CN105164153A - 人源化的t细胞共受体的小鼠 - Google Patents

人源化的t细胞共受体的小鼠 Download PDF

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Abstract

本发明提供了表达嵌合的人/非人T细胞共受体多肽(例如CD4、CD8α、CD8β)的基因修饰的非人动物，及包含其的胚胎、细胞和组织。本发明还提供了制备所述基因修饰的动物的构建体和制备其的方法。

Description

人源化的T细胞共受体的小鼠
相关申请的交叉引用
本申请要求根据35U.S.C.§119(e)的2013年10月15日提交的美国临时专利申请序列号61/890,915和2013年2月20提交的美国临时专利申请序列号61/766,762的优先权，其全部内容在此参考并入。
序列表
本申请的说明书中引用了以电子形式于2014年2月20日提交的序列表，其为文件名为“2010794-0441_ST25”的ascii.txt文件。该.txt文件于2014年2月13日生成，其大小为47kb。
发明领域
本发明涉及非人动物(例如，啮齿动物，例如小鼠或大鼠)，所述非人动物经基因工程改造以表达人源化的T细胞共受体。本发明涉及经基因工程改造以表达人源化的CD4或CD8共受体的非人动物，以及表达其的胚胎、组织和细胞。本发明还涉及经工程改造以共表达人源化的CD4共受体和人源化的主要组织相容性复合物(MHC)II的非人动物。本发明还涉及经工程改造以共表达人源化的CD8共受体和人源化的MHCI的非人动物。本发明还提供了制备经基因工程改造的动物的方法，所述动物表达人源化的T细胞共受体(例如，人源化的CD4或CD8)。本发明还提供了使用表达人源化的T细胞共受体的所述经基因工程改造的动物用于研发人类疗剂的方法。
发明背景
在适应性免疫应答中，外来抗原被B淋巴细胞和T淋巴细胞上的受体分子(例如，免疫球蛋白和T细胞受体或TCR)所识别。这些外来抗原被特定蛋白作为肽片段递呈至细胞表面上，通常将所述特定蛋白称为主要组织相容性复合物(MHC)分子。在T细胞介导的应答过程中，由MHC分子递呈的抗原被T细胞受体所识别。然而，有效的免疫应答除了需要MHC-抗原复合物的T细胞受体识别以外，还需要T细胞共受体分子(例如，CD4或CD8)与MHC恒定部分的结合。
T细胞分为几个种类，包括辅助T细胞和细胞毒性T细胞。辅助T细胞表达共受体CD4并且识别与MHCII分子结合的抗原。CD4+T细胞活化免疫系统中的其他效应细胞，例如活化表达MHCII的B细胞以产生抗体，活化表达MHCII的巨噬细胞以破坏病原体等。CD4和T细胞受体与相同MHCII递呈的外来抗原的结合使得T细胞对该抗原具有更加显著的敏感性。
而相反的是，细胞毒性T细胞(CTL)表达共受体CD8并且识别与MHCI分子结合的外来抗原。CTL专门地杀伤携带被其自身膜结合TCR所识别的MHCI结合肽的任意细胞。当细胞展示出来源于非正常存在的(例如，来源于病毒、肿瘤或其他非自身来源)细胞蛋白的肽时，此类肽被CTL所识别，CTL被活化并且杀伤展示出所述肽的细胞。与CD4类似，CD8的结合使得CTL对MHCI递呈的抗原更加敏感。
由于耐受机制使得并非所有的抗原均激发T细胞活化。然而，在一些疾病中(例如，癌症、自身免疫性疾病)来源于自身蛋白的肽成为免疫系统细胞成分的靶点，这导致递呈此类肽的细胞被破坏。其对于识别具有临床意义的抗原(例如，与多种类型的癌症相关的抗原)方面具有显著的推动作用。然而，为了改进对在人类T细胞中激发适宜应答的肽的鉴定和选择，特别是具有临床意义的抗原的肽，仍需要模拟人免疫系统的体内和体外系统。因此，需要能够展示出人免疫系统成分的生物系统(例如，基因修饰的非人动物和细胞)。
发明概述
本申请提供了包含非人细胞的非人动物，所述非人细胞表达在细胞免疫应答中具有功能的人的或人源化的分子。本申请还提供了编码人或人源化的T细胞共受体(例如，CD4和/或CD8)蛋白的人源化的啮齿动物基因座。本申请还提供了表达人或人源化的T细胞共受体(例如，CD4和/或CD8)蛋白的人源化的啮齿动物细胞。本申请提供了体内和体外系统，所述系统包含人源化的啮齿动物细胞，其中所述啮齿动物细胞表达一种或多种人或人源化的免疫系统分子。
本申请提供一种基因修饰的非人动物，所述非人动物在其基因组中包含编码人或人源化的T细胞共受体多肽的核苷酸序列。在不同实施方式中，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，所述非人动物包含编码嵌合的人/非人T细胞共受体多肽的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述核苷酸序列存在于内源性T细胞共受体基因座。在一个实施方式中，所述嵌合的T细胞共受体多肽的人部分包含全部或基本上全部的人T细胞共受体的胞外域，和所述非人动物表达功能性的嵌合的T细胞共受体多肽。在一个实施方式中，所述嵌合的T细胞共受体多肽的非人部分至少包含非人T细胞共受体的跨膜和胞质结构域，和所述非人动物表达功能性的嵌合的T细胞共受体多肽。在本发明的一个方面，所述嵌合的T细胞共受体多肽仅在所述非人动物的T细胞上表达，例如其不在所述非人动物的B细胞上表达。在一个方面，所述动物不表达来自其内源性非人T细胞共受体基因座的功能性非人T细胞共受体。在本发明的一个方面，所述嵌合的T细胞共受体多肽包含在所述非人动物的种系中。在一个方面，所述动物在内源性T细胞共受体基因座包含编码所述嵌合的T细胞共受体多肽的核苷酸序列的一个或两个拷贝；因此，所述动物针对编码嵌合的T细胞共受体多肽的所述核苷酸序列可以是杂合的或纯合的。
在一个实施方式中，所述T细胞共受体是CD4。因此，在一个方面，本发明提供了一种基因修饰的非人动物，所述非人动物包含编码嵌合的人/或非人CD4多肽的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述核苷酸序列存在于内源性CD4基因座。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物，例如小鼠或大鼠。因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠在其内源性CD4基因座包含编码嵌合的人/小鼠CD4多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合的CD4多肽的人源部分包含全部或基本上全部的人CD4多肽的胞外域，其中所述嵌合的CD4多肽的小鼠部分至少包含小鼠CD4多肽的跨膜和胞质结构域，和其中所述小鼠表达功能性的嵌合的人/小鼠CD4。在一个实施方式中，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠在其内源性CD4基因座包含编码嵌合的人/小鼠CD4多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合的多肽的人源部分至少包含全部或基本上全部的人CD4多肽的结构域D1-D3，其中所述嵌合的多肽的小鼠部分至少包含小鼠CD4的跨膜和胞质结构域，和其中所述小鼠表达功能性的嵌合的人/小鼠CD4。在一个方面，所述小鼠不表达来自其内源性小鼠CD4基因座的功能性内源性小鼠CD4。在一个实施方式中，编码嵌合的人/小鼠CD4多肽的所述核苷酸序列与内源性小鼠启动子和调控序列可操作地连接。因此，在一个实施方式中，所述小鼠在CD8谱系的B细胞或T细胞上不表达所述嵌合的CD4蛋白。在一个实施方式中，所述嵌合的CD4蛋白的人源部分包含如SEQIDNO:57所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述嵌合的人/小鼠CD4多肽如SEQIDNO:4所示。
在一个方面，包含本申请所述的嵌合的CD4多肽的所述基因修饰的非人动物，例如所述基因修饰的小鼠，还包含人或人源化的MHCII蛋白，其中所述MHCII蛋白包含人MHCIIα多肽的胞外域和人MHCIIβ多肽的胞外域。在一个方面，所述动物包含人源化的MHCII蛋白。在一个实施方式中，所述动物是小鼠并且所述小鼠在内源性MHCII基因座包含(1)编码嵌合的人/小鼠MHCIIα多肽的核苷酸序列，其中所述MHCIIα多肽的人源部分包含人MHCIIα的胞外域，和内源性小鼠MHCIIα多肽的跨膜和胞质结构域，以及(2)编码嵌合的人/小鼠MHCIIβ多肽的核苷酸序列，其中所述MHCIIβ多肽的人源部分包含人MHCIIβ的胞外域，和内源性小鼠MHCIIβ多肽的跨膜和胞质结构域。对包含编码嵌合的人/非人(例如人/小鼠)MHCII核苷酸序列的基因修饰的非人动物(例如小鼠)更加详细的描述请参见美国专利申请号13/661,116和13/793,935，其通过引用整体并入本申请。在一个实施方式中，表达人源化的CD4和/或MHCII蛋白的动物通过取代分别位于CD4和/或MHCII基因座的内源性非人(例如小鼠)CD4和/或MHCII基因的部分产生。
因此，本申请还提供了一种修饰非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠)的CD4基因座以表达嵌合的人/小鼠CD4多肽的方法，所述方法包括使用编码嵌合的人/小鼠CD4多肽的核苷酸序列在内源性CD4基因座取代编码内源性非人(例如小鼠)CD4多肽的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述嵌合的人/非人(例如人/啮齿动物，例如人/小鼠)CD4多肽包含至少全部或基本上全部的人CD4多肽的结构域D1-D3和内源性非人(例如啮齿动物，例如小鼠)CD4多肽的至少跨膜和胞质结构域。在一个实施方式中，所表达的嵌合的人/小鼠CD4如SEQIDNO:4所示。
在另一个实施方式中，所述T细胞共受体是CD8。因此，在一个方面，本发明提供了一种基因修饰的非人动物，所述非人动物包含编码嵌合的人/非人CD8多肽的核苷酸序列，例如嵌合的人/非人CD8α和/或CD8β多肽。在一个实施方式中，所述核苷酸序列位于内源性CD8基因座。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物，例如小鼠或大鼠。因此，在一个实施方式中，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠在其内源性CD8基因座(例如内源性CD8α和/或CD8β基因座)包含编码嵌合的人/小鼠CD8α多肽的第一核苷酸序列和编码嵌合的人/小鼠CD8β多肽的第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列包含编码全部或基本上全部的人CD8α多肽的胞外域和小鼠CD8α多肽至少跨膜和胞质结构域的序列，和其中所述第二核苷酸序列包含编码全部或基本上全部的人CD8β多肽的胞外域和小鼠CD8β多肽至少跨膜和胞质结构域的序列，其中所述小鼠表达功能性的嵌合的人/小鼠CD8蛋白。在一个方面，所述小鼠不表达来自其内源性小鼠CD8基因座的功能性的内源性的小鼠CD8多肽。在一个实施方式中，所述第一核苷酸序列与内源性小鼠CD8α启动子和调控序列可操作地连接，和所述第二核苷酸序列与内源性小鼠CD8β启动子和调控序列可操作地连接。因此，在一个实施方式中，所述小鼠在CD4谱系的B细胞或T细胞上不表达嵌合的CD8蛋白。在一个实施方式中，所述嵌合的CD8α和/或β多肽的人源部分包含人CD8α和/或β多肽的免疫球蛋白V-样结构域。在一个实施方式中，所述嵌合的人/小鼠CD8α多肽的人源部分包含如SEQIDNO:59所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述嵌合的人/小鼠CD8β多肽的人源部分包含如SEQIDNO:58所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述嵌合的人/小鼠CD8α多肽如SEQIDNO:54所示，和所述嵌合的人/小鼠CD8β多肽如SEQIDNO:53所示。
在一个方面，包含本申请所述的嵌合的CD8α和/或β多肽的基因修饰的非人动物(例如基因修饰的小鼠)还包含人或人源化的MHCI蛋白，其中所述MHCI蛋白包含人MHCI多肽的胞外域。在一个方面，所述动物包含人源化的MHCI复合物。因此，所述动物可以包含人源化的MHCI蛋白和人或人源化的β2微球蛋白多肽。在一个实施方式中，所述动物是小鼠和所述小鼠在内源性MHCI基因座包含编码嵌合的人/小鼠MHCI多肽的核苷酸序列，其中所述MHCI多肽的人源部分包含人MHCI多肽的胞外域，和内源性小鼠MHCI多肽的跨膜和胞质结构域；和所述动物在内源性β2微球蛋白基因座还包含编码人或人源化的β2微球蛋白的核苷酸序列。对包含编码嵌合的人/非人(例如人/小鼠)MHCI和β2微球蛋白的核苷酸序列的基因修饰的非人动物(例如小鼠)更加详细的描述请参见美国专利申请号13/661,159和13/793,812，其通过引用整体并入本申请。在一个实施方式中，表达人源化的CD8、MHCI和/或β2微球蛋白的动物通过取代分别位于CD8、MHCI和/或β2微球蛋白基因座的内源性非人(例如小鼠)CD8、MHCI和/或β2微球蛋白基因的部分产生。
因此，本申请还提供了一种修饰非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠)的CD8基因座以表达嵌合的人/小鼠CD8多肽的方法，所述方法包括使用编码嵌合的人/小鼠CD8多肽的核苷酸序列取代在内源性CD8基因座的编码内源性非人(例如小鼠)CD8多肽的核苷酸序列。在一个方面，所述CD8多肽选自下组：CD8α、CD8β及其组合。在一个实施方式中，所述嵌合的人/非人(例如人/啮齿动物，例如人/小鼠)CD8多肽(CD8α和/或CD8β)包含全部或基本上全部的人CD8多肽的胞外域和内源性非人(例如啮齿动物，例如小鼠)CD8多肽的至少跨膜和胞质结构域。
本申请还提供了来源于本申请所述的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)的细胞，例如T细胞。本申请还提供了来源于本申请所述的非人动物的组织和胚胎。
除非另有明示或者从上下文中是显而易见的，本申请所述的任意实施方式和方面均可以用于彼此之间组合。通过对随后详细描述的回顾，其他实施方式对本领域技术人员将是显而易见的。下述的详细描述包括对本发明不同实施方式的示例性表述，其对所主张本发明不具有限制作用。附图构成本说明书的一部分，其与该描述一起，仅用于说明实施方式，并非用于限制本发明。
附图简述
图1是产生人源化CD4基因座策略的示意图(未按照比例)。首先，紧随信号肽之后的小鼠外显子3-6的序列被所述信号肽下游的人外显子3序列所取代(上图)，随后通过限制性消化/连接将人外显子4-6插入人外显子3下游。
图2显示了使用抗-人CD4和抗-小鼠CD4抗体对来源于WT小鼠或针对人CD4的小鼠杂合子(1766HET)的脾细胞进行的FACS分析(A)；和对来源于WT小鼠vs.1766HET小鼠vs.Jurkat人CD4T细胞系的T细胞进行的FACS分析。
图3是通过使用人CD8β外显子2-3取代小鼠CD8β外显子2-3产生人源化CD8b基因座(MAID1737)策略的示意图(未按照比例)。小鼠外显子序列以实心矩形表示，人外显子序列以散列矩形表示。
图4是通过使用人外显子2-3取代小鼠外显子1的一部分和外显子2，保留在外显子1起始的小鼠先导序列产生人源化CD8a基因座(MAID1738)策略的示意图(未按照比例)。小鼠外显子序列以实心矩形表示，人外显子序列以散列矩形表示。
图5是产生包含编码人源化的CD8b和CD8a基因序列的人源化基因座的顺序靶向策略的示意图(未按照比例)。小鼠外显子序列以实心矩形表示，人外显子序列以散列矩形表示。
图6是使用小鼠CD8b、小鼠CD8a、人CD8b或人CD8a抗体对来自于WT小鼠或已除去选择性表达盒的针对人CD8b和CD8a的杂合子小鼠(1739Het，1740Het)的脾细胞进行的FACS分析。
图7是使用小鼠CD8b、小鼠CD8a、人CD8b、人CD8a或CD4对来自于WT小鼠或1739HET/1740HET小鼠(针对CD8b和CD8a的杂合子小鼠)的胸腺细胞进行的FACS分析。
发明详述
定义
本发明提供了表达人源化的T细胞共受体多肽的基因修饰的非人动物(例如小鼠、大鼠、家兔等)；包含其的胚胎、细胞和组织；制备其的方法；以及使用其的方法。除非另有定义，本申请中使用的所有术语和短语包括所述术语和短语在现有技术中已有的含义，除非存在相反的明确指示或从该术语或短语使用的上下文中是显而易见的。
术语“保守的”当用于描述保守的氨基酸取代时，包括氨基酸残基被带有具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链R基团的其他氨基酸残基取代。可以通过修饰核苷酸序列实现保守的氨基酸取代，以引入编码保守的取代的核苷酸改变。在通常情况下，保守的氨基酸取代将基本上不改变目的蛋白的功能性性质，例如CD4或CD8分别与MHCII或MHCI结合的能力，并且增加TCR对MHC提呈的抗原的敏感性。带有具有相似化学性质的侧链的氨基酸基团的示例包括脂肪族侧链如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；脂肪族-羟基侧链如丝氨酸和苏氨酸；含有酰胺的侧链如天冬酰胺和谷氨酰胺；芳香侧链如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；碱性侧链如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性侧链如天冬氨酸和谷氨酸；以及含硫侧链如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守的氨基酸取代基团包括例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、赖氨酸/精氨酸、丙氨酸/缬氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些实施方式中，保守的氨基酸取代可以是使用丙氨酸取代蛋白中的任意天然残基，如用在例如丙氨酸扫描诱变中。在一些实施方式中，Gonnet等((1992)ExhaustiveMatchingoftheEntireProteinSequenceDatabase,Science256:1443-45)披露保守的氨基酸取代使得在PAM250log-似然性矩阵中具有正值，其通过引用并入本申请。在一些实施方式中，所述取代是适度保守的取代，其中所述取代在PAM250log-似然性矩阵中具有非负值。
因此，本发明还包括一种基因修饰的非人动物，其基因组包含(例如在内源性基因座)编码人源化的T细胞共受体多肽(例如CD4或CD8多肽)的核苷酸序列，其中所述多肽包含本申请所述的氨基酸序列的保守的氨基酸取代。
本领域技术人员将理解除了编码本申请所述的人源化的T细胞共受体多肽的核酸残基以外，由于遗传密码的简并性，其他核酸可以编码本发明的多肽。因此，除了在其基因组中包含编码具有保守的氨基酸取代的T细胞共受体多肽(例如CD4或CD8多肽)的核苷酸序列的基因修饰的非人动物以外，本申请还提供了由于遗传密码的简并性使其基因组中包含不同于本申请所述核苷酸序列的非人动物。
术语“同一性”当与序列结合使用时包括根据本领域公知的能够用于测定核苷酸和/或氨基酸序列同一性的多种不同算法确定的同一性。在本申请所述的一些实施方式中，使用开放缺口罚分为10.0，延伸缺口罚分为0.1的ClustalWv.1.83(slow)比对和使用Gonnet相似性矩阵(MacVectorTM10.0.2,MacVectorInc.,2008)确定同一性。针对序列的同一性比较序列的长度将取决于特定的序列。在不同实施方式中，通过从其N-末端至其C-末端比较成熟蛋白的序列确定其同一性。在不同实施方式中，当将嵌合的人/非人序列与人序列进行比较时，将所述嵌合的人/非人序列的人部分(而不是非人部分)用于进行针对确定人序列与嵌合的人/非人序列的人部分之间的同一性水平目的的比较(例如将嵌合人/小鼠蛋白的人胞外域与人蛋白的人胞外域进行比较)。
术语“同源性”或“同源的”涉及序列例如核苷酸或氨基酸序列时指两条序列根据最佳比对和比较例如至少约75％的核苷酸或氨基酸、例如至少约80％的核苷酸或氨基酸、例如至少约90-95％的核苷酸或氨基酸、例如超过97％的核苷酸或氨基酸是一致的。本领域技术人员将理解对于最佳基因靶向所述靶向构建体应含有与内源性DNA序列具有同源性的臂(“即同源臂”)；因此，同源重组可以发生在靶向构建体与被靶向的内源性序列之间。
术语“可操作地连接”指并列的，其中这样描述的所述组分与允许其以其意向的方式发挥功能相关。正因如此，编码蛋白的核酸序列可以与调控序列(例如，启动子、增强子、沉默子序列等)可操作地连接以保持正确的转录调控。此外，本发明的嵌合或人源化蛋白的不同部分可以可操作地连接以保持合适的折叠、加工、靶向、表达，以及所述蛋白在细胞中的其他功能性性质。除非另有说明，本发明的嵌合或人源化蛋白的不同结构域彼此之间可操作地连接。
术语“取代”涉及基因取代时指在内源性基因座放置外源性遗传物质，从而使用直系同源或同源的核酸序列取代全部或部分内源性基因。如下述实施例中所示，编码小鼠CD4或CD8(CD8α和/或CD8β)多肽部分的内源性基因座的核酸序列分别被编码人CD4或CD8(CD8α和/或CD8β)多肽部分的核苷酸序列所取代。
在本申请中使用的“功能性”例如涉及功能性多肽时指与天然蛋白相关的至少一种生物活性保留正常的多肽。例如，在本发明的一些实施方式中，在内源性基因座的取代(例如在内源性非人CD4或CD8基因座的取代)使得在基因座中不能表达功能性的内源性多肽。
本申请下文中描述的针对基因修饰的CD4非人动物的若干方面，例如动物类型；动物品系；细胞类型；筛选、检测和其他方法；使用方法等，将适用于基因工程改造的CD8动物。
基因修饰的CD4动物
在不同实施方式中，本发明通常地提供了基因修饰的非人动物，所述非人动物在其基因组例如在内源性CD4基因座中包含编码人源化的CD4多肽的核苷酸序列；因此所述动物表达人源化的CD4多肽。
人CD4基因位于12号染色体，认为其含有10个外显子。CD4基因编码具有氨基末端疏水性信号序列的蛋白，该信号序列由所述基因的外显子2和3所编码。所述蛋白包含4个免疫球蛋白样结构域，通常称为D1-D4结构域。Maddon等，(1987)StructureandexpressionofthehumanandmouseT4genes(人和小鼠T4基因的结构和表达),Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:9155-59。据信D1结构域由外显子3(信号肽的下游序列)和外显子4编码，而D2、D3和D4分别由彼此独立的外显子——外显子5、6和7编码。Littman(1987)TheStructureoftheCD4andCD8Genes(CD4和CD8基因的结构),Ann.Rev.Immunol.5:561-84；Hanna等，(1994)SpecificExpressionoftheHumanCD4GeneinMatureCD4+CD8-andImmatureCD4+CD8+TcellsandinMacrophagesofTransgenicMice(人CD4基因在转基因小鼠成熟的CD4+CD8-和未成熟的CD4+CD8+T细胞中和巨噬细胞中的特异性表达),Mol.Cell.Biol.14(2):1084-94；Maddon等，如上所述。在所述蛋白浓度较高的区域，如T细胞与抗原递呈细胞之间相接触的区域，分子趋向于通过反向D4结构域之间的相互作用形成同型二聚体。Zamoyska(1998)CD4andCD8:modulatorsofTcellreceptorrecognitionofantigenandofimmuneresponses？(CD4和CD8：T细胞受体识别抗原和免疫应答的调节剂？)Curr.Opin.Immunol.10:82-87；Wu等，(1997)DimericassociationandsegmentalvariabilityinthestructureofhumanCD4(在人CD4结构中的二聚结合和区段可变性),Nature387:527；Moldovan等，(2002)CD4DimersConstitutetheFunctionalComponentRequiredforTCellActivation(CD4二聚体构成T细胞活化所需的功能性成分),J.Immunol.169:6261-68.
CD4的D1结构域类似于免疫球蛋白的可变(V)结构域，其与D2结构域的一部分一起据信与MHCII结合。Huang等，(1997)AnalysisofthecontactsitesontheCD4MoleculewithClassIIMHCMolecule(对CD4分子与II类MHC分子上的接触位点的分子),J.Immunol.158:216-25。反过来，MHCII与T细胞共受体CD4在MHCIIα2和β2结构域之间连接的疏水性裂隙上发生相互作用。Wang和Reinherz(2002)StructuralBasisofTCellRecognitionofPeptidesBoundtoMHCMolecules(肽与MHC分子结合的T细胞识别的结构基础),MolecularImmunology,38:1039-49。
CD4共受体的D3和D4结构域据信与TCR-CD3复合物相互作用，当这两个结构域被取代时，CD4不能与TCR结合。Vignali等，(1996)TheTwoMembraneProximalDomainsofCD4InteractwiththeTCellReceptor(CD4与T细胞受体相互作用的两个膜近端结构域),J.Exp.Med.183:2097-2107。CD4分子以二聚体的形式存在，在该分子D4结构域中的残基据信负责CD4的二聚化。Moldovan等，(2002)CD4DimersConstitutetheFunctionalComponentsRequiredforTCellActivation(CD4二聚体构成T细胞活化所需的功能性成分),J.Immunol.169:6261-68。
CD4基因的外显子8编码跨膜结构域，而该基因其余的部分编码胞质结构域。CD4的胞质结构域具有多种独特的功能。例如，CD4的胞质结构域募集酪氨酸激酶Lck。Lck是Src家族激酶，其与CD4和CD8胞质结构域结合并且所述共受体和TCR同时与相同的MHC结合导致CD3和TCR复合物ξ链酪氨酸磷酸化的增加，其反过来会导致在T细胞活化中具有作用的其他因子的募集。Itano及其同事通过设计和检测包含CD8胞外域和CD4胞质尾的杂交蛋白在转基因小鼠中的表达提出CD4的胞质尾也能够促进CD4+CD8+T细胞分化成CD4+谱系。Itano等，(1996)TheCytoplasmicDomainofCD4PromotestheDevelopmentofCD4LineageTCells(CD4的胞质结构域促进CD4谱系T细胞的发育),J.Exp.Med.183:731-41。所述杂交蛋白的表达导致MHCI特异性CD4谱系T细胞的发育。同上。
CD4共受体似乎是HIV病毒的主要受体，而CD4+T细胞耗竭是疾病进展的指示剂。CD4的胞质尾似乎是在HIV诱导的凋亡中将凋亡信号传送至CD4+T细胞所必需的。特别地，CD4与Lck之间的相互作用显示出在这些细胞中加强HIV诱导的凋亡。Corbeil等，(1996)HIV-inducedApoptosisRequirestheCD4ReceptorCytoplasmicTailandIsAcceleratedbyInteractionofCD4withp56lck(HIV诱导的凋亡需要CD4受体胞质尾并且其被CD4与p56lck之间的相互作用所加速),J.Exp.Med.183:39-48。
T细胞在胸腺中的发育过程为从不成熟的CD4-/CD8-(双重阴性或DN)胸腺细胞变成CD4+/CD8+(双重阳性或DP)胸腺细胞，其最终经历阳性选择成为CD4+或CD8+(单一阳性或SP)T细胞。通过MHCI限制性TCR接收信号的DP胸腺细胞分化成CD8+T细胞，而通过MHCII限制性TCR接收信号的DP胸腺细胞分化成CD4+T细胞。被DP细胞所接收而导致其分化成CD4+或CD8+T细胞的信号已成为研究非常广泛的主题。已提出了针对CD4/CD8谱系选择的多种模型，Singer等，(2008)Lineagefateandintensedebate:myths,modelsandmechanismsofCD4-versusCD8-lineagechoice(谱系命运和激烈的争论：CD4-对比CD8-谱系选择的猜测、模型和机制),Nat.Rev.Immunol.8:788-801.对其进行了综述。
阳性选择导致的特定T细胞共受体的失活是转录调控的产物。对于CD4而言，已发现其增强子位于CD4外显子1上游13kb处，其在CD4+和CD8+T细胞中上调CD4的表达。Killeen等，(1993)RegulatedexpressionofhumanCD4rescueshelperTcelldevelopmentinmicelackingexpressionofendogenousCD4,(人CD4受调控的表达在缺乏内源性CD4表达的小鼠中挽救辅助T细胞的发育)EMBOJ.12:1547-53。位于鼠源性CD4基因的第一内含子中的顺式作用转录沉默子的功能为在CD4+T细胞以外的细胞中沉默CD4的表达。Siu等，(1994)AtranscriptionalsilencercontrolthedevelopmentalexpressionoftheCD4gene(转录沉默子控制CD4基因的发育表达),EMBOJ.13:3570-3579。
由于在此前研发的表达人CD4的转基因小鼠的若干品系中控制CD4品系选择的重要转录调节子(例如，启动子、增强子、沉默子等)缺失，使得这些小鼠不能进行正常的T细胞谱系发育，并且产生表达CD4的CD4+T细胞以外的免疫细胞。参见例如，Law等，(1994)HumanCD4RestoresNormalTCellDevelopmentandFunctioninMiceDeficientinCD4(人CD4使得CD4缺陷小鼠恢复正常的T细胞发育和功能),J.Exp.Med.179:1233-42(在CD8+T细胞和B细胞中表达CD4)；Fugger等，(1994)ExpressionofHLA-DR4andhumanCD4transgenesinmicedeterminesthevariableregionβ-chainT-cellrepertoireandmediatesanHLA-D-restrictedimmuneresponse(HLA-DR4和人CD4转基因在小鼠中的表达决定可变区β-链T-细胞库和介导HLA-D-受限制的免疫应答),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:6151-55(CD4在所有CD3+淋巴细胞和B细胞上表达)。因此，在一个实施方式中，开发一种基因修饰的动物使其保留内源性小鼠启动子和其他调控元件以使得所述动物产生能够经历正常的T细胞发育和谱系选择的T细胞可能是有益的。
因此，在不同实施方式中，本发明提供了一种基因修饰的非人动物，所述非人动物例如在其内源性T细胞共受体基因座(例如CD4基因座)包含编码嵌合的人/非人T细胞共受体多肽的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述嵌合多肽的人部分包含全部或基本上全部的人T细胞共受体胞外域。在一个实施方式中，所述嵌合多肽的非人部分包含非人T细胞共受体的跨膜和胞质结构域。在一个实施方式中，所述非人动物表达功能性的嵌合的T细胞共受体多肽。因此，在一个方面，本发明提供了一种基因修饰的非人动物，所述非人动物在其内源性CD4基因座包含编码嵌合的人/非人CD4多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人部分包含全部或基本上全部的人CD4的胞外域，其中非人部分至少包含非人CD4的跨膜和胞质结构域，和其中所述动物表达功能性的嵌合的CD4多肽。在一个方面，所述非人动物仅表达人源化的CD4多肽，即嵌合的人/非人CD4多肽，并且不表达来自其内源性CD4基因座的功能性的内源性非人CD4蛋白。
在一个实施方式中，所述嵌合的人/非人CD4多肽的人部分包含全部或基本上全部的人CD4多肽的胞外域。在另一个实施方式中，所述嵌合的人/非人CD4多肽至少包含全部或基本上全部的所述人CD4多肽的MHCII结合结构域(例如D1和D2结构域的大部分)；在一个实施方式中，所述嵌合的人/非人CD4多肽的人部分包含全部或基本上全部的所述人CD4多肽的D1、D2和D3结构域；在又一个实施方式中，所述嵌合的人/非人CD4多肽的人部分包含全部或基本上全部的CD4免疫球蛋白样结构域，例如称为D1、D2、D3和D4的结构域。在又一个实施方式中，所述嵌合的人/非人CD4多肽的人部分在其人部分中包含全部或基本上全部的负责与MHCII和/或T细胞受体的胞外部分相互作用的人CD4序列。在又一个实施方式中，所述嵌合的人/非人CD4多肽的人部分包含全部或基本上全部的负责与MHCII和/或T细胞受体的可变结构域相互作用的人CD4的胞外部分。因此，在一个实施方式中，编码所述嵌合的CD4多肽的人部分的核苷酸序列包含全部或基本上全部的人CD4结构域D1-D2的编码序列(例如，人CD4基因外显子3的一部分和外显子4-5)；在另一个实施方式中，其包含全部或基本上全部的人CD4D1-D3的编码序列(例如，人CD4外显子3的一部分和外显子4-6)。因此，在一个实施方式中，编码嵌合的人/非人CD4的核苷酸序列包含编码全部或基本上全部人CD4的D1-D3结构域的核苷酸序列。在另一个实施方式中，编码所述嵌合的CD4多肽的人部分的核苷酸序列包含人CD4基因的D1-D4结构域的编码序列。在另一个实施方式中，所述核苷酸序列可以包含编码小鼠CD4信号肽的核苷酸序列，例如由小鼠基因的外显子2-3的部分编码的区域。在另一个实施方式中，所述核苷酸序列可以包含编码人CD4信号肽的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述嵌合的人/非人CD4多肽包含如SEQIDNO:4所示的氨基酸序列，和所述嵌合多肽的人部分大致跨SEQIDNO:4的氨基酸27-319(其单独以SEQIDNO:57表示)。
在一个实施方式中，所述非人动物表达嵌合的人/非人CD4多肽序列。在一个实施方式中，所述嵌合的CD4序列的人部分包含一个或多个保守的或非保守的修饰。
在一个方面，本申请提供了一种表达人CD4序列的非人动物，其中所述人CD4序列与人CD4序列具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一个特定实施方式中，所述人CD4序列与实施例中描述的人CD4序列具有至少约90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一个实施方式中，所述人CD4序列包含一个或多个保守的取代。在一个实施方式中，所述人CD4序列包含一个或多个非保守的取代。
在一些实施方式中，一部分例如所述嵌合CD4的人部分可以包含基本上全部的本申请所示的序列(例如，基本上全部的本申请所示的蛋白结构域)。基本上全部序列通常包括据信代表所述蛋白特定部分(例如特定功能性结构域等)的85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸。本领域技术人员将理解可以根据所使用的比对和结构域预测方法对功能性结构域的边界进行微小改变。
在一个方面，所述嵌合的人/非人CD4多肽的非人部分至少包含所述非人CD4多肽的跨膜和胞质结构域。由于CD4胞质结构域具有重要的功能，因此在基因工程改造的动物中保留内源性非人(例如小鼠)序列确保保持共受体具有适当的细胞内信号和其他功能。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠，和所述非人CD4多肽是小鼠CD4多肽。尽管在实施例中描述了特定的小鼠CD4序列，但是来源于其的任意适宜序列例如包含保守的/非保守的氨基酸取代的序列均包括在本申请中。在一个实施方式中，所述嵌合的CD4共受体的非人部分包含未被人源化的内源性CD4的任意序列。
本申请所述的非人动物在其内源性基因座中可以包含编码嵌合的人/非人CD4多肽的核苷酸序列。在一个方面，其导致内源性CD4基因的一部分被编码人CD4多肽一部分的核苷酸序列取代。在一个实施方式中，此类取代是编码例如全部或基本上全部的非人CD4的胞外域的内源性核苷酸序列，例如编码至少全部或基本上全部的非人CD4的第一免疫球蛋白样结构域(即D1)的序列(例如编码全部或基本上全部的非人CD4的结构域D1-D2的序列，例如编码全部或基本上全部的非人CD4的结构域D1-D3的序列，编码全部或基本上全部的非人CD4的结构域D1-D4的序列)被编码其的人核苷酸序列取代。在一个实施方式中，所述取代产生包含负责与MHCII和/或T细胞受体胞外部分相互作用的人CD4序列的嵌合蛋白。在又一个实施方式中，所述取代产生包含负责与MHC和/或T细胞受体的可变结构域相互作用的人CD4序列的嵌合蛋白。在一个实施方式中，所述取代不包含编码非人CD多肽的至少跨膜和胞质结构域的CD4序列的取代。因此，在一个方面，所述非人动物表达来自内源性非人CD4基因座的嵌合的人/非人CD4多肽。在又一个实施方式中，所述取代产生包含如SEQIDNO:4所示的多肽序列的蛋白。
在一个实施方式中，本申请提供了本申请所述的嵌合的人/非人CD4基因座(例如嵌合的人/啮齿动物CD4基因座，例如嵌合的人/小鼠CD4基因座)的核苷酸序列。在一个方面，由于所述嵌合的人/非人(例如人/啮齿动物，例如人/小鼠)CD4序列被置于内源性非人(例如啮齿动物，例如小鼠)CD4基因座，因此其保留了位于第一个CD4外显子上游的CD4增强子元件。在一个实施方式中，在内源性非人(例如啮齿动物，例如小鼠)CD4基因座的所述取代包含例如编码CD4多肽D1外显子3的一部分以及D1其余部分和D2-D3的外显子4-6的取代；因此，在一个方面，所述嵌合的CD4基因座保留了位于所述非人(例如小鼠)CD4基因内含子1中的顺式作用沉默子。因此，在一个实施方式中，所述嵌合的基因座保留了内源性非人(例如啮齿动物，例如小鼠)CD4启动子和调控元件。在另一个实施方式中，所述嵌合的基因座可以包含人启动子和调控元件的程度为使得适当地实现CD4表达、CD4+T细胞发育、CD4谱系选择和共受体发挥功能。因此，在一些方面，本发明的动物包含不改变正确的谱系选择和T细胞发育的基因修饰。在一个方面，本发明的动物(例如啮齿动物，例如小鼠)在正常表达CD4的细胞以外的免疫细胞上不表达嵌合的CD4多肽。在一个方面，动物在B细胞或CD8+SPT细胞上不表达CD4。在一个实施方式中，所述取代保留了能够适当地在空间和时间上调控CD4表达的元件。
本发明基因修饰的非人动物可以选自下组：小鼠、大鼠、家兔、猪、牛(例如奶牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类动物(例如狨猴、猕猴)。对于不易于获得适宜的基因修饰的ES细胞的非人动物而言，可以使用其他方法制备包含基因修饰的非人动物。这类方法包括例如修饰非ES细胞基因组(例如成纤维细胞或诱导多能干细胞)以及使用核转移以便将经修饰的基因组转移至适宜细胞例如卵母细胞，并且在适宜条件下在非人动物中使经修饰的细胞(例如经修饰的卵细胞)妊娠以形成胚胎。
在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL品系的小鼠。在另一个实施方式中，所述小鼠是选自由以下品系构成的组的129品系：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见例如Festing等(1999)Revisednomenclatureforstrain129mice(对129小鼠品系修订的命名法)，MammalianGenome10:836，亦参见Auerbach等(2000)EstablishmentandChimeraAnalysisof129/SvEv-andC57BL/6-DerivedMouseEmbryonicStemCellLines(129/SvEv-和C57BL/6-来源的小鼠胚胎干细胞系的建立和嵌合体分析))。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的小鼠是前述129品系和前述C57BL/6品系的混合。在另一个特定实施方式中，所述小鼠是前述129品系的混合或前述BL/6品系的混合。在一个特定实施方式中，所述混合的129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在另一个实施方式中，所述小鼠是BALB品系，例如BALB/c品系。在又另一个实施方式中，所述小鼠是BALB品系和另一个前述品系的混合。
在一个实施方式中，所述非人动物是大鼠。在一个实施方式中，所述大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、SpragueDawley品系、Fischer品系、F344、F6和黑刺鼠。在一个实施方式中，所述大鼠品系是两种或多种选自下组的品系的混合：Wistar、LEA、SpragueDawley、Fischer、F344、F6和黑刺鼠。
因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠在其基因组例如在其内源性CD4基因座中包含编码嵌合的人/小鼠CD4多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的小鼠部分包含小鼠CD4多肽的至少跨膜和胞质结构域，和其中所述小鼠表达嵌合的人/小鼠CD4。在一个实施方式中，所述嵌合多肽的人部分至少包含全部或基本上全部的人CD4多肽的胞外域。在一个实施方式中，所述嵌合多肽的人部分至少包含全部或基本上全部的人CD4蛋白的D1结构域。在一个实施方式中，所述嵌合多肽的人部分至少包含全部或基本上全部的人CD4蛋白的D1-D2结构域，例如至少全部或基本上全部的人CD4蛋白的D1-D3结构域，例如全部或基本上全部的人CD4蛋白的D1-D4结构域。因此，在一个实施方式中，所述小鼠在其内源性CD4基因座包含至少含有全部或基本上全部的人CD4基因的外显子4、5和6的核苷酸序列，例如编码人CD4D1结构域的一部分的人CD4基因的外显子3和人CD4基因的外显子4-6的序列。在一个实施方式中，所述小鼠在内源性CD4基因座包含嵌合的人/小鼠CD4，其包含负责与MHCII和/或T细胞受体的胞外部分相互作用的人CD4序列。在另一个实施方式中，所述小鼠在内源性CD4基因座包含嵌合的人/小鼠CD4，其包含负责与MHCII和/或T细胞受体的可变结构域相互作用的人CD4序列。在一个实施方式中，所述核苷酸序列包含编码小鼠CD4信号肽的序列。在一个实施方式中，所述小鼠包含编码小鼠CD4胞外域的核苷酸序列被编码人CD4胞外域的核苷酸序列的取代。在另一个实施方式中，所述小鼠包含编码至少全部或基本上全部的小鼠CD4D1结构域，例如编码至少全部或基本上全部的小鼠CD4D1-D2结构域的核苷酸序列，例如编码至少全部或基本上全部的小鼠CD4D1-D3结构域的核苷酸序列，被编码其的人核苷酸序列的取代。在一个实施方式中，所述小鼠不表达来自其内源性小鼠CD4基因座的功能性内源性小鼠CD4。在一个实施方式中，本申请所述的小鼠在小鼠种系中包含嵌合的人/小鼠CD4核苷酸序列。在一个实施方式中，所述小鼠保留了未被人源化的任意内源性序列，例如在所述实施方式中其中所述小鼠包含编码全部或基本上全部D1-D3结构域的核苷酸序列的取代，所述小鼠保留了编码小鼠CD4D4结构域的内源性核苷酸序列和编码小鼠CD4跨膜和胞质结构域的核苷酸序列。
在一个方面，表达嵌合的人/小鼠CD4蛋白的小鼠保留了小鼠CD4启动子和调控序列，例如在小鼠中编码与内源性小鼠CD4启动子和调控序列可操作地连接的嵌合的人/小鼠CD4的核苷酸序列。在一个方面，在本发明的基因工程改造的动物中保留的这些小鼠调控序列包括调控所述嵌合蛋白在T细胞发育的适当阶段表达的序列。因此，在一个方面，所述小鼠在CD8谱系的B细胞或T细胞上不表达嵌合的CD4。在一个方面，所述小鼠还在任意细胞类型上均不表达嵌合的CD4，例如任意的免疫细胞类型，其正常情况下不表达内源性CD4。
在不同实施方式中，如本申请所述的表达来自嵌合的CD4基因座的功能性嵌合的CD4蛋白的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)在细胞表面上展示了嵌合蛋白，例如T细胞表面。在一个实施方式中，所述非人动物在细胞表面上表达的嵌合的CD4蛋白的细胞分布与在人中观察到的一致。在一个方面，本发明的CD4蛋白能够与在另一种细胞的表面上表达的MHCII蛋白相互作用，例如抗原提呈细胞(APC)。
在一个实施方式中，本发明的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠)还包含编码人或人源化MHCII蛋白的核苷酸序列，这样在所述动物的T细胞表面上表达的所述嵌合的CD4蛋白能够与在另一种细胞(例如抗原递呈细胞)表面上表达的人或人源化的MHCII相互作用。在一个实施方式中，所述MHCII蛋白包含人MHCIIα多肽的胞外域和人MHCIIβ多肽的胞外域。在2012年10月26日提交的美国专利申请号13/661,116和2013年3月11日提交的美国专利申请号13/793,935中描述了示例性的表达人或人源化的MHCII多肽的基因修饰的动物，其通过引用整体并入本申请。因此，在一个实施方式中，包含本申请所述的嵌合的CD4蛋白的动物还可以包含人源化的MHCII蛋白，其中所述人源化的MHCII蛋白包含：(1)包含人MHCIIα的胞外域以及内源性(例如小鼠)MHCII的跨膜和胞质结构域的人源化的MHCIIα多肽，其中所述人MHCIIα胞外域包含人MHCIIα的α1和α2结构域和(2)包含人MHCIIβ的胞外域以及内源性(例如小鼠)MHCII的跨膜和胞质结构域的人源化的MHCIIβ多肽，其中所述人MHCIIβ胞外域包含人MHCIIβ的β1和β2结构域。在一个方面，人源化的MHCIIα和β多肽均分别由位于内源性MHCIIα和β基因座的核苷酸序列所编码；在一个方面，所述动物不表达功能性的内源性MHCIIα和β多肽。因此，所述动物表达的MHCII可以是嵌合的人/非人，例如人/啮齿动物(例如人/小鼠)MHCII蛋白。所述嵌合的MHCII蛋白的人部分可以来源于选自下组的人II类HLA蛋白：HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP，例如HLA-DR4、HLA-DR2、HLA-DQ2.5、HLA-DQ8，或者在人类群体中的任意其他的II类HLA分子。在所述实施方式中，其中所述动物是小鼠，所述嵌合的MHCII多肽的非人(即小鼠)部分可以来源于选自H-2E和H-2A的小鼠MHCII蛋白。在一个方面，包含嵌合的人/非人CD4和美国专利申请号13/661,116和13/793,935中所述的人源化的MHCII的所述非人动物可以通过将包含如本申请所述的嵌合CD4基因座的动物与包含人源化MHCII基因座的动物繁殖产生。所述动物还可以通过将编码嵌合的CD4(例如在内源性CD4基因座取代)的核苷酸序列引入包含人源化的MHCII基因座的动物的ES细胞中；或者将编码人源化的MHCII的核苷酸序列引入包含嵌合CD4基因座的动物的ES细胞中产生。
在一个实施方式中，包含嵌合的人/非-人CD4和人或人源化的MHCII的所述基因修饰的非人动物(例如小鼠)可以包含一个或两个拷贝的编码这些蛋白的基因；因此，针对编码嵌合的CD4和MHCII(即，MHCIIα和/或MHCIIβ)的基因可以分别是杂合子或纯合子。
除了基因工程改造的非人动物以外，本申请还提供了非人胚胎(例如内齿动物，例如小鼠或大鼠胚胎)，其中所述胚胎包含来源于如本申请所述的非人动物(例如，啮齿动物，例如小鼠或大鼠)的供体ES细胞。在一个方面，所述胚胎包含含有所述嵌合的CD4基因的ES供体细胞和宿主胚胎细胞。
本申请提供了一种组织，其中所述组织来源于如本申请所述的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)，并且表达所述嵌合的CD4蛋白。
此外，本申请提供了来源于如本申请所述的非人动物的非人细胞。在一个实施方式中，所述细胞是ES细胞。在一个实施方式中，所述细胞是T细胞，例如CD4+T细胞。在一个实施方式中，所述细胞是辅助T细胞(TH细胞)。在一个实施方式中，所述TH细胞是效应器TH细胞，例如TH1细胞或TH2细胞。
本申请提供了一种非人细胞，所述非人细胞包含如本申请所述的非人动物的染色体或其片段。在一个实施方式中，所述非人动物细胞包含如本申请所述的非人动物的细胞核。在一个实施方式中，所述非人细胞包含核转移得到的染色体或其片段。
在一个方面，本申请提供了一种非人的诱导多能细胞，所述干细胞包含编码如本申请所述的嵌合的CD4多肽的基因。在一个实施方式中，所述诱导多能细胞来源于如本申请所述的非人动物。
在一个方面，本申请提供了一种杂交瘤或四价体瘤，其来源于如本申请所述的非人动物细胞。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠或大鼠。
在一个方面，本申请提供了一种体外制备物，所述体外制备物包含在其表面携带嵌合CD4蛋白的T细胞和与所述嵌合CD4结合的另一种细胞。在一个实施方式中，所述另一种细胞是表达MHCII多肽(例如嵌合的人/非人MHCII蛋白)的细胞(例如APC)。在一个实施方式中，在第一种细胞表面上的嵌合的CD4与在第二种细胞表面上的嵌合的MHCII相互作用。在一个实施方式中，所述嵌合的CD4蛋白保留了与内源性胞质分子的相互作用，例如内源性胞质信号分子(例如内源性Lck等)。
本申请还提供了一种用于制备本申请所述的基因工程改造的非人动物(例如基因工程改造的啮齿动物，例如小鼠或大鼠)的方法。在一个实施方式中，用于制备基因工程改造的非人动物的方法使得所述动物在内源性CD4基因座包含编码嵌合的人/非人CD4多肽的核苷酸序列。在一些实施方式中，如在实施例中描述的，所述方法利用使用技术制备的靶向构建体，将所述构建体引入ES细胞，并使用技术将经靶向的ES细胞克隆引入小鼠的胚胎中。
在一个实施方式中，本发明包括修饰非人动物的CD4基因座以表达本申请所述的嵌合的人/非人CD4多肽的方法。在一个实施方式中，本发明提供了一种修饰小鼠的CD4基因座以表达嵌合的人/小鼠CD4多肽的方法，所述方法包括使用编码嵌合的人/小鼠CD4多肽的核苷酸序列在小鼠的内源性CD4基因座取代编码内源性小鼠CD4多肽的核苷酸序列。在所述方法的一个方面，所述嵌合的人/小鼠CD4多肽包含全部或基本上全部的人CD4多肽的胞外域和内源性小鼠CD4多肽的至少跨膜和胞质结构域。在所述方法的另一个方面，所述嵌合的人/小鼠CD4多肽包含全部或基本上全部的人CD4多肽的D1-D2结构域。在又一个实施方式中，所述嵌合的人/小鼠CD4多肽包含全部或基本上全部的人CD4多肽的D1-D3结构域。在又一个实施方式中，所述嵌合的人/小鼠CD4多肽包含全部或基本上全部的负责与MHCII和/或T细胞受体的胞外域相互作用的人CD4的氨基酸序列。在又一个实施方式中，所述嵌合的人/小鼠CD4多肽包含全部或基本上全部的负责与MHCII和/或T细胞受体的可变结构域相互作用的人CD4的氨基酸序列。
因此，本申请还提供了用于产生本申请所述的基因修饰动物的核苷酸构建体。在一个方面，所述核苷酸序列包含5’和3’同源臂、包含人CD4基因序列的DNA片段(例如人CD4胞外域基因序列，例如全部或基本上全部的人CD4的结构域D1-D2的基因序列，例如全部或基本上全部的人CD4的结构域D1-D3和/或D2-D3的基因序列，例如全部或基本上全部的人CD4的结构域D1-D4的基因序列)和翼侧为重组位点的选择性表达盒。在一个实施方式中，人CD4基因序列是包含人CD4的内含子和外显子的基因组序列。在一个实施方式中，同源臂与非人(例如小鼠)CD4基因组序列是同源的。本发明的示例性构建体如图1中的下图所示。
选择性表达盒是插入靶向构建体以便于选择具有已整合了目标构建体的细胞(例如ES细胞)的核苷酸序列。许多适宜的选择性表达盒是本领域公知的。通常，在存在特定抗生素(例如Neo、Hyg、Pur、CM、SPEC等)的情况下能够对选择性表达盒进行阳性选择。此外，选择性表达盒的翼侧可以是重组位点，其能够使所述选择性表达盒在经过重组酶处理后缺失。通常使用的重组位点是loxP和Frt，其分别被Cre和Flp酶所识别，但是，其他的也是本领域公知的。选择性表达盒可以位于构建体编码区以外的任意位置。在一个实施方式中，所述选择性表达盒位于人CD4序列的外显子3和外显子4之间。
在完成基因靶向后，对ES细胞或基因修饰的非人动物进行筛选以确证目标外源性核苷酸序列的成功掺入或外源性多肽的表达。多种技术是本领域技术人员公知的，并且包括(但不限于)Southern印迹、长PCR、定量PCR(例如使用的实时PCR)、荧光原位杂交、Northern印迹、流式细胞术、Western分析、免疫细胞化学、免疫组织化学等。在一个例子中，可以通过使用Valenzuela等，(2003)High-throughputengineeringofthemousegenomecoupledwithhigh-resolutionexpressionanalysis(与高分辨率表达分析偶联的小鼠基因组的高通量工程改造),NatureBiotech.21(6):652-659描述的改良的等位基因测定对小鼠等位基因的丢失和/或人等位基因的获得情况进行筛选对携带目标基因修饰的非人动物(例如小鼠)进行鉴定。鉴定基因修饰动物中的特定核苷酸或氨基酸序列的其他测定是本领域技术人员公知的。
在一个方面，本申请提供了一种制备嵌合的人/或非人CD4分子的方法，所述方法包括由如本申请所述的核苷酸构建体在单一细胞中表达嵌合的CD4蛋白。在一个实施方式中，所述核苷酸构建体是病毒载体；在一个特定的实施方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一个实施方式中，所述细胞选自CHO、COS、293、HeLa、以及表达病毒核酸序列的视网膜细胞(例如PERC.6TM细胞)。
在一个方面，本申请提供了表达嵌合的CD4蛋白的细胞。在一个实施方式中，所述细胞包含含有如本申请所述的嵌合的CD4序列的表达载体。在一个实施方式中，所述细胞选自CHO、COS、293、HeLa、以及表达病毒核酸序列的视网膜细胞(例如PERC.6TM细胞)。
本申请还提供了由本申请所述的非人动物制备的嵌合的CD4分子，其中，在一个实施方式中，所述嵌合的CD4分子包含全部或基本上全部的人CD4蛋白的胞外域的氨基酸序列，以及非人CD4蛋白(例如小鼠CD4蛋白)的至少跨膜和胞质结构域的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本申请提供了由本申请所述的非人动物制备的嵌合的CD4分子，其中所述嵌合的CD4分子包含至少全部或基本上全部的人CD4的D1结构域的氨基酸序列，例如至少全部或基本上全部的人CD4的D1-D2结构域，例如至少全部或基本上全部的人CD4的D1-D3结构域，例如负责与MHCII和/或TCR的胞外域结合的人CD4的氨基酸序列，例如负责与MHCII和/或TCR的可变结构域结合的人CD4的氨基酸序列；和其中所述蛋白其余部分(例如跨膜结构域、胞质结构域和未被人源化的胞外域的任意部分)来源于内源性的非人蛋白序列。
本申请上文描述的涉及表达嵌合的CD4蛋白的动物，以及包含其的细胞和组织的不同实施方式可以应用于描述表达本申请下文所述的嵌合的人/非人CD8的非人动物，以及表达其他重要嵌合的人/非人T细胞共受体的动物的实施方式。
基因修饰的CD8动物
在不同实施方式中，本发明通常提供了基因修饰的非人动物，所述非人动物在其基因组(例如内源性CD8基因座)中包含编码人源化的CD8多肽的核苷酸序列；因此，所述动物表达人源化的CD8多肽。在不同实施方式中，本发明提供了非人动物，所述非人动物在其基因组(例如内源性CD8基因座)中包含编码人源化的CD8α多肽的核苷酸序列和/或编码人源化的CD8β多肽的核苷酸序列。因此，本发明的基因修饰的非人动物表达人源化的CD8α和/或人源化的CD8β多肽。
人CD8蛋白通常以两种多肽CD8α和CD8β的异源二聚体的形式在细胞表面表达，但是也检测到了二硫键连接的同源二聚体和同源多聚体(例如在NK细胞和肠γδT细胞中，其表达CD8αα)。编码人CD8α和CD8β的基因位于2号染色体上彼此接近的位置。Nakayama等，(1992)RecentDuplicationoftheTwoHumanCD8β-chaingenes(两个人CD8β-链基因的最新复制),J.Immunol.148:1919-27。CD8α蛋白含有先导肽、免疫球蛋白V-样区、铰链区、跨膜结构域和胞质尾。Norment等，(1989)AlternativelySplicedmRNAEncodesaSecretedFormofHumanCD8α(替代性剪接mRNA编码分泌形式的人CD8α)CharacterizationoftheHumanCD8αgene(人CD8α基因的表征),J.Immunol.142:3312-19。CD8α基因外显子/内含子的示意性描述参见图4和5。
人CD8β基因位于2号染色体上CD8α基因的上游。已报道了通过CD8β的替代性剪接产生的多种亚型，其中一种亚型预计缺乏跨膜结构域并且产生分泌蛋白。Norment等，(1988)AsecondsubunitofCD8isexpressedinhumanTcells(在人T细胞中表达CD8的另一种亚基),EMBOJ.7:3433-39。CD8β基因外显子/内含子的示意性描述参见图3和5。
膜结合的CD8β蛋白含有N-末端信号序列，随后是免疫球蛋白V-样结构域、短的胞外铰链区、跨膜结构域和胞质尾。参见，Littman(1987)ThestructureoftheCD4andCD8genes(CD4和CD8基因的结构),AnnRev.Immunol.5:561-84。铰链区是广泛的糖基化位点，认为该区域维持了其构象并且保护所述蛋白免于被蛋白酶裂解。Leahy(1995)AstructuralviewofCD4andCD8(CD4和CD8的结构综述),FASEBJ.9:17-25.
CD8通常在细胞毒性T细胞上表达，并且与MHCI分子相互作用。所述相互作用由CD8与MHCI的α3结构域的结合所介导。尽管I类MHC与CD8的结合比TCR与I类MHC的结合弱约100倍，但是CD8结合增强了TCR结合的亲和性。Wooldridge等，(2010)MHCClassIMoleculeswithSuperenhancedCD8BindingPropertiesBypasstheRequirementforCognateTCRRecognitionandNonspecificallyActivateCTLs(具有超强提升的CD8结合性质的I类MHC分子绕开对同源性TCR识别的需求并且非特异性活化CTL),J.Immunol.184:3357-3366。
CD8与I类MHC分子的结合具有物种特异性；CD8、Lyt-2的小鼠同源物显示出在α3结构域与H-2Dd分子的结合，但是其不与HLA-A分子结合。Connolly等，(1988)TheLyt-2MoleculeRecognizesResiduesintheClassIα3DomaininAllogeneicCytotoxicTCellResponses(在同种异体细胞毒性T细胞应答中Lyt-2分子识别I类α3结构域中的残基),J.Exp.Med.168:325-341。据推测差异性结合是由于CD8上的CDR-样决定簇(CDR1-和CDR2-样)在人和小鼠之间不是保守的导致的。Sanders等，(1991)MutationsinCD8thatAffectInteractionswithHLAClassIandMonoclonalAnti-CD8Antibodies(在CD8中影响I类HLA与单克隆抗-CD8抗体相互作用的突变),J.Exp.Med.174:371-379；Vitiello等，(1991)AnalysisoftheHLA-restrictedInfluenza-specificCytotoxicTLymphocyteResponseinTransgenicMiceCarryingaChimericHuman-MouseClassIMajorHistocompatibilityComplex(在携带嵌合的人-小鼠I类主要组织相容性复合物的转基因小鼠中对HLA-限制性流感特异性细胞毒性T淋巴细胞应答的分析),J.Exp.Med.173:1007-1015；和Gao等，(1997)CrystalstructureofthecomplexbetweenhumanCD8ααandHLA-A2(人CD8αα和HLA-A2之间复合物的晶体结构),Nature387:630-634。已报道CD8在α3结构域的保守区(在位置223-229)与HLA-A2结合。在HLA-A中的单取代(V245A)降低了CD8与HLA-A的结合，同时伴随了大大减少的T细胞介导的裂解。Salter等，(1989),Polymorphismintheα3domainofHLA-AmoleculesaffectsbindingtoCD8(HLA-A分子在α3结构域中的多态性影响其与CD8的结合),Nature338:345-348。在通常情况下，HLA-A分子在α3结构域中的多态性还影响其与CD8的结合，Id。在小鼠中，在H-2Dd的残基227中的氨基酸取代影响小鼠Lyt-2与H-2Dd的结合，并且转染突变的H-2Dd的细胞不会被CD8+T细胞所裂解。Potter等，(1989)Substitutionatresidue227ofH-2classImoleculesabrogatesrecognitionbyCD8-dependent,butnotCD8-independent,cytotoxicTlymphocytes(在I类H-2分子残基227的取代消除CD8依赖性识别，但不影响非CD8依赖的细胞毒性T淋巴细胞),Nature337:73-75。因此，人或人源化CD8的表达可能对于研究针对人或人源化的MHCI递呈抗原的T细胞应答是有益的。
与CD4类似，CD8的胞质结构域与酪氨酸激酶Lck相互作用，进而导致T细胞活化。尽管Lck似乎与CD8α的胞质结构域相互作用，但是这种相互作用被存在CD8β的胞质结构域所调控，因为CD8β胞质结构域的突变或缺失会导致CD8α相关的Lck活性的降低。Irie等，(1998)ThecytoplasmicdomainofCD8βRegulatesLckKinaseActivationandCD8TcellDevelopment(CD8β的胞质结构域调控Lck激酶活化和CD8T细胞发育),J.Immunol.161:183-91。Lck活性的降低与T细胞发育受损相关，Id。
CD8在适宜细胞(例如细胞毒性T细胞)上的表达被位于整个CD8基因座的多种增强子元件紧密地调控。例如，在CD8基因座已鉴定得到了至少4个DNAseI-高敏感性区域，这些区域通常与调控结合相关。Hosert等，(1997)ACD8genomicfragmentthatdirectssubset-specificexpressionofCD8intransgenicmice(在转基因小鼠中涉及CD8的子集特异性表达的CD8基因组片段),J.Immunol.158:4270-81。由于在CD8基因座的这些DNAseI-高敏感性区域的发现，已鉴定得到的至少5个增强子元件，其分布在整个CD8基因座，其在T细胞的不同谱系中调控CD8α和/或β的表达，包括DP、CD8SPT细胞或表达γδTCR的细胞。参见例如Kioussis等，(2002)ChromatinandCD4,CD8α,andCD8βgeneexpressionduringthymicdifferentiation(在胸腺分化过程中的染色质以及CD4、CD8α和CD8β的基因表达),NatureRev.2:909-919和网络勘误；Ellmeier等，(1998)MultipleDevelopmentStage-SpecificEnhancersRegulateCD8ExpressioninDevelopingThymocytesandinThymus-IndependentTcells(在发育中的胸腺细胞和不依赖性胸腺的T细胞中的多个发育阶段特异性的增强子调控CD8的表达),Immunity9:485-96。
因此，与在人或人源化的CD4基因修饰的动物中保留内源性CD4启动子和调控元件的益处相似，在一些实施方式中，研发保留控制人或人源化CD8的表达的内源性小鼠启动子和调控元件的基因修饰的非人动物可能是有益的。其在形成如本申请所述的包含使用编码人或人源化的CD8α和/或β蛋白的那些取代编码CD8α和/或β蛋白的内源性非人序列的基因修饰的动物中可能是特别有益的。
在不同实施方式中，本发明提供了一种基因修饰的非人动物，所述非人动物在其基因组(例如内源性CD8基因座)中包含至少一个编码嵌合的人/非人CD8多肽(例如CD8α和/或β多肽)的核苷酸序列，其中所述多肽的人源部分包含全部或基本上全部的人CD8(例如CD8α和/或β)的胞外域，其中非人部分包含非人CD8(例如CD8α和/或β)的至少跨膜和胞质结构域，和其中所述动物表达嵌合的CD8多肽(例如CD8α和/或β多肽)。因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种基因修饰的非人动物，所述非人动物在其内源性非人CD8基因座包含编码嵌合的人/非人CD8α多肽的第一核苷酸序列和编码嵌合的人/非人CD8β多肽的第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列包含编码全部或基本上全部的人CD8α多肽胞外域以及非人CD8α多肽的至少跨膜和胞质结构域的序列，和其中所述第二核苷酸序列包含全部或基本上全部的人CD8β多肽胞外域以及非人CD8β多肽的至少跨膜和胞质结构域的序列，其中所述动物表达功能性的嵌合人/非人CD8蛋白。在一个方面，所述非人动物仅表达人源化的CD8多肽(例如嵌合的人/非人CD8α和/或β多肽)，并且不表达来自内源性CD8基因座的相应的功能性非人CD8多肽。
在一个实施方式中，所述嵌合的人/非人CD8α多肽在其人部分包含全部或基本上全部的人CD8α多肽的胞外域。在一个实施方式中，所述嵌合的CD8α多肽的人部分至少包含人CD8α多肽的MHCI结合结构域。在一个实施方式中，所述嵌合的CD8α多肽的人部分包含至少全部或基本上全部的人CD8α免疫球蛋白V-样结构域的序列。在一个实施方式中，编码所述嵌合的CD8α多肽的人部分的核苷酸序列至少包含编码人CD8α多肽的胞外域的外显子。在一个实施方式中，所述核苷酸序列至少包含编码IgV-样结构域的外显子。在一个实施方式中，人CD8α多肽的胞外域是包含所述多肽非跨膜或胞质结构域的结构域的区域。在一个实施方式中，编码所述嵌合的人/非人CD8α多肽的核苷酸序列包含编码非人(例如啮齿动物，例如小鼠)CD8α信号肽的序列。或者，所述核苷酸序列可以包含编码人CD8α信号序列的序列。在一个实施方式中，所述嵌合的人/非人CD8α多肽包含如SEQIDNO:54所示的氨基酸序列，和所述嵌合多肽的人部分如SEQIDNO:54第28-179位的氨基酸所示(单独用SEQIDNO:59表示)。
类似地，在一个实施方式中，所述嵌合的人/非人CD8β多肽在其人部分中包含全部或基本上全部的人CD8β多肽的胞外域。在一个实施方式中，所述嵌合的CD8β多肽的人部分包含全部或基本上全部的CD8β免疫球蛋白V-样结构域的序列。在一个实施方式中，编码所述嵌合的CD8β多肽的人部分的核苷酸序列至少包含编码人CD8β多肽的胞外域的外显子。在一个实施方式中，所述嵌合的人/非人CD8β多肽的人部分至少包含编码CD8βIgGV-样结构域的外显子。在一个实施方式中，所述编码嵌合的人/非人CD8β多肽的核苷酸序列包含编码非人(例如啮齿动物，例如小鼠)CD8β信号肽的序列。或者，所述核苷酸序列可以包含编码人CD8β信号序列的序列。在一个实施方式中，所述嵌合的人/非人CD8β多肽包含如SEQIDNO:53所示的氨基酸序列，和所述嵌合多肽的人部分如SEQIDNO:53第15-165位的氨基酸所示(单独用SEQIDNO:58表示)。
在一个实施方式中，所述非人动物表达嵌合的人/非人CD8α和/或CD8β多肽。在一些实施方式中，所述嵌合的人/非人CD8α和/或β多肽的人部分包含一个或多个保守的或非保守的修饰。
在一个方面，本申请提供了一种表达人CD8α和/或β多肽序列的非人动物，其中所述人CD8α和/或β多肽的序列分别与人CD8α和/或β多肽的序列具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性。在一个特定实施方式中，所述人CD8α和/或β多肽的序列分别与实施例中描述的人CD8α和/或β多肽的序列具有至少约90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一个实施方式中，所述人CD8α和/或β多肽的序列包含一个或多个保守的取代。在一个实施方式中，所述人CD8α和/或β多肽的序列包含一个或多个非保守的取代。
在一些实施方式中，一部分例如所述嵌合CD8的人部分可以包含基本上全部的本申请所示的序列(例如，基本上全部的本申请所示的蛋白结构域)。基本上全部序列通常包括据信代表所述蛋白特定部分(例如特定功能性结构域等)的85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸。本领域技术人员将理解可以根据所使用的比对和结构域预测方法的不同，功能性结构域的边界可能发生变化。
在一个方面，所述嵌合的人/非人CD8α和/或β多肽的非人部分至少分别包含所述非人CD8α和/或β多肽的跨膜和/或胞质结构域。由于CD8胞质结构域具有重要的功能，因此在基因工程改造的动物中保留内源性非人(例如小鼠)序列确保保持共受体具有正确的细胞内信号和其他功能。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠，和所述非人CD8α和/或β多肽分别是小鼠CD8α和/或β多肽。尽管在实施例中描述了特定的小鼠CD8α和/或β序列，但是来源于其的任意适宜序列例如包含保守的/非保守的氨基酸取代的序列均包括在本申请中。在一个实施方式中，所述非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠)保留了未被人源化的任意内源性序列。
本申请所述的非人动物可以在其内源性基因座包含编码嵌合的人/非人CD8α和/或β多肽的核苷酸序列。在一个方面，其导致内源性CD8α基因的一部分被编码人CD8α多肽的一部分的核苷酸序列所取代，和/或内源性CD8β基因的一部分被编码人CD8β多肽的一部分的核苷酸序列所取代。在一个实施方式中，此类取代是编码全部或基本上全部的非人CD8α和/或β的胞外域的内源性核苷酸序列被编码其的人核苷酸序列的取代。在一个实施方式中，此类取代是编码全部或基本上全部的非人CD8α和/或β的免疫球蛋白V-样结构域的序列被编码其的人核苷酸序列的取代。在一个实施方式中，所述取代不包含对编码非人CD8α和/或β多肽跨膜和胞质结构域的CD8α和/或β序列的取代。因此，所述非人动物表达来自内源性非人CD8基因座的嵌合的人/非人CD8α和/或β多肽。在又一个实施方式中，所述取代产生包含分别如SEQIDNO:54和/或53所示的多肽序列的CD8α和/或β蛋白。
在一个实施方式中，本申请提供了所述嵌合的人/非人CD8基因座(例如嵌合的啮齿动物CD8基因座，例如嵌合的小鼠CD8基因座)的核苷酸序列。在一个方面，由于所述嵌合的人/非人(例如人/啮齿动物，例如人/小鼠)CD8α和/或β序列分别位于内源性非人(例如啮齿动物，例如小鼠)的CD8α和/或β基因座，因而其保留了内源性CD8α和/或β的启动子和调控元件。在另一个实施方式中，所述嵌合的基因座可以包含人CD8α和/或β启动子和调控元件的程度为使得恰当地实现CD8α和/或β表达(恰当的空间和时间上的蛋白表达)、CD8+T细胞发育、CD8谱系选择和共受体功能。因此，在一个方面，本发明的动物包含不改变恰当的谱系选择和T细胞发育的基因修饰。在一个方面，本发明的动物(例如啮齿动物，例如小鼠)在正常表达CD8的细胞以外的免疫细胞上不表达嵌合的CD8蛋白，例如动物在B细胞或CD4+SPT细胞上不表达CD8。在一个实施方式中，所述取代保留了能够恰当地在空间和时间上调控CD8α和/或β表达的元件。
包含本申请所述的人或人源化的CD8多肽的基因修饰的非人动物可以选自在上文中与人源化的CD4动物的相关章节描述的任意动物。在一个实施方式中，所述非人动物可以是啮齿动物，例如大鼠或小鼠。
因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠在其基因组例如内源性CD8基因座中包含编码嵌合的人/小鼠CD8α多肽的第一核苷酸序列和编码嵌合的人/小鼠CD8β多肽的第二核苷酸序列。在一个实施方式中，所述第一核苷酸序列包含编码全部或基本上全部的人CD8α多肽的胞外域和小鼠CD8α多肽的至少跨膜和胞质结构域的序列，和所述第二核苷酸序列包含编码全部或基本上全部的人CD8β多肽的胞外域和小鼠CD8β多肽的至少跨膜和胞质结构域的序列，和其中所述小鼠表达功能性的嵌合的人/小鼠CD8蛋白。在一个实施方式中，所述第一核苷酸序列包含编码人CD8α多肽的至少免疫球蛋白V-样结构域的序列和小鼠CD8α多肽的其余序列，和所述第二核苷酸序列包含编码人CD8β多肽的至少免疫球蛋白V-样结构域的序列和小鼠CD8β多肽的其余序列。在一个实施方式中，所述第一核苷酸序列至少包含人CD8α多肽的MHCI结合结构域。在一个实施方式中，所述第一和第二核苷酸序列至少包含分别编码人CD8α多肽和/或CD8β多肽胞外域的外显子的序列。在一个实施方式中，所述人CD8α多肽和/或CD8β多肽的胞外域是包含非跨膜或胞质结构域的人CD8α多肽和/或CD8β多肽结构域的区域。在一个实施方式中，所述人CD8α多肽的结构域如图4和5中的示意图。在一个实施方式中，所述人CD8β多肽的结构域如图3和5中示意图。在一个实施方式中，编码所述嵌合的人/小鼠CD8α多肽和CD8β多肽的核苷酸序列包含分别编码小鼠CD8α和/或CD8β信号肽的序列。或者，所述核苷酸序列可以包含编码人CD8α和/或β信号序列的序列。在一个实施方式中，所述小鼠包含编码全部或基本上全部的小鼠CD8α和/或CD8β胞外域的核苷酸序列分别被编码全部或基本上全部的人CD8α和/或CD8β胞外域的核苷酸序列的取代。
在一个实施方式中，所述小鼠不表达来自其内源性CD8基因座的功能性内源性小鼠CD8α和/或CD8β多肽。在一个实施方式中，本申请所述的小鼠在其种系中包含嵌合的人/小鼠CD8序列。
在一个方面，表达嵌合的人/小鼠CD8α和/或CD8β多肽的小鼠保留了小鼠CD8α和/或CD8β的启动子和调控序列，例如在所述小鼠中编码嵌合的人/小鼠CD8的核苷酸序列与内源性的小鼠CD8启动子和调控序列可操作地连接。在一个方面，在所述小鼠中保留的这些调控序列包括在T细胞发育的合适阶段调控CD8蛋白表达的序列。在一个方面，所述基因修饰的小鼠在CD4谱系的B细胞或T细胞，或正常不表达内源性CD8的任意细胞(例如免疫细胞)上不表达嵌合的CD8。
在不同实施方式中，表达来自如本申请所述的嵌合的CD8基因座的功能性嵌合CD8蛋白(例如CD8αβ或CD8αα)的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)在细胞表面上显示出嵌合的蛋白。在一个实施方式中，所述非人动物表达的嵌合的CD8蛋白在细胞表面上的细胞分布与在人中观察到的相同。在一个方面，本发明的CD8蛋白能够与另一种细胞表面上表达的MHCI蛋白相互作用。
在一个实施方式中，本发明的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠)还包含编码人或人源化的MHCI蛋白的核苷酸序列，以使得在所述动物的T细胞表面上表达的嵌合的CD8蛋白能够与另一种细胞(例如抗原递呈细胞)表面上表达的人或人源化的MHCI相互作用。在一个实施方式中，所述MHCI蛋白包含人MHCI多肽的胞外域。在一个实施方式中，所述动物还包含人或人源化的β-2微球蛋白多肽。在2012年10月26日提交的美国专利申请号13/661,159和2013年3月11日提交的美国专利申请号13/793,812中描述了表达人或人源化的MHCI多肽和/或β-2微球蛋白多肽的示例性基因修饰的动物，其全部内容通过引入并入本申请。因此，在一个实施方式中，包含本申请所述的嵌合的CD8蛋白的动物还可以包含人源化的MHCI复合物，其中所述人源化的MHCI复合物包含：(1)人源化的MHCI多肽，例如其中所述人源化的MHCI多肽包含人MHCI胞外域以及内源性(例如小鼠)MHCI的跨膜和胞质结构域，例如其中所述人源化的MHCI包含人MHCI多肽的α1、α2和α3结构域，和(2)人或人源化的β2微球蛋白多肽(例如所述动物在其基因组中包含如人β2微球蛋白的外显子2、3和4所示的核苷酸序列)。在一个方面，人源化的MHCI以及人或人源化的β2微球蛋白多肽分别由位于内源性MHCI和β2微球蛋白基因座的核苷酸序列编码；在一个方面，所述动物不表达功能性的内源性的MHCI和β2微球蛋白多肽。因此，所述动物表达的MHCI可以是嵌合的人/非人，例如人/啮齿动物(例如人/小鼠)MHCI多肽。所述嵌合的MHCI多肽的人部分可以来源于选自下组的人I类HLA蛋白：HLA-A、HLA-B和HLA-C，例如HLA-A2、HLA-B27、HLA-B7、HLA-Cw6，或者在人类群体中存在的任意其他I类HLA。在所述实施方式中，其中所述动物是小鼠，所述嵌合的MHCI多肽的非人(即小鼠)部分可以来源于选自H-2D、H-2K和H-2L的小鼠MHCI蛋白。在一个方面，包含本申请所述的嵌合的人/非人CD8和美国专利申请号13/661,159和13/793,812中所述的人源化的MHCI和/或β2微球蛋白的所述非人动物可以通过将包含如本申请所述的嵌合CD8基因座(例如嵌合的CD8α和/或β)的动物与包含人源化MHCI和/或β-2微球蛋白基因座的动物繁殖产生。所述动物还可以通过将编码嵌合的CD8(例如嵌合的CD8α和/或β)(例如用于在内源性CD8基因座(例如嵌合的CD8α和/或β基因座)进行取代)的核苷酸序列引入包含人源化的MHCI和/或β-2微球蛋白基因座的动物的ES细胞中产生；或者将编码人源化的MHCI和/或β-2微球蛋白的核苷酸序列引入包含嵌合CD8基因座(例如嵌合的CD8α和/或β基因座)的动物的ES细胞中产生。
除了基因工程改造的非人动物以外，本申请还提供了非人胚胎(例如内齿动物，例如小鼠或大鼠胚胎)，其中所述胚胎包含来源于如本申请所述的非人动物(例如，啮齿动物，例如小鼠或大鼠)的供体ES细胞。在一个方面，所述胚胎包含含有所述嵌合的CD8基因的ES供体细胞和宿主胚胎细胞。
本申请还提供了一种组织，其中所述组织来源于如本申请所述的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)，并且表达所述嵌合的CD8蛋白。
此外，本申请提供了分离自如本申请所述的非人动物的非人细胞。在一个实施方式中，所述细胞是ES细胞。在一个实施方式中，所述细胞是T细胞，例如CD8+T细胞。在一个实施方式中，所述细胞是细胞毒性T细胞。
本申请还提供了一种非人细胞，所述非人细胞包含如本申请所述的非人动物的染色体或其片段。在一个实施方式中，所述非人细胞包含如本申请所述的非人动物的核。在一个实施方式中，所述非人细胞包含核转移得到的染色体或其片段。
在一个方面，本申请提供了一种非人的诱导的多能细胞，所述多能细胞包含编码如本申请所述的嵌合的CD8多肽(例如CD8α和/或CD8β多肽)的基因。在一个实施方式中，所述诱导多能细胞来源于如本申请所述的非人动物。
在一个方面，本申请提供了一种杂交瘤或四价体瘤，其来源于如本申请所述的非人动物细胞。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠或大鼠。
在一个方面，本申请提供了一种体外制备物，所述体外制备物包含在其表面携带嵌合CD8蛋白的T细胞和与所述嵌合CD8结合的另一种细胞。在一个实施方式中，所述另一种细胞是表达MHCI多肽的细胞，例如嵌合的人/非人MHCI蛋白。在一个实施方式中，在第一种细胞表面上的嵌合的CD8与在第二种细胞表面上的嵌合的MHCI相互作用。在一个实施方式中，所述嵌合的CD8蛋白保留了与内源性胞质分子的相互作用，例如内源性胞质信号分子(例如内源性Lck等)。
本申请还提供了一种用于制备本申请所述的基因工程改造的非人动物的方法。所述方法使得所述动物在内源性CD8基因座包含编码嵌合的人/非人CD8α和/或CD8β多肽的核苷酸序列。如实施例中所描述的，所述方法利用使用技术制备靶向构建体，将所述构建体引入ES细胞，并使用技术将经靶向的ES细胞克隆引入小鼠的胚胎中。
在一个实施方式中，本发明提供了一种修饰非人动物的CD8基因座以表达本申请所述的嵌合的人/非人CD8多肽的方法。在一个方面，提供了一种修饰小鼠的CD8基因座以表达嵌合的人/小鼠CD8多肽的方法，所述方法包括使用编码嵌合的人/小鼠CD8多肽的核苷酸序列在内源性CD8基因座取代编码内源性小鼠CD8多肽的小鼠核苷酸序列。所述CD8多肽可以选自CD8α、CD8β及其组合。在一个方面，所述嵌合的多肽包含全部或基本上全部的人CD8多肽的胞外域和内源性小鼠CD8多肽的至少跨膜和胞质结构域。
因此，本申请还提供了用于产生本申请所述的基因修饰的动物的核苷酸构建体。在一个方面，所述核苷酸构建体的序列包含5’和3’同源臂、包含人CD8α或CD8β序列的DNA片段和翼侧为重组位点的选择性表达盒。在一些实施方式中，所述人序列包含人CD8α或CD8β的内含子和外显子，例如分别编码人CD8α或CD8β胞外域的外显子。在一个实施方式中，同源臂与非人CD8α或CD8β序列是同源的。CD8α或CD8β的示例性构建体分别如图4和3所示。
由于编码CD8α或CD8β的基因具有接近的染色体位置，因此对这两个基因顺序靶向提高了成功的人源化的机会。在一个实施方式中，所述靶向策略包含将本申请所述的嵌合的CD8β构建体引入ES细胞，由被靶向的ES细胞产生小鼠，从所述小鼠获得基因修饰的ES细胞，以及将本申请所述的嵌合的CD8α构建体引入所述基因修饰的ES细胞。在另一个实施方式中，所述靶向策略包含将本申请所述的嵌合的CD8β构建体引入ES细胞，选择已掺入所述嵌合的CD8β构建体的所述细胞，将本申请所述的嵌合的CD8α构建体引入已掺入和携带嵌合的CD8β构建体的ES细胞，以及选择已掺入嵌合的CD8β和CD8α的细胞。在本实施方式的一个方面，利用不同的选择标记物进行选择步骤。在其他实施方式中，可以首先完成CD8α的人源化。在基因靶向完成后，可以通过多种方法(例如上文所述的针对CD4人源化的方法，例如Valenzuela等描述的改良的等位基因测定，如上所述)对基因修饰的非人动物的ES细胞进行筛选以确证成功掺入了目标外源性核苷酸序列或表达外源性多肽。
在一个方面，本申请提供了一种用于制备嵌合的人/非人CD8分子(例如CD8α和/或CD8β)的方法，所述方法包括在单一细胞中表达来自如上文所述的核苷酸构建体的嵌合的CD8多肽。在一个实施方式中，所述核苷酸构建体是病毒载体；在一个特定的实施方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一个实施方式中，所述细胞选自CHO、COS、293、HeLa和表达病毒核酸序列的视网膜细胞(例如PERC.6TM细胞)。
在一个方面，本申请提供了一种表达嵌合的CD8蛋白的细胞。在一个实施方式中，所述细胞包含含有如本申请所述的嵌合的CD8序列的表达载体。在一个实施方式中，所述细胞选自CHO、COS、293、HeLa和表达病毒核酸序列的视网膜细胞(例如PERC.6TM细胞)。
本申请还提供了一种由如本申请所述的非人动物制备的嵌合的CD8分子，其中所述嵌合的CD8分子包含全部或基本上全部的来自人CD8蛋白(例如CD8α和/或CD8β)的胞外域，和来自非人CD8蛋白(例如小鼠CD8蛋白)的至少跨膜和胞质结构域。示例性的嵌合的CD8α多肽如SEQIDNO:54所示，和示例性的嵌合的CD8β蛋白如SEQIDNO:53所示。
基因修饰的CD4和CD8动物的用途
包含人源化的CD4和MHCII或者人源化的CD8和MHCI的基因修饰的非人动物，例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠，以与人类似的方式将肽递呈至T细胞(分别为CD4+或CD8+T细胞)，这是因为所述复合物基本上全部的的成分是人或人源化的。本发明的基因修饰的非人动物能够用于在人源化的动物中研究人免疫系统的功能；用于鉴定激发免疫应答的抗原和抗原表位(例如T细胞表位，例如独特的人癌症表位)，例如用于疫苗研发；用于鉴定人病原体或癌症抗原的高亲和性T细胞(即在具有高亲和力的人MHCI复合物的背景下与抗原结合的T细胞)，例如用于适应性T细胞疗法；用于评估疫苗候选物和其他疫苗策略；用于研究人的自身免疫；用于研究人的感染性疾病；以及用于设计基于人MHC和CD4/CD8表达的更好的治疗策略的其他方面。
因此，在不同实施方式中，其中，本发明的基因修饰的动物在用于评估抗原在人体内激发免疫应答的能力，以及产生多样性的抗原和鉴定可以用于人用疫苗研发的特定抗原方面是有益的。
在一个方面，本申请提供了一种用于确定是否肽将在人体内激发细胞免疫应答的方法，所述方法包括将本申请所述的基因修饰的非人动物暴露于所述肽，使所述非人动物产生免疫应答，以及在与由如本申请所述的嵌合的人/非人MHCI或II分子提呈的所述肽的序列结合的所述非人动物的细胞(例如分别为CD8+或CD4+T细胞，包括人CD8或CD4)中进行检测。在一个实施方式中，暴露后的所述非人动物包含与所述肽结合的I类MHC限制性CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在另一个实施方式中，暴露后的所述非人动物包含与所述肽结合的MHCII限制性CD4+T细胞。
在一个方面，本申请提供了一种用于鉴定人T细胞表位的方法，所述方法包括将如本申请所述的非人动物暴露于包含假定的T细胞表位的抗原，使所述非人动物产生免疫应答，从所述非人动物中分离与所述表位结合的I类MHC或II类MHC限制性T细胞，以及鉴定被所述T细胞结合的表位。
在一个方面，本申请提供了一种用于鉴定在人体内产生T细胞应答的抗原的方法，所述方法包括将假定抗原暴露于如本申请所述的小鼠，使所述小鼠产生免疫应答，以及鉴定被I类或II类HLA限制性分子结合的抗原情况。
在一个方面，本申请提供了一种用于确定是否假定的抗原含有当暴露于人免疫系统后将产生I类或II类HLA限制性免疫应答的表位的方法，所述方法包括将如本申请所述的小鼠暴露于所述假定的抗原并且测定在小鼠中的抗原特异性I类HLA或II类HLA限制性免疫应答。
此外，本申请所述的基因工程改造的非人动物可以用于鉴定识别目标抗原(例如肿瘤或其他疾病抗原)的T细胞受体(例如高亲和力的T细胞受体)。所述方法可以包括：将本申请所述的非人动物暴露于抗原，使所述非人动物针对所述抗原产生免疫应答，从所述非人动物中分离包含与由人或人源化的MHCI或MHCII递呈的抗原结合的T细胞受体的T细胞，以及确定所述T细胞受体的序列。
在一个实施方式中，本申请提供了一种通过假定的人用治疗确定T细胞活化的方法，所述方法包括将如本申请所述的基因修饰的动物暴露于假定的人用治疗(或者例如将此类动物的表达人或人源化MHCII或MHCI的细胞暴露于所述假定治疗的肽序列)，将所述基因修饰的动物的显示出人或人源化MHC/肽复合物的细胞暴露于包含能够与所述基因修饰的动物的细胞结合的嵌合的人/非人(例如人/小鼠)CD4或CD8的T细胞，以及测定由所述基因修饰的动物的展示出肽的细胞诱导的T细胞活化。
除了鉴定来自人病原体或肿瘤的抗原和抗原表位的能力以外，本发明的基因修饰的动物能够用于鉴定与人自身免疫性疾病相关的自身抗原，例如I型糖尿病、多发性硬化等。而且，本发明的基因修饰的动物能够用于研究人自身免疫性疾病的多个方面，并且可以用作自身免疫性疾病的模型。
本申请所述的基因修饰动物(即包含人或人源化的T细胞共受体(例如嵌合的人/非人CD4或CD8)的动物)的其他用途任选地还包括人或人源化的MHCII或I蛋白，其从本公开中将是显而易见的。
实施例
将通过下述非限制性实施例对本发明进行进一步解释。列出这些实施例用于帮助理解本发明，其不以任何方式构成对其保护范围的限制。所述实施例不包括对本领域普通技术人员熟知的常规方法(分子克隆技术等)的详细描述。除非另有明示，以重量份表示重量，分子量是平均分子量，以摄氏度表示温度和压力为处于或接近大气压。
实施例1：基因修饰的CD4小鼠的构建和表征
实施例1.1：工程化制备嵌合的CD4基因座
通过使用技术(参见例如美国专利号6,586,251和Valenzuela等，(2003)High-throughputengineeringofthemousegenomecoupledwithhigh-resolutionexpressionanalysis(与高分辨率表达分析偶联的小鼠基因组的高通量工程改造),NatureBiotech.21(6):652-659)在一步中从人和小鼠的细菌人工染色体(BAC)DNA构建独特的靶向载体将小鼠CD4基因座人源化。为产生靶向载体，使用细菌人工染色体(BAC)DNA进行一系列细菌同源重组(BHR)以及其他的基因工程步骤。
简言之，四个DNA片段：(1)含有小鼠信号肽的片段(由小鼠CD4基因的外显子2和3编码)，(2)含有小鼠信号肽下游的人外显子3的片段，(3)含有翼侧为AscI和PI-SceI位点的SPEC抗性表达盒的片段，和(4)含有160bp的小鼠CD4内含子6的片段(在外显子6和7之间的内含子)，其从小鼠CD4外显子6下游约200bp开始通过注入连接(Clonetech)进行连接。所得到的DNA片段从5’至3’含有：小鼠外显子2、小鼠内含子2、含有信号肽的小鼠外显子3的部分、人信号肽下游的人外显子3、人内含子3的一部分、SPEC表达盒、小鼠内含子6的一部分。该DNA片段用在BHR中对小鼠BAC克隆BMQ391F08进行修饰，以缺失编码小鼠CD4Ig样结构域1-3的小鼠序列并引入人CD4的外显子3。使用SPEC表达盒取代BAC的CM表达盒得到第一BAC载体(图1，上图)。
利用BHR对人BACRP11-101F21进行修饰以便在人外显子3下游60bp处引入AscI-LoxP-PGK-neo-loxP表达盒，和在外显子6下游约100bp处引入PI-SceI限制性位点和SPEC表达盒，得到第二BAC载体(图1，中图)。随后在经过AscI和PI-SceI限制性内切酶消化后将所述第一和第二BAC载体进行BAC与BAC连接以产生CD4靶向载体(图1，下图)。小鼠-人和人-小鼠序列的上游和下游连接处分别列于下表1和如序列表所示。跨人内含子3-lox-neo表达盒连接处的序列(所述表达盒的5’端)如SEQIDNO:55所示，和跨lox-neo表达盒-人内含子3连接处的序列(所述表达盒的3’端)如SEQIDNO:56所示；这两条序列也列于表1中。图1中显示的包括pgk-neo表达盒的完整的人源化CD4片段的核酸序列如SEQIDNO:3所示。所述Pgk-neo表达盒跨SEQIDNO:3的残基307-2176，两个lox位点位于残基267-300和2182-2215，而人序列跨残基1-234和2222-18263。完整的人源化CD4蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，其人序列跨氨基酸27-319(如SEQIDNO:57所示)。
表1：嵌合的CD4靶向载体的连接处序列
人序列在括号中和含有限制性内切酶位点(PI-SceI)的序列以粗体表示。选择性表达盒序列以斜体表示。
使用NotI将人CD4靶向载体线性化并且经电穿孔引入F1H4小鼠ES细胞。利用使用改良的等位基因测定(Valenzuela等)进行基因分型鉴定携带人源化CD4基因座的经靶向的ES细胞，所述测定检测到存在新霉素表达盒和人CD4基因，以及一个拷贝的小鼠CD4基因。在该测定中使用的引物和探针如表2所示并且列于序列表中。
表2：用于对嵌合的CD4进行基因分型的引物和探针
通过电穿孔将表达Cre重组酶的质粒转移至含有人源化CD4基因座的ES细胞中除去翼侧为loxP的新霉素抗性表达盒。
利用基因分型鉴定携带人源化的CD4基因座且无抗性标记物的被靶向的ES细胞，其检测不到新霉素表达盒的存在，存在一个拷贝的人CD4基因和一个拷贝的小鼠CD4基因。
使用上文所述的被靶向的ES细胞作为供体ES细胞并通过方法(参见例如美国专利号7,294,754和Poueymirou等，(2007)F0generationmicethatareessentiallyfullyderivedfromthedonorgene-targetedEScellsallowingimmediatephenotypicanalyses(能够直接进行表型分析的基本上完全来源于供体基因靶向ES细胞的F0代小鼠)NatureBiotech.25(1):91-99)将其引入8-细胞阶段的小鼠胚胎。通过使用检测独特的人CD4基因序列存在情况的改良的等位基因测定(Valenzuela等，如上所述)进行基因分析鉴定得到(完全来源于供体ES细胞的F0小鼠)独立地携带嵌合的CD4基因。
实施例1.2：嵌合的CD4在基因工程小鼠中的表达情况
使用胶原酶D(RocheBioscience)灌流来自WT或杂合的人源化CD4小鼠(“1766HET”)的脾脏并使用ACK裂解缓冲液裂解红细胞。分别使用抗-人CD4或抗-小鼠CD4抗体通过FACS分析人CD4或小鼠CD4在细胞表面的表达情况。如图2A和2B所示，在来自针对本申请所述的人源化CD4的小鼠杂合子的T细胞表面表达人CD4。
实施例2：基因修饰的CD8小鼠的构建和表征
CD8蛋白以二硫键连接的两个亚基的同源二聚体(例如CD8α的同源二聚体)或同源多聚体，或者两个蛋白CD8α(CD8a)和CD8β(CD8b)的异源二聚体出现。CD8α和CD8β基因共同定位于基因组中，例如在小鼠的6号染色体上，其彼此之间距离约37kb。这种紧密连锁使其非常难以通过繁殖产生在CD8α和CD8β基因座均包含人源化的基因修饰的小鼠。因此，进行通过先引入一个基因例如CD8β，再引入第二个基因例如CD8α的顺序靶向。
实施例2.1：工程化制备嵌合的CD8β基因座
通过使用技术(参见例如美国专利号6,586,251和Valenzuela等，(2003)High-throughputengineeringofthemousegenomecoupledwithhigh-resolutionexpressionanalysis(与高分辨率表达分析偶联的小鼠基因组的高通量工程改造),NatureBiotech.21(6):652-659)在一步中从小鼠的细菌人工染色体(BAC)DNA构建独特的靶向载体将小鼠CD8β基因座人源化。利用BHR对来自BACRP23-431M6的DNA进行修饰以产生较大的靶向载体(LTVEC)MAID1737，以含有编码CD8胞外域的小鼠外显子2-3(从在内含子1中的5’连接处至在内含子3中的3’连接处)被同源的人序列的取代(图3)。将loxp-Ub-Hyg表达盒插入内含子3中的3’连接处。在所得到的载体不同连接处的核苷酸序列列于表3并且如序列表所示。完整的人源化CD8β蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:53所示；其具有跨距氨基酸15-165的人序列(如SEQIDNO:58所示)。
表3：嵌合的CD8β靶向载体的连接处序列
人序列在括号中，lox位点以斜体表示以及限制性内切酶位点、多重克隆位点和来源于载体的序列以粗体表示。
将靶向载体经电穿孔引入F1H4小鼠的ES细胞(图5，左图)。通过使用改良的等位基因测定(Valenzuela等)进行基因分型鉴定携带人源化CD8b基因座的被靶向的ES细胞，其检测到人CD8b基因的存在。在该测定中使用的引物和探针如表4所示并且列于序列表中。
表4：用于对嵌合的CD8β进行基因分型的引物和探针
LOA＝缺失等位基因；GOA＝获得等位基因。
使用上文所述的被靶向的ES细胞作为供体ES细胞并通过方法(参见例如美国专利号7,294,754和Poueymirou等，(2007)F0generationmicethatareessentiallyfullyderivedfromthedonorgene-targetedEScellsallowingimmediatephenotypicanalyses(能够直接进行表型分析的基本上完全来源于供体基因靶向ES细胞的F0代小鼠)NatureBiotech.25(1):91-99)将其引入8-细胞阶段的小鼠胚胎。通过使用检测独特的人CD8b基因序列存在情况的改良的等位基因测定(Valenzuela等，如上所述)进行基因分析鉴定得到(完全来源于供体ES细胞的F0小鼠)独立地携带嵌合的CD8b基因。
可以采用本领域技术人员公知的方法除去选择性表达盒。例如，可以通过使用表达Cre的构建体转染携带嵌合的人/小鼠CD8b基因座的ES细胞以除去通过插入含有人CD8b基因序列的靶向构建体引入的两端侧翼为LoxP的潮霉素表达盒。可以任选地通过与表达Cre重组酶的小鼠繁殖除去潮霉素表达盒。任选地，将所述潮霉素表达盒保留在所述小鼠中。在一个实施方式中，将所述表达盒缺失以产生MAID1739。
实施例2.2：工程化制备嵌合的CD8α基因座
通过使用技术(参见例如美国专利号6,586,251和Valenzuela等，如上文所示)在一步中从小鼠的细菌人工染色体(BAC)DNA构建独特的靶向载体将小鼠CD8a基因座人源化。利用BHR对来自BACRP23-431M6的DNA进行修饰以产生较大的靶向载体(LTVEC)MAID1738，以含有编码CD8a胞外域的小鼠外显子1-2(从在小鼠外显子1中的Ala密码子27的5’连接处至在小鼠内含子2中的3’连接处)被同源的人序列的取代(从在人外显子2中的5’连接处至在内含子3中的3’连接处(图4))。其保留了在外显子1起始处的小鼠先导序列。在人/小鼠序列的3’连接处插入lox2372-Ub-Neo表达盒。在所得到的载体不同连接处的核苷酸序列列于表5并且如序列表所示。完整的人源化CD8α多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:54所示，其具有人序列跨氨基酸28-179(如SEQIDNO:59所示)。
表5：嵌合的CD8α靶向载体的连接处序列
人序列在括号中，lox位点以斜体表示以及限制性内切酶位点、多重克隆位点和来源于载体的序列以粗体表示。
将上文所述的人源化的CD8a靶向载体经电穿孔引入含有人源化的CD8b基因座的小鼠ES细胞以形成包含人源化的CD8b和CD8a基因座的经修饰的ES细胞(图5)。通过使用改良的等位基因测定(Valenzuela等)进行基因分型鉴定携带人源化CD8a基因座的被靶向的ES细胞，其检测到人CD8a基因的存在。在该测定中使用的引物和探针如表6所示并且列于序列表中。
表6：用于对嵌合的CD8α进行基因分型的引物和探针
LOA＝缺失等位基因；GOA＝获得等位基因。
使用上文所述的被靶向的ES细胞作为供体ES细胞并通过方法(参见例如美国专利号7,294,754和Poueymirou等，如上文所述)将其引入8-细胞阶段的小鼠胚胎。通过使用检测独特的人CD8b和CD8a基因序列存在情况的改良的等位基因测定(Valenzuela等，如上所述)进行基因分析鉴定得到(完全来源于所述供体ES细胞的F0小鼠)携带嵌合的CD8b基因和嵌合的CD8a基因。
或者，将本申请所述的人源化的CD8a靶向载体经电穿孔引入不含有人源化的CD8b基因座的小鼠ES细胞中以产生仅包含人源化的CD8a基因座的小鼠。
可以采用本领域技术人员公知的方法除去CD8a基因座中的选择性表达盒，例如上文的实施例2.1中所述的。在一个实施方式中，缺失选择性表达盒以产生MAID1740小鼠。
实施例2.3：嵌合的CD8在基因工程化的小鼠中的表达
针对人CD8的表达情况对针对人源化的CD8a(MAID1740)和CD8b(MAID1739)基因的小鼠杂合子进行分析。
在来源于杂合子脾细胞的CD3+CD4-T细胞表面上能够清楚地检测到人CD8a和CD8b的表达，但是在野生型动物中不能检测到(图6)。
在从杂合子获得的胸腺细胞表面上也能够检测到人CD8a和CD8b的表达，但是在野生型动物中不能检测到(图7)。
等同物
本领域技术人员将认识到，或者能够使用不超过常规的实验确定本申请所述的发明的特定实施方式的多种等同物。这类等同物旨在包含在下述权利要求中。
本申请通篇引用的非专利文件、专利申请和专利的全部内容通过引用整体并入本申请。

Claims (41)

1.一种基因修饰的非人动物，所述非人动物包含编码嵌合的人/非人T细胞共受体多肽的核苷酸序列，
其中所述嵌合多肽的非人部分至少包含非人T细胞共受体的跨膜和胞质结构域，和
其中所述非人动物表达嵌合的T细胞共受体多肽。
2.根据权利要求1所述的动物，其中所述核苷酸序列存在于内源性T细胞共受体基因座。
3.根据权利要求1所述的动物，其中所述动物不表达来自其内源性基因座的功能性内源性非人T细胞共受体。
4.根据权利要求1所述的动物，其中在所述非人动物的B细胞上不表达所述嵌合的T细胞共受体多肽。
5.根据权利要求1所述的动物，其中所述T细胞共受体基因座是CD4基因座和所述T细胞共受体多肽是CD4。
6.根据权利要求5所述的动物，其中在CD8谱系的B细胞或T细胞上不表达所述嵌合的CD4多肽。
7.根据权利要求1所述的动物，其中所述嵌合的T细胞共受体基因座是CD8基因座和所述T细胞共受体多肽是选自CD8α、CD8β或其组合的CD8多肽。
8.根据权利要求7所述的动物，其中所述动物表达包含CD8α和CD8β多肽的嵌合的人/非人CD8蛋白。
9.根据权利要求8所述的动物，其中在CD4谱系的B细胞或T细胞上不表达所述嵌合的CD8蛋白。
10.根据权利要求1所述的动物，其中所述动物是啮齿动物。
11.根据权利要求10所述的动物，其中所述动物是小鼠。
12.一种基因修饰的小鼠，所述小鼠包含编码嵌合的人/小鼠CD4多肽的核苷酸序列，
其中所述嵌合多肽的人部分至少包含如图1所示的人CD4多肽的结构域，
其中所述嵌合多肽的小鼠部分至少包含小鼠CD4多肽的跨膜和胞质结构域，和
其中所述小鼠表达嵌合的人/小鼠CD4。
13.根据权利要求12所述的小鼠，其中所述人部分包含所述人CD4多肽的胞外域。
14.根据权利要求12所述的小鼠，其中所述核苷酸序列存在于内源性CD4基因座。
15.根据权利要求12所述的小鼠，其中所述小鼠不表达来自其内源性小鼠CD4基因座的功能性内源性小鼠CD4。
16.根据权利要求12所述的小鼠，其中所述核苷酸序列与小鼠启动子和调控序列可操作地连接。
17.根据权利要求12所述的小鼠，其中所述小鼠在CD8谱系的B细胞或T细胞上不表达所述嵌合的CD4蛋白。
18.根据权利要求12所述的小鼠，其中所述小鼠还包含人或人源化的MHCII蛋白，其中所述MHCII蛋白包含人MHCIIα多肽的胞外域和人MHCIIβ多肽的胞外域。
19.根据权利要求12所述的小鼠，其中所述核苷酸序列包含在所述小鼠的种系中。
20.一种修饰小鼠的CD4基因座以表达嵌合的人/小鼠CD4多肽的方法，所述方法包括使用编码嵌合的人/小鼠CD4多肽的核苷酸序列取代在小鼠内源性CD4基因座的编码内源性小鼠CD4多肽的核苷酸序列。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述嵌合的人/小鼠CD4多肽的人部分至少包含如图1所示的人CD4多肽的结构域和内源性小鼠CD4多肽的跨膜和胞质结构域。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述人部分包含所述人CD4多肽的胞外域。
23.一种基因修饰的小鼠，所述小鼠包含：
编码嵌合的人/小鼠CD8α多肽的第一核苷酸序列和编码嵌合的人/小鼠CD8β多肽的第二核苷酸序列，
其中所述第一核苷酸序列包含编码人CD8α多肽的胞外域和小鼠CD8α多肽的至少跨膜和胞质结构域的序列，
其中所述第二核苷酸序列包含编码人CD8β多肽的胞外域和小鼠CD8β多肽的至少跨膜和胞质结构域的序列，和
其中所述小鼠表达嵌合的人/小鼠CD8蛋白。
24.根据权利要求23所述的小鼠，其中所述第一和第二核苷酸序列分别存在于内源性CD8α和CD8β基因座。
25.根据权利要求23所述的小鼠，其中所述小鼠在其内源性CD8基因座不表达功能性内源性CD8蛋白。
26.根据权利要求23所述的小鼠，其中所述小鼠在CD4谱系的B细胞或T细胞上不表达所述嵌合的人/小鼠CD8蛋白。
27.根据权利要求23所述的小鼠，其中所述第一核苷酸序列与小鼠CD8α启动子和调控序列可操作地连接和所述第二核苷酸序列与小鼠CD8β启动子和调控序列可操作地连接。
28.根据权利要求23所述的小鼠，其中所述小鼠还包含人或人源化的MHCI多肽，其中所述MHCI多肽包含人MHCI多肽的胞外域。
29.根据权利要求28所述的小鼠，其中所述小鼠还包含人或人源化的β2微球蛋白多肽。
30.根据权利要求23所述的小鼠，其中所述第一和第二核苷酸序列包含在所述小鼠的种系中。
31.一种修饰小鼠的CD8基因座以表达嵌合的人/小鼠CD8多肽的方法，所述方法包括使用编码嵌合的人/小鼠CD8多肽的核苷酸序列取代在小鼠内源性CD8基因座的编码内源性小鼠CD8多肽的核苷酸序列。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述CD8多肽选自CD8α、CD8β或其组合。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述嵌合的人/小鼠CD8多肽包含人CD8多肽的胞外域和内源性小鼠CD8多肽的至少跨膜和胞质结构域。
34.一种基因工程改造的小鼠，所述小鼠包含编码嵌合的人/小鼠CD8α多肽的核苷酸序列，
其中所述嵌合的人/小鼠CD8α多肽包含人CD8α多肽的胞外域和小鼠CD8α多肽的至少跨膜和胞质结构域，
其中所述小鼠表达嵌合的人/小鼠CD8α多肽。
35.根据权利要求34所述的小鼠，其中所述核苷酸序列存在于内源性小鼠CD8基因座。
36.根据权利要求34所述的小鼠，其中所述小鼠不表达来自其内源性CD8基因座的功能性内源性CD8α多肽。
37.根据权利要求34所述的小鼠，其中所述核苷酸序列与小鼠CD8α启动子和调控序列可操作地连接。
38.一种基因工程改造的小鼠，所述小鼠包含编码嵌合的人/小鼠CD8β多肽的核苷酸序列，
其中所述嵌合的人/小鼠CD8β多肽包含人CD8β多肽的胞外域和小鼠CD8β多肽的至少跨膜和胞质结构域，
其中所述小鼠表达嵌合的人/小鼠CD8β多肽。
39.根据权利要求38所述的小鼠，其中所述核苷酸序列存在于内源性小鼠CD8基因座。
40.根据权利要求38所述的小鼠，其中所述小鼠不表达来自其内源性CD8基因座的功能性内源性CD8β多肽。
41.根据权利要求38所述的小鼠，其中所述核苷酸序列与小鼠CD8β启动子和调控序列可操作地连接。
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