)，其刚好低于从图1C可以看出的毒胡萝卜内酯可得到的最大作用。同样地，A23187的一种示例性次优浓度是在100-500nM之间(例如，约316nM)，其刚好低于从图1A可以看出的A23187可得到的最大作用，且离子霉素的一种示例性次优浓度是在300nM-5µM之间(例如，约1µM)，其刚好低于从图1B可以看出的离子霉素可得到的最大作用。从另一个角度看，因此将次优浓度表征为这样的浓度：在该浓度以下，可以观察到暴露于钙通量激动剂的细胞或组织的急性毒性效应。
如在下面更详细地证实的，使用IL-8 ELISA试验和/或发光试验可以容易地确定最大应答和次优浓度。在本发明主题的优选方面，次优浓度将是这样的浓度：在该浓度，应答等于或小于最大应答的70%，更典型地等于或小于最大应答的50%，且最通常地等于或小于最大应答的30%。因而，次优浓度将是在以下范围内：最大应答的1-20%之间，最大应答的20-40%之间，最大应答的40-60%之间，最大应答的60-80%之间，或最大应答的80-95%之间。同样地，应当指出，所述配体也可以以次优浓度存在，且所述次优浓度将是这样的浓度：在该浓度，对配体的应答等于或小于对于单独配体而言的最大应答的70%，更典型地等于或小于最大应答的50%，且最典型地等于或小于最大应答的30%。因而，次优浓度将是在以下范围内：对于单独配体而言的最大应答的1-20%至1-40%之间，最大应答的20-40%至20-80%之间，最大应答的30-70%之间，最大应答的40-80%之间，或最大应答的50-95%之间。
结果，在至少一些实施方案中，预见到的化合物以约0.1 ng/ml至约100 mg/ml之间的量存在，更典型地以约10 ng/ml至约10 mg/ml之间的量，且最典型地在约1 μg/ml至约100 μg/ml之间。在所述制剂是固体或凝胶的情况下，预见到的化合物将以约0.1 ng/g至约100 mg/g之间的量存在，更典型地以约10 ng/g至约10 mg/g之间的量，且最典型地在约1µg/g至约100µg/g之间。从不同的角度看，所述钙通量激动剂通常以0.1µM至10µM之间、10µM至100µM之间、100µM至1 mM之间、1 mM至10 mM之间、或10 mM至100 mM之间的浓度存在于制剂中。另外，且就钙通量激动剂在细胞或组织处的浓度(“有效暴露浓度”)而言，通常优选的是，所述有效暴露浓度是在1pM至1mM之间，且最优选地在各种钙通量激动剂的次优浓度。因此，毒胡萝卜内酯通常具有1nM至1µM之间的有效暴露浓度，更典型地在1nM至500nM之间，且最典型地在1nM至50nM之间，而DBHQ和CPA通常具有在100nM至500µM之间的有效暴露浓度，更典型地在500nM至100µM之间，且最典型地在1µM至50µM之间。另一方面，离子霉素和A23187通常具有10nM至100µM之间的有效暴露浓度，更典型地在100nM至50µM之间，且最典型地在200nM至10µM之间。
因此，预见到的化合物的合适量将是在0.1 μg/剂量单位至约0.5克/剂量单位的范围内，更典型地在10 μg/剂量单位至约0.05克/剂量单位之间，且最典型地在50 μg/剂量单位至约100 mg/剂量单位之间。因而，合适的剂量将是在约0.01 μg/kg至100 mg/kg的范围内，更典型地在1 μg/kg至50 mg/kg的范围内，且最典型地在10 μg/kg至10 mg/kg的范围内。
关于剂量单位，通常预见到，所述剂量单位将使得，所述剂量单位可有效地实现期望的治疗和/或预防效果。从不同的角度看, 剂量单位优选地含有足够量的钙通量激动剂以(优选地协同地)增加IL-8产生和/或NF-κB信号传递。
还应当理解，尽管可以局部地或在药物组合物(例如，乳膏剂、软膏剂等)中施用预见到的化合物和组合物，但是众多替代性的对受影响的组织的施用方法也被视为合适的。例如，可以将预见到的组合物与载体偶联或掺入载体中，所述载体直接地和可逆地施加于治疗部位或植入或以其它方式放置于治疗部位附近或与治疗部位接触。例如，预见到的化合物和组合物可以掺入局部施用的和可除去的载体(例如，绷带、纱布等)的一个或多个部分中或掺入覆盖膜中，所述覆盖膜可以或不能溶解或侵蚀(例如，经由可生物降解的药物洗脱聚合物)。替代性的载体包括植入在其中的珠子或可生物降解的药物洗脱聚合物，其中预见到的化合物和组合物可以是植入的装置的表面的组成部分或涂布在这样的装置上。
钙通量激动剂的剂量响应
发明人进行了几项研究以鉴别钙通量激动剂对免疫应答的不同组分的影响，特别是钙通量激动剂对IL-8产生和NF-κB信号传递活化的影响。从图1A-1C中可以容易地看出，离子载体和SERCA抑制剂造成IL-8产生和NF-κB信号传递的活化的显著增加。在离子载体(例如，A23187和离子霉素)的相对较大的窗口中且对于SERCA抑制剂(例如，毒胡萝卜内酯)而言在至少2个数量级中观察了剂量响应。
更具体地，在没有外部添加的TLR或NOD配体存在下，使用单核细胞-衍生的细胞系处理和A23187和离子霉素，在图1A-1B中显示了NF-κB和IL-8对离子载体的剂量响应。用递增浓度的A23187和离子霉素处理具有稳定地整合的NF-κB/萤光素酶报告盒的人单核细胞细胞系(THP-1)转染子，并使用发光测定法监测基于NF-κB报告物的应答(RLU=相对光单位，实心圆圈)，而使用夹心ELISA定量人IL-8 (hIL-8)释放(空心圆圈)。图1C描绘了NF-κB和IL-8对毒胡萝卜内酯的剂量响应。在这里，用递增浓度的毒胡萝卜内酯处理具有稳定地整合的NF-κB/萤光素酶报告盒的人单核细胞细胞系(THP-1)转染子，并使用发光测定法监测基于NF-κB报告物的应答(RLU=相对光单位，实心圆圈)，而使用夹心ELISA定量人IL-8 (hIL-8)释放(空心圆圈)。从两个通量激动剂组可以看出，在显著递增的NF-κB和IL-8应答，剂量响应在数量级上递增。
人IL-8活性：将滴定量的毒胡萝卜内酯(A.G. Scientific, San Diego CA)、离子霉素(Sigma-Aldrich, St. Louis MO)和钙离子载体A23187 (Sigma-Aldrich)加入接种了150,000个THP-1细胞(ATCC TIB-202)的96-孔板(Thermo Matrix, Waltham MA)中，所述细胞在补充了10%FBS (Thermo HyClone, Waltham MA)和1%青霉素-链霉素-两性霉素B(Thermo HyClone)的RPMI 1640 (Cellgro, Herndon VA)中生长。加入以后24小时，取出25uL上清液，并使用Meso Scale Discovery Human IL-8 Tissue Culture Kit (MSD,Rockville, MD)按照生产商的方案测定人IL-8。使用Meso Scale Discovery SECTORImager 2400分析结果，并标准化至滴定量的由MSD Kit供给的人IL-8。
NF-κB活化：将滴定量的毒胡萝卜内酯(A.G. Scientific)、离子霉素和钙离子载体A23187加入接种了150,000 THP-1个κB-LUC THP-1’s (含有稳定整合的NF-κB萤光素酶报告物的THP-1细胞)的96-孔板(Thermo Matrix)中，所述细胞生长在补充了10%FBS (ThermoHyClone)和1%青霉素-链霉素-两性霉素B (Thermo HyClone)的RPMI 1640 (Cellgro,Herndon VA)中。加入以后24小时，将25uL Bright-Glo Luciferase Assay System(Promega, Madison WI)加入每个孔中，并使用Perkin Elmer TopCount NXT (PerkinElmer, Waltham MA)分析萤光素酶活性。
钙通量激动剂作为与模式识别受体一起的协同试剂
在实验的最初设定中，在有不同浓度的钙通量激动剂存在下试验了TLR2受体配体Pam2CYS，且发明人意外地发现，次优和相对较低浓度的多种钙通量激动剂在有TLR配体存在下产生了惊人的协同应答。
例如，图2的图描绘了选定的钙通量激动剂与一种示例性TLR配体的典型协同效应。在这里，离子载体A23187和离子霉素、以及SERCA抑制剂毒胡萝卜内酯与TLR2配体(Pam2CYS)在从人THP-1前单核细胞性白血病细胞系释放细胞因子的活化中协作。应当特别指出，尽管单独的TLR2配体会提供约5 ng/ml IL-8应答，次优剂量的钙通量激动剂(例如，20 nM的毒胡萝卜内酯，316 nM的A23187，和1 μM的离子霉素)的加入在细胞中造成了超过10倍量的IL-8产生。
为了研究该观察结果对于其它模式识别受体、且特别是对于TLR和NOD受体和其它配体是否也适用，发明人试验了众多TLR和NOD受体和多种配体。值得注意的是，如从图3A-3E所见，在钙通量激动剂的类型和种类以及多种TLR和NOD受体和配体的大选择范围内观察到显著的协同作用，从而确立了TLR-和NOD-介导的信号可以用次优剂量的钙通量激动剂(通常协同地)增强。
更具体地，图3A显示的图描绘了次优剂量的A23187的增强toll-样受体(TLR)家族成员(TLR2、TLR4、TLR5、TLR9)和NOD家族成员(NOD1、NOD2)的细胞应答的协同效应。图3B显示的图描绘了次优剂量的离子霉素的增强toll-样受体(TLR)家族成员(TLR2、TLR4、TLR5、TLR9)和NOD家族成员(NOD1、NOD2)的细胞应答的协同效应。图3C显示的图描绘了次优剂量的环匹阿尼酸的增强toll-样受体(TLR)家族成员(TLR2、TLR4、TLR5)和NOD家族成员(NOD1、NOD2)的细胞应答的协同效应。图3D显示的图描绘了次优剂量的2,5-二(叔丁基)氢醌(DBHQ)的增强toll-样受体(TLR)家族成员(TLR2、TLR4、TLR5)和NOD家族成员(NOD1、NOD2)的细胞应答的协同效应。图3E显示的图描绘了次优剂量的毒胡萝卜内酯的增强toll-样受体(TLR)家族成员(TLR2、TLR4、TLR5、TLR9)和NOD家族成员(NOD1、NOD2)的细胞应答的协同效应。在该实验中使用的剂量是20 nM的毒胡萝卜内酯、316 nM的A23187、1µM的离子霉素、10µM的环匹阿尼酸和31.6µM的DBHQ。
可以容易地理解，尽管在次优浓度使用所有试验的钙通量激动剂，但是针对所有试验的TLR和NOD家族成员和合适的配体观察到就IL-8产生而言的协同效应。因而，钙通量激动剂对免疫应答、且特别是对IL-8产生和NF-κB信号传递的佐剂活性的清楚模式是明显的，其中所述免疫应答与TLR-或NOD-介导的事件有关。
钙通量的性质
发明人进一步研究了钙通量的性质是否具有重要性，因为增加的细胞内钙可能具有不同的起源。为此目的，发明人使用多种钙信号传递调节剂来研究钙通量的性质和贡献。从显示的数据可以容易地看出，从细胞外进入细胞中的钙通量对于钙信号传递的协同放大而言是关键性的。更具体地，图4解释了不同的Ca2+ 调节化合物对就NF-κB活化而言的协同作用的影响。应当指出，EGTA是一种细胞外螯合剂，并且KN-62是Cam激酶II (对于T-细胞活化而言重要的)的一种抑制剂，其不具有螯合剂作用。从图4可以容易地理解，细胞外Ca2+ 清除剂EGTA会将协同信号降低至与用单独TLR配体实现的水平一致的水平，而用Cam激酶II抑制剂KN-62的处理不会改变报道基因表达水平。
以前证实，TLR2和NOD2在哺乳动物细胞对金黄色葡萄球菌感染的感知和控制中起重要作用。鉴于THP-1-衍生的κB-LUC THP-1细胞分别由通用TLR2和NOD2配体Pam2Cys和MDP活化，并且该活化可以通过添加钙通量激动剂而进一步增强(图3A-3E)，如下评价了这些细胞的识别真正金黄色葡萄球菌-衍生的产物的能力。简而言之，将对数分裂的金黄色葡萄球菌的培养物用RPMI 1640 (Cellgro)洗涤3次。并行地，将在补充了10%FBS (ThermoHyClone, Waltham MA)和1%青霉素-链霉素-两性霉素B (Thermo HyClone)的RPMI 1640(Cellgro)中培养的THP-1κB-LUC THP-1’s (含有稳定整合的NF-κB萤光素酶报道基因的THP-1细胞)用RPMI 1640 (Cellgro)洗涤3次，并以120万/mL的浓度转移至24-孔0.4µm截止值透明孔板(Corning)的底隔室。然后将洗涤的金黄色葡萄球菌培养物的稀释物以指定的最初感染复数(MOI)加入透明孔系统的顶室。将细胞在37℃温育18小时，在此时将60,000个细胞的等分试样转移至384-孔白底板(Thermo)中的孔。为了评价萤光素酶基因表达，将Bright-Glo Luciferase Assay Reagent (Promega)加入每个孔中，并使用Perkin ElmerTopCount NXT系统(Perkin Elmer)分析平板的萤光素酶活性。与以前的结果相一致，当在培养系统中与活细菌共培养时，κB-LUC THP-1报告细胞表现出报告物活性的MOI依赖性的增加(图5A)，所述培养系统允许细菌产物的被动扩散，但是阻止完整金黄色葡萄球菌细菌和κB-LUC THP-1报告细胞之间的直接接触。
为了确定通过调节钙通量是否可以进一步增强金黄色葡萄球菌产生的产物的识别，将κB-LUC THP-1报告细胞在有1:100稀释(V/V)的无菌过滤的金黄色葡萄球菌调理的(即消耗的)或未使用的无菌培养基存在下温育，并用如上所述的次优剂量(20 nM)的毒胡萝卜内酯或二甲亚砜(DMSO)媒介物对照处理。简而言之，如下产生条件培养基：在摇动培养箱中在37℃在含有10%胎牛血清的RPMI中培养金黄色葡萄球菌过夜，此后将细菌通过离心进行沉淀，并将上清液使用0.2µm过滤器(VWR Radnor PA)过滤除菌。如上所述在萤光素酶测定之前将κB-LUC THP-1细胞在有调理的/消耗的培养基存在下温育18小时。令人感兴趣的是，在有毒胡萝卜内酯存在下显著增强了κB-LUC THP-1报告细胞对调理的/消耗的细菌培养物的应答(图5B)。
为了确定观察到的通过次优的毒胡萝卜内酯处理实现的细菌产物对κB-LUC THP-1细胞的活化的增强是否对于钙离子载体A23187和离子霉素也适用，分别在316 nM和1 μM的次优剂量使用这些离子载体重复该实验。在所有3种情况下，在有任何钙通量激动剂存在下显著增强了金黄色葡萄球菌调理的/消耗的培养基的识别(图5C-5E)。可能同样感兴趣的是，从该图可以容易地看出，通过加入细胞外螯合剂EGTA (1mM)可以抑制钙通量诱导的协同作用。
细胞外钙在人细胞中的作用
为了研究人细胞中的应答是否受钙通量的性质影响，发明人试验了被金黄色葡萄球菌感染的原代人单核细胞和粒细胞。从图6中的数据可以看出，为了吞噬的金黄色葡萄球菌的最佳杀死，人原代单核细胞和粒细胞对细胞外Ca2+存在明显需求。简而言之，使用Dynabeads Untouched Human Monocyte试剂盒(Life Technologies, Grand Island, NY)按照生产商的建议从商购可得的外周血单核细胞制品(Human Buffy Coat Leukocytes,Innovation Research, Novi MI)纯化原代人单核细胞。按照生产商的指导(GEHealthcare Life Sciences, Piscataway, NJ)通过Ficoll-Paque密度离心将正常供体血液分成2个级分，纯化原代人粒细胞。然后抛弃外周血单核细胞级分，并将红细胞/粒细胞级分按照生产商的方案(Biolegend, San Diego CA)进行红血细胞裂解缓冲液处理，随后在汉克氏缓冲的盐溶液(Cellgro)中洗涤2次以除去裂解试剂和细胞碎片。接着，将金黄色葡萄球菌的培养物在胰蛋白酶大豆液体培养基(Cellgro)中培养过夜。在实验开始之前使用得到的培养物接种新培养物以确保对数期生长。将细菌培养物沉淀(2000 X g离心10min)，并用汉克氏缓冲的盐溶液(Cellgro)洗涤3次。然后在适用时给如上制备的原代单核细胞/粒细胞补充10%人血清(Innovative Research, Novi MI)和1mM EGTA (Sigma-Adrich, St. Louis MO)，并在冰上冷却30分钟。30分钟以后，加入金黄色葡萄球菌(3.33的MOI)，并将混合物在冰上温育另外20分钟以使结合同步化。然后将试管在37℃温育20分钟。20分钟以后，将10U/mL溶葡萄球菌酶(Sigma-Aldrich)加入每个试管中以消除未内化的金黄色葡萄球菌。在期望的时间点(20、30、60分钟)，取出20uL等分试样并在10mL水中稀释。将稀释试管涡旋并将其在室温静置10分钟以确保原代细胞的适当裂解。10分钟以后，将稀释试管在2000 X g离心10分钟，将剩余的金黄色葡萄球菌浓缩20倍。然后将含有金黄色葡萄球菌的样品一式三份地铺板在胰蛋白酶大豆琼脂(Cellgro)上，并在37℃温育过夜以允许次日菌落计数。
关于感染和伤口愈合的体内模型
如上面已经指出的，钙通量激动剂与TLR和NOD配体协作以活化与免疫活化有关的途径。鉴于TLR和NOD配体在感染和损伤中的普遍，发明人因此预见到，钙通量激动剂在这些背景下的引入会极大地缩短疾病的持续时间和/或增进修复功能。为了证实这样的模型，在感染前治疗实验中试验了不同钙通量激动剂的改变伤口愈合动力学和影响细菌清除的能力。
为了确定钙通量激动剂（诸如离子载体A23187和离子霉素）或SERCA泵抑制剂毒胡萝卜内酯是否可以用作细菌感染的预治疗，发明人用仅媒介物或含有2 mM A23187、离子霉素或毒胡萝卜内酯的制剂处理了6-8周龄雄性C57Bl/6小鼠的剃毛背侧皮肤。1天后，发明人用2x106 CFU的金黄色葡萄球菌在浅表感染5只小鼠组的背侧皮肤，并在接下来的一周中评价细菌负荷和创伤大小。使用该模型，发明人研究了钙通量激动剂是否对伤口愈合具有有益效果(通过大小来测量)，如在图7中证实的。令人感兴趣的是，用离子载体或毒胡萝卜内酯治疗的动物在感染的第3、5和7天表现出与对照治疗动物相比明显更小的创伤大小(p<0.01，通过Student氏T-检验确定)。此外，用含有离子载体或毒胡萝卜内酯的制剂预治疗的动物在第7天在感染部位处具有与媒介物对照相比显著更少的细菌(图8)。
局部递送：将A23187和离子霉素和毒胡萝卜内酯在无水乙醇(SpectrumChemicals, Gardena CA)中重构至适当浓度用于以后配制。在感染前体内研究中，局部制剂由75%无水乙醇(Spectrum Chemicals)、22%环己烷(Sigma-Aldrich)和3%二甲亚砜(Sigma-Aldrich)组成。如下递送每个局部制剂：浸渍具有1.0厘米直径的圆形Whatman纸(Whatman, a division of GE Healthcare)块，并将所述圆块施加于每个受体的皮肤5分钟。
用于皮肤接种的金黄色葡萄球菌的制备：简而言之，将中对数期的金黄色葡萄球菌细菌洗涤2次，并以指定的浓度再悬浮于无菌盐水(0.9%)中。小鼠：在所有实验中使用6-8周龄的具有C57BL/6遗传背景的雄性小鼠(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)。
金黄色葡萄球菌皮肤伤口感染的小鼠模型：为了准备动物用于伤口感染，使用#40剪切机将小鼠的后上背部和颈部的皮肤剃毛。接着，在真皮中做出3个平行的8 mm长全厚度解剖刀切口(第11号刀片)。用微量移液器给产生的创伤接种10 μl金黄色葡萄球菌(2x108CFU/mL)。通过使用毫米尺子作为参照确定得自动物照片的总像素计数，量化总病灶大小(cm2)测量结果。
体内金黄色葡萄球菌细菌负荷的定量：为了确定体内细菌负荷，将被感染的小鼠在感染后第7天处死，并通过外科手术收获病灶。将收获的组织匀浆化，并在适当的固体生长培养基上铺板以后确定细菌计数。
抗细菌作用
与这些和以前的关于它们对金黄色葡萄球菌的固有抗生素活性的结果相一致，发明人证实了就甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)的直接抗生素活性而言的两种离子载体的直接抗生素活性。如预期的，两种离子载体在液体培养物测定中对MSSA具有活性，其中A23187是更有活性的化合物。令人感兴趣的是，两种化合物表现出对甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株的显著抗生素活性。
例如，图9A和9B的图分别显示了金黄色葡萄球菌对A23187和离子霉素的抗生素敏感性，且图9C显示了金黄色葡萄球菌对CPA的抗生素敏感性。从所述图可以看出，两种离子载体具有某种直接抗生素作用，但是，该作用显著小于使用卡那霉素作为直接抗生素的对照。相反，图10的图描绘了SERCA抑制剂毒胡萝卜内酯对金黄色葡萄球菌的直接抗生素作用的缺乏，甚至在高浓度。为了确定金黄色葡萄球菌的抗生素敏感性，将培养物在胰蛋白酶大豆液体培养基(Cellgro)中培养过夜。在实验开始之前使用得到的培养物接种新培养物以确保对数期生长。一旦细菌已经达到对数期，将细菌稀释至适当的OD600 ~0.05并转移至24-孔板。加入目标化合物，并将平板在摇动培养箱中在37℃温育。在不同的时间点取出等分试样，并使用BioTek Synergy2微量培养板读数器(BioTek, Winooski, VT)测量它们各自的OD600。对于其浊度受到目标化合物的加入影响的孔，取出等分试样并铺板在胰蛋白酶大豆琼脂(Cellgro)上，并在37℃温育过夜，并在次日计数。因而，应当理解，钙通量激动剂通过间接作用在抗微生物治疗中是有效的，最可能是由于增强的IL-8产生和增加的NF-κB驱动的转录。
此外，发明人还发现，可以以预防性方式使用间接抗生素作用。例如，发明人证实，与未用毒胡萝卜内酯处理过的类似地成熟的细胞相比，前单核细胞THP-1细胞处理过的毒胡萝卜内酯表现出更大的抗微生物活性(图11)。简而言之，将对数分裂的金黄色葡萄球菌沉淀(2000 X g离心10 min)，并用汉克氏缓冲的盐溶液(Cellgro)洗涤3次。并行地，将分化(使用1uM视黄酸和1uM胆骨化醇, Sigma-Aldrich)2天的、随后用20 nM毒胡萝卜内酯或媒介物处理1天的THP-1细胞收集并在汉克氏缓冲的盐溶液中洗涤。给分化细胞补充10%人血清(Innovative Research)，并在冰上冷冻30分钟。30分钟以后，在冰上加入金黄色葡萄球菌(10的MOI)保持另外20分钟以使结合同步化。然后将试管在37℃温育20分钟。20分钟以后，加入10U/mL溶葡萄球菌酶(Sigma-Aldrich)以消除未内化的细菌。在期望的时间点(20、30、60分钟)，取出20uL等分试样并稀释进10mL水中。将稀释试管涡旋并将其在室温静置10分钟以确保原代细胞的适当裂解。10分钟以后，将稀释试管在2000 X g离心10分钟，将剩余的金黄色葡萄球菌浓缩20倍。然后一式三份地铺板在胰蛋白酶大豆琼脂(Cellgro)上，并在37℃温育过夜然后菌落计数。
结果，应当理解，一种或多种离子载体可以用作局部预防和/或治疗剂用于治疗皮肤感染和/或改善伤口愈合。特别重要的是以免疫刺激性方式而不是以直接抗生素方式使用这样的组合物和方法，这会有利地避免以其它方式与由抗生素疗法建立的抗性有关的困难。当然，应当理解，在本文中也预见到众多其它病原体，且实际上包括所有当前已知的皮肤病原体(细菌、病毒、寄生虫和真菌)。
还应当进一步理解，在用预见到的化合物治疗过程中观察到显著的协同效应，其中协同作用是在活化免疫细胞的离子载体和TLR配体之间。这样的协同作用对于已经指向免疫应答的调节(例如，使用艾达乐的药物疗法)或抵抗疾病的其它免疫活化疗法的治疗而言可以是特别重要的。因此，发明人预见到，离子载体可以在发作之前和之后在治疗上用于抵抗浅表皮肤感染。此外，且鉴于皮肤的双重物理屏障和免疫学功能以及证实离子载体在免疫细胞中的活化/调节活性的体外数据的丰富，发明人也预见到含有离子载体的局部制剂将在需要治疗急性(例如，由损伤引起)或慢性(例如，如在糖尿病性溃疡等中观察到的)浅表创伤、烧伤和皮肤的其它炎症性障碍/自身免疫障碍(例如，银屑病、湿疹等)的患者中具有治疗益处。
除了皮肤以外，上皮组织包括衬在胃肠道(包括消化道腔内)、呼吸道和泌尿生殖道中的细胞。除了后者以外，剩余的组织持续地暴露于微生物和其它因素诸如花粉和人造环境污染物，它们可以造成或以其它方式加重局部炎症和/或病灶形成。由于活化TLR受体的微生物在胃肠道(包括口腔)中普遍存在，也预见到利用离子载体治疗口腔脓肿，且可能治疗炎性肠病。
结果，应当理解，局部施用的毒胡萝卜内酯可以用作治疗剂在活化免疫细胞中与TLR配体协作。最值得注意的是，发明人发现，在感染之前用毒胡萝卜内酯或其它钙通量激动剂处理过的皮肤会清除活细菌且比对照处理的皮肤更快地愈合。同样重要的是，发明人证实，在体内观察到的差异不可能是由于毒胡萝卜内酯的固有抗生素性质。所以，发明人预见到，毒胡萝卜内酯或其它钙通量激动剂可以在治疗上用于抵抗由病原体造成的浅表皮肤感染，所述病原体在它们的发作以后产生或含有TLR/NOD配体(例如，金黄色葡萄球菌)。鉴于皮肤的双重物理屏障和免疫学功能以及证实毒胡萝卜内酯或其它钙通量激动剂在免疫细胞中的活化/调节活性的体外数据的丰富，发明人预见到含有毒胡萝卜内酯的局部制剂在需要治疗急性(例如，由损伤引起)或慢性(例如，如在糖尿病性溃疡等中观察到的)浅表创伤、烧伤和皮肤的其它炎症性障碍/自身免疫障碍(例如，银屑病、湿疹等)的患者中具有治疗益处。
因而，已经公开了钙通量激动剂的具体实施方案和应用。但是，本领域技术人员应当明白，在不脱离本文中本发明的概念的情况下，除了已经描述的那些以外的许多其它修改是可能的。因此，除了在所附权利要求书的精神内以外，本发明主题没有限制。此外，在解释说明书和权利要求书时，所有术语应当以与上下文一致的最宽可能方式进行解释。具体地，术语“包括”和“包含”应当解释为以非排它方式表示元件、组分或步骤，从而指示所述元件、组分或步骤可以与没有明确地提及的其它元件、组分或步骤一起存在或利用或组合。

Claims (29)

1.钙通量激动剂在制备局部施用的药物中的用途，所述药物用于通过增强免疫感受态细胞对模式识别受体的配体的免疫应答而预防和/或治疗皮肤感染或减少瘢痕形成，
其中所述钙通量激动剂是选自离子霉素、卡西霉素、钙离子载体II、钙离子载体IV、钙离子载体V和钙离子载体VI的钙离子载体，或
其中所述钙通量激动剂是选自毒胡萝卜内酯、钌红、姜酚、蕈青霉素和环匹阿尼酸的SERCA抑制剂。
2.权利要求1所述的用途，其中所述增强的免疫应答是增加的IL-8分泌或增加的NF-κB信号传递的活化。
3.权利要求1或2所述的用途，其中所述免疫感受态细胞是存在于表皮或真皮中的细胞。
4.权利要求1或2所述的用途，其中所述免疫感受态细胞表达TLR受体或NOD受体中的至少一种。
5.权利要求1或2所述的用途，其中所述模式识别受体是TLR受体或NOD受体。
6.权利要求1或2所述的用途，其中所述模式识别受体的配体是PAMP。
7.权利要求1或2所述的用途，其中在有配体存在下以协同方式增强所述免疫应答，且其中在就没有配体存在下钙通量激动剂的最大作用而言次优浓度的配体存在的情况下使用所述钙通量激动剂。
8.钙通量激动剂在局部施用的药物的制备中的用途，所述药物用于通过增强皮肤中的免疫应答而预防和/或治疗皮肤感染或减少瘢痕形成，其中所述免疫应答与免疫感受态细胞中配体对模式识别受体的结合有关，
其中所述钙通量激动剂是选自离子霉素、卡西霉素、钙离子载体II、钙离子载体IV、钙离子载体V和钙离子载体VI的钙离子载体，或
其中所述钙通量激动剂是选自毒胡萝卜内酯、钌红、姜酚、蕈青霉素和环匹阿尼酸的SERCA抑制剂。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述模式识别受体是TLR受体或NOD受体。
10.根据权利要求8-9中的任一项所述的用途，其中所述模式识别受体是Pam2CYS、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、NOD1和NOD2中的至少一种。
11.根据权利要求8-9中的任一项所述的用途，其中所述钙通量激动剂以这样的浓度存在于药物中：所述浓度使得在就没有配体存在下钙通量激动剂的最大作用而言次优浓度的配体存在的情况下，所述钙通量激动剂存在于细胞中。
12.钙通量激动剂在用于增强皮肤的伤口愈合的、局部施用的药物的制备中的用途，其中所述钙通量激动剂以有效地活化伤口中的细胞的NF-κB信号传递的量存在，
其中所述钙通量激动剂是选自离子霉素、卡西霉素、钙离子载体II、钙离子载体IV、钙离子载体V和钙离子载体VI的钙离子载体，或
其中所述钙通量激动剂是选自毒胡萝卜内酯、钌红、蕈青霉素和环匹阿尼酸的SERCA抑制剂。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述伤口是被细菌病原体感染的伤口。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述细菌病原体包含TLR受体或NOD受体的配体。
15.钙通量激动剂在制备局部施用的药物中的用途，所述药物用于通过增强细胞对模式识别受体的配体的免疫应答而预防和/或治疗皮肤感染或减少瘢痕形成，其中所述细胞表达所述模式识别受体，其中所述免疫应答的增强是通过包括以下步骤的方法：
在有配体存在下将所述细胞暴露于增强免疫应答的量的钙通量激动剂，
其中所述钙通量激动剂是选自离子霉素、卡西霉素、钙离子载体II、钙离子载体IV、钙离子载体V和钙离子载体VI的钙离子载体，或
其中所述钙通量激动剂是选自毒胡萝卜内酯、钌红、姜酚、蕈青霉素和环匹阿尼酸的SERCA抑制剂。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述免疫应答是增加的IL-8分泌或增加的NF-κB信号传递的活化。
17.根据权利要求15-16中的任一项所述的用途，其中所述配体和所述钙通量激动剂以协同量存在。
18.根据权利要求15-16中的任一项所述的用途，其中所述细胞是位于皮肤的真皮层或表皮层中的细胞。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述皮肤是受损伤的或被感染的皮肤。
20.根据权利要求15-16中的任一项所述的用途，其中所述模式识别受体是TLR受体或NOD受体。
21.根据权利要求15-16中的任一项所述的用途，其中所述配体是PAMP。
22.钙通量激动剂在制备用于治疗受损伤的或被感染的皮肤的制剂中的用途，其中钙通量激动剂以在所述受损伤的或被感染的皮肤与所述制剂接触后增强免疫应答和增加伤口愈合的量存在于制剂中，
其中所述钙通量激动剂是选自离子霉素、卡西霉素、钙离子载体II、钙离子载体IV、钙离子载体V和钙离子载体VI的钙离子载体，或
其中所述钙通量激动剂是选自毒胡萝卜内酯、蕈青霉素和环匹阿尼酸的SERCA抑制剂。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述免疫应答是增加的IL-8分泌或增加的NF-κB信号传递的活化。
24.钙通量激动剂在制备局部施用的药物中的用途，所述药物用于通过调节组织或细胞中对TLR-或NOD-介导的刺激的免疫应答而预防和/或治疗皮肤感染或减少瘢痕形成，其中所述免疫应答的调节是通过包括以下步骤的方法：
使所述组织或细胞与特定浓度的钙通量激动剂接触，与没有钙通量激动剂时的细胞内钙浓度相比，所述特定浓度有效地增加细胞内钙浓度；
其中所述钙通量激动剂的浓度有效地调节对TLR-介导的刺激的免疫应答，
其中所述钙通量激动剂是选自离子霉素、卡西霉素、钙离子载体II、钙离子载体IV、钙离子载体V和钙离子载体VI的钙离子载体，或
其中所述钙通量激动剂是选自毒胡萝卜内酯、钌红、姜酚、蕈青霉素和环匹阿尼酸的SERCA抑制剂。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述组织是上皮组织。
26.根据权利要求24-25中的任一项所述的用途，其中所述接触步骤包括给所述组织或细胞局部施用所述钙通量激动剂。
27.根据权利要求24-25中的任一项所述的用途，其中所述TLR-或NOD-介导的刺激是细菌感染、病毒感染或真菌感染。
28.根据权利要求24-25中的任一项所述的用途，其中所述TLR-或NOD-介导的刺激是组织损伤。
29.根据权利要求24-25中的任一项所述的用途，其中所述模式识别受体是Pam2CYS、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、NOD1和NOD2中的至少一种。
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