CN105167172A - 一种用于降低烟草萃取液中nnn含量的试剂盒 - Google Patents

Abstract

<b />本发明涉及烟草资源再利用技术领域，特别是涉及一种用于降低烟草萃取液中NNN含量的试剂盒。本发明提供一种用于降低烟草萃取液中NNN含量的试剂盒，包括CYP2A6酶、NADPNa₂、氯化镁和缓冲体系。本发明所提供的用于降低烟草萃取液中NNN的试剂盒对烟草萃取液其它成分无影响，且无毒无害，是一种环境友好型烟草减害剂。

Description

一种用于降低烟草萃取液中NNN含量的试剂盒

技术领域

本发明涉及烟草资源再利用技术领域，特别是涉及一种用于降低烟草萃取液中NNN含量的试剂盒。

背景技术

烟叶和烟梗除了用作卷烟的主要原料，还有许多其它的用途。可将过剩的或残次的烟叶烟梗进行资源再利用，经水溶液浸泡处理，可用于再造烟叶生产，如经过提取分离，可得到烟草中有效成分的单体或混合物，用于卷烟加香、生产电子烟烟油、以及用作化工中间体及食品添加剂。然而，烟草萃取液中含有多种难以清除的烟草有害成分，在利用烟草萃取液的过程中，这些难以清除的有害成分容易造成环境污染并会一起进入卷烟，危害人体健康。

烟草中普遍含有NNN(N-亚硝基降烟碱，CAS登录号16543-55-8)，国际癌症研究所将NNN定义为1类致癌物，它在人体中代谢速度慢，半衰期长，对人体健康危害性极大。NNN主要生成于烟草的调制阶段，NNN一旦生成，便能稳定地存在于烟草中。NNN易溶于水，在烟草萃取液中普遍存在，给烟草资源的再利用带来不便。NNN分子结构简单，化学活泼性低，导致降低这种化合物比较困难。

目前，存在可降低烟草中的NNN的方法，但这些手段在降低NNN的同时，也降低了烟草中其它有益成分。酶是一种具有生物催化功能的高分子物质，它具有高度的专一性，只催化特定的反应或产生特定的构型，对其它物质无催化作用。但是，目前尚未有降低烟草萃取液中有害成分NNN的生物酶。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于降低烟草萃取液中NNN含量的试剂盒，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种用于降低烟草萃取液中NNN含量的试剂盒，包括CYP2A6酶、NADPNa₂、氯化镁和缓冲体系。

具体的，CYP2A6酶(CytochromeP4502A6，NP_000753)为细胞色素P450重要成员之一。

优选的，所述CYP2A6酶为含有活性成分CYP2A6酶的试剂，其中，CYP2A6酶的浓度范围为0.5-5nmol/L，更优选为0.8-1.2nmol/L。

更优选的，所述CYP2A6酶为人同源的重组蛋白酶，通过大肠杆菌(E.coli)的细胞色素还原酶表达体系制备获得，通过大肠杆菌的细胞色素还原酶共表达体系制备获得。

具体的，NADPNa₂为烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸二钠，所述NADPNa₂是NADPH的氧化形式，即NADPH失去了个电子而带上一个正电荷形成钠盐，所述NADPH为烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸，它是光合作用中重要的一种辅酶。

优选的，所述试剂盒使用时，CYP2A6酶、NADPNa₂、氯化镁添加量的重量比为1：100-200：60-120。

更优选的，所述试剂盒使用时，将CYP2A6酶产品、NADPNa₂、氯化镁和缓冲体系添加于烟草萃取液中，添加量(CYP2A6酶、NADPNa₂、氯化镁和缓冲体系添加量的总和)为烟草萃取液重量的1-2％，更优选为1.3-1.4％，添加时烟草萃取液中NNN的浓度为1-10μmol/L。

优选的，所述缓冲体系用于降低pH的变动幅度，并使烟草缓冲液的pH值在4.4-7.6的范围内。

更优选的，所述缓冲体系为柠檬酸盐，在本发明一优选实施例中，所述缓冲体系为柠檬酸三钠。

进一步优选的，所述试剂盒使用时，CYP2A6酶、NADPNa₂、氯化镁和柠檬酸盐的重量比为1：100-200：60-120：1200-2400。

本发明所提供的用于降低烟草萃取液中NNN含量的试剂盒提供了一种CYP2A6酶体系，所述试剂盒使用时可直接添加于烟草萃取液中。

所述试剂盒中，CYP2A6酶(CYP2A6酶产品)、NADPNa₂、氯化镁和缓冲体系的制备方法均为现有技术。

本发明第二方面提供CYP2A6酶在降低烟草萃取液中NNN含量的用途。

优选的，所述CYP2A6酶为CYP2A6酶体系，所述用途具体为，通过在烟草萃取液中添加CYP2A6酶体系，以降低烟草萃取液中NNN含量。

更优选的，所述酶体系为所述用于降低烟草萃取液中NNN含量的试剂盒。

本发明第三发面提供一种降低烟草萃取液中NNN的方法，使用所述试剂盒，包括如下步骤：将CYP2A6酶、NADPNa₂、氯化镁和缓冲体系加入烟草萃取液中，搅拌均匀，进行反应。

本领域技术人员可根据烟草萃取液的实际情况，调整烟草萃取液的浓度，以保证反应在适当的浓度下进行。

优选的，添加CYP2A6酶、NADPNa₂、氯化镁和缓冲体系时，烟草萃取液中NNN的浓度为1-10μmol/L。

优选的，所述CYP2A6酶、NADPNa₂、氯化镁和缓冲体系添加量的总和相对于烟草萃取液的重量为1-2％，优选为1.3-1.4％，所述试剂盒加入烟草萃取液时，CYP2A6酶、NADPNa₂、氯化镁和缓冲体系的重量比为1：100-200：60-120：1200-2400。

本领域技术人员可根据烟草萃取液的实际情况，调整缓冲体系的用量，使烟草缓冲液的pH值在4.4-7.6的范围内。

优选的，所述用于降低烟草萃取液中NNN的试剂盒施加于烟草萃取液中的反应时间≥10h。

更优选的，所述用于降低烟草萃取液中NNN的试剂盒施加于烟草萃取液中的反应时间为10-24h。

优选的，所述烟草萃取液的温度≤40℃。烟草萃取液的温度过高，会降低酶的活力。

更优选的，所述烟草萃取液的温度为35-39℃，在此范围内，反应效率更高。

如上所述，针对现有烟草资源再利用过程中有害成分难以清除等问题，本发明提供一种用于降低烟草萃取液中NNN的试剂盒(组合物)，所述试剂盒中各组分添加于烟草萃取液中，可降低NNN含量，经过酶处理过的烟草萃取液，NNN得到相应的下降。本发明所提供的用于降低烟草萃取液中NNN的试剂盒对烟草萃取液其它成分无影响，且无毒无害，是一种环境友好型烟草减害剂。与现有技术相比，其具有以下有益效果：

(1)本发明提供的CYP2A6酶体系具有专一选择性，仅针对NNN，对其它烟草成分无影响。

(2)本发明提供的CYP2A6酶体系为水溶性物质，可广泛适用于烟草生产中。

(3)本发明提供的CYP2A6酶体系为安全试剂，是一种环境友好型烟草减害剂，对人体和环境均无不良影响。

(4)本发明提供的CYP2A6酶体系生产成本低廉，易于生产与应用。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

以下实施例中使用的试剂和设备如下：

1、试剂

CYP2A6酶试剂(1nmol/L，北京欧凯姆科技有限公司)、NADPNa₂(纯度≥97％，北京欧凯姆科技有限公司)、氯化镁(纯度≥98％，百灵威科技有限公司)、柠檬酸三钠(纯度≥98％，百灵威科技有限公司)；去离子水(纯水机自制)；烟草萃取液(上海烟草集团北京卷烟厂自制。具体制作方法如下：取100g烟丝(白肋烟)与适量水混合，沸水煮30min，过滤得上清液，定容至200mL，添加NNN至对应浓度，即为自制烟草萃取液)。

2、仪器

高效液相-三重四极杆串联质谱联用仪(高效液相仪：Symbiosis(Pico)、SparkHolland公司；三重四极杆质谱仪：API5500、美国应用生物系统公司)

实施例1

按重量份计取0.01gCYP2A6酶试剂(1nmol/L)、1gNADPNa₂、12g柠檬酸三钠、0.6g氯化镁。

待烟草萃取液温度降至40℃以下后，将上述CYP2A6酶体系施加1.36kg烟草萃取液中，搅拌均匀，并保持反应溶液温度37℃，反应时间为24h。其中，CYP2A6酶体系施加于烟草萃取液中的量为烟草萃取液重量的1％。

实施例2

将实施例1中所得的样品(施加了CYP2A6酶体系的烟草萃取液样品，反应24h后)稀释20倍，采用高效液相-三重四极杆质谱联用仪测定组分含量，重复测定5次，并取平均值。同时，取未施加CYP2A6酶体系的烟草萃取液样品，进行相同步骤后，测定组分含量。施加样品和对照样品中NNN含量以及其他组分的含量检测结果见表1和表2。并以对照组为参考，计算施加CYP2A6酶体系后NNN的降低率。表1中，实施例1所得样品为施加组，未施加CYP2A6酶体系的烟草萃取液样品为对照组。

具体计算公式为：

NNN降低率(％)＝((对照组NNN含量-施加组NNN含量)/对照组NNN含量)×100％

由表1中结果可以看出，与对照组比较，施加了CYP2A6酶体系的烟草萃取液样品，其NNN含量分别降低了33.4％。由表2可以看出，施加了CYP2A6酶体系的烟草萃取液样品，其它成分变化不大。

表1CYP2A6酶体系降低烟草萃取液中NNN的结果

表2CYP2A6酶体系对烟草萃取液中其他组分的影响结果(浓度为平均值，mg/mL)

“-”表示无变化。其中，各组分的测量方法参照如下标准：总糖YC/T159-2002，还原糖YC/T159-2002，淀粉YC/T216-2007，总氮YC/T161-2002，钾YC/T218-2007，氯YC/T162-2011。

实施例3

按重量份计取0.01gCYP2A6酶试剂(1nmol/L)、2gNADPNa₂、24g柠檬酸三钠、1.2g氯化镁。

待烟草萃取液温度降至40℃以下后，将上述CYP2A6酶体系施加1.36kg烟草萃取液中，搅拌均匀，并保持反应溶液温度37℃，反应时间为24h。其中，CYP2A6酶体系施加于烟草萃取液中的量为烟草萃取液重量的2％。经处理后的萃取液样品其NNN的含量显著下降，其下降幅度与实施例1相近。

实施例4

按重量份计取0.01gCYP2A6酶试剂(5nmol/L)、1.5gNADPNa₂、20g柠檬酸三钠、0.8g氯化镁。

待烟草萃取液温度降至40℃以下后，将上述CYP2A6酶体系施加1.36kg烟草萃取液中，搅拌均匀，并保持反应溶液温度37℃，反应时间为16h。其中，CYP2A6酶体系施加于烟草萃取液中的量为烟草萃取液重量的1.5％。经处理后的萃取液样品其NNN的含量显著下降，其下降幅度与实施例1相近。

实施例5

按重量份计取0.01gCYP2A6酶试剂(0.5nmol/L)、2gNADPNa₂、12g柠檬酸三钠、2.2g氯化镁。

待烟草萃取液温度降至40℃以下后，将上述CYP2A6酶体系施加1.36kg烟草萃取液中，搅拌均匀，并保持反应溶液温度37℃，反应时间为14h。其中，CYP2A6酶体系施加于烟草萃取液中的量为烟草萃取液重量的1.2％。经处理后的萃取液样品其NNN的含量显著下降，其下降幅度与实施例1相近。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (12)

1.一种用于降低烟草萃取液中NNN含量的试剂盒，包括CYP2A6酶、NADPNa₂、氯化镁和缓冲体系。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述CYP2A6酶为含有活性成分CYP2A6酶的试剂，其中，CYP2A6酶的浓度范围为0.5-5nmol/L。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒使用时，CYP2A6酶、NADPNa₂、氯化镁添加量的重量比为1：100-200：60-120。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲体系为柠檬酸盐。

5.CYP2A6酶在降低烟草萃取液中NNN含量的用途。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述CYP2A6酶为CYP2A6酶体系，通过在烟草萃取液中添加CYP2A6酶体系，以降低烟草萃取液中NNN含量。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述酶体系为如权利要求1-4任一权利要求所述的试剂盒。

8.一种降低烟草萃取液中NNN含量的方法，使用权利要求1-4任一权利要求所述的试剂盒，包括如下步骤：将CYP2A6酶、NADPNa₂、氯化镁和缓冲体系加入烟草萃取液中，搅拌均匀，进行反应。

9.如权利要求8所述的一种降低烟草萃取液中NNN含量的方法，其特征在于，添加CYP2A6酶、NADPNa₂、氯化镁和缓冲体系时，烟草萃取液中NNN的浓度为1-10μmol/L。

10.如权利要求8所述的一种降低烟草萃取液中NNN含量的方法，其特征在于，所述CYP2A6酶、NADPNa₂、氯化镁和缓冲体系添加量的总和相对于烟草萃取液的重量为1-2％，所述CYP2A6酶、NADPNa₂、氯化镁和缓冲体系加入烟草萃取液时，CYP2A6酶、NADPNa₂、氯化镁和缓冲体系的重量比为1：100-200：60-120：1200-2400。

11.如权利要求8所述的一种降低烟草萃取液中NNN含量的方法，其特征在于，所述用于降低烟草萃取液中NNN的试剂盒施加于烟草萃取液中的反应时间≥10h，更优选为10-24h。

12.如权利要求8所述的一种降低烟草萃取液中NNN含量的方法，其特征在于，所述烟草萃取液的温度≤40℃，更优选为35-39℃。