CN105158470A - 一种检测水产制品中副溶血性弧菌的elisa试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测水产制品中副溶血性弧菌的ELISA试剂盒及使用方法。检测对象包括熟制水产品、即食生制水产品。本发明涉及生物技术领域以及免疫学领域。该试剂盒包括：包被有特异性副溶血性弧菌单克隆抗体一的96孔酶标板、用辣根过氧化物酶标记特异性副溶血性弧菌单克隆抗体二、洗涤液、稀释液、显色液A、显色液B、终止液以及阳性对照和阴性对照。本发明提出的试剂盒可用来定性以及定量检测水产制品中的副溶血性弧菌。该发明中所使用的产单克隆抗体一和单克隆抗体二的细胞株保存编号分别为3A12和6C7。该发明的出现，填补了国内没有建立针对水产制品中副溶血性弧菌的酶联免疫检测方法的空白。本试剂盒具有良好灵敏度，较高的特异性和准确性。

Description

一种检测水产制品中副溶血性弧菌的ELISA试剂盒
技术领域
本发明属于免疫学和生物检测技术领域，具体还涉及食品安全相关的微生物检测分析技术，尤其提供了一种检测水产制品中副溶血性弧菌的ELISA试剂盒。
背景技术
副溶血性弧菌（Vibrioparahemolyticus，Vp）是一种革兰氏阴性嗜盐菌，广泛分布于近海区域、盐湖及鱼、贝类等海产品中，是沿海地区引起食物中毒的重要病原菌，可导致患者出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应，严重者可引起败血症，危及生命。副溶血性弧菌引起的疾病已成为我国一个严重的食源性公共卫生问题之一，由该菌引发食品中毒案例居微生物食源性疾病暴发案例之首，且呈上升趋势。
目前，副溶血性弧菌的检测多采用传统的方法，周期长，一般需要5至7天时间，过程繁琐，无法适应大量的样品筛查。特别是在水产制品中，样品存放时间过长会导致样品的变质，对检测结果带来不良影响。以抗体为基础的免疫学检测是近几年发展较快的检测方法。其中ELISA检测方法因其快速、灵敏、准确、稳定及批量检测的特点，成为食品安全检测中不可或缺的重要技术手段。
ELISA试剂盒是运用免疫学原理进行食品安全检测的重要产品，但由于微生物抗原的特殊性,对水产品中的副溶血性弧菌检验应用较为少见。目前我国的检测产品大多都依赖于进口，价格昂贵，并且需要配备专门的检测仪器。因此，研究和开发具有自主知识产权的用来检测食源性微生物的ELISA试剂盒具有重要意义。该专利即为以水产制品中副溶血性弧菌为检测对象的ELISA试剂盒。
发明内容
本发明的目的就是针对现有的检测副溶血性弧菌技术的不足和缺陷，发明了适用于水产制品中副溶血性弧菌的定性、定量快速筛查的ELISA试剂盒。
本发明所述的试剂盒，包括固相载体、检测抗体、洗涤液、稀释液、显色液（显色液A、显色液B）、样品提取液和终止液。其中固相载体为96孔酶标板，且包被有特异性副溶血性弧菌的单克隆抗体一。该ELISA试剂盒中的检测抗体即为用辣根过氧化物酶标记的特异性副溶血性弧菌的单克隆抗体二。
进一步，所述的ELISA试剂盒制备过程中所需的试剂有如下几种：
1、PBS缓冲液：NaCl8g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O3.6g、KH2PO40.24g，加蒸馏水至1000mL，调节溶液的pH值至7.4。
2、包被液（CB液）：Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，NaN30.2g，加蒸馏水至1000mL。密封盖好，4°C存放备用。
3、洗涤液(PBST含0.05％Tween20的PBS)：1LPBS中加入Tween-20500μL。
4、封闭液：100mLPBS中加入1gBSA，100μLTween-20。
5、抗体稀释液：100mLPBST中加入0.1gBSA。
6、底物显色液：
（1）底物显色A液：醋酸钠13.6g,柠檬酸1.6g,30%双氧水0.3mL,蒸馏水加至500ml。
（2）底物显色B液：乙二胺四乙酸二钠0.2g,柠檬酸0.95g,甘油50mL,取0.15gTMB溶于3mLDMSO中,蒸馏水加至500ml。4℃避光保存。
7、终止液：2mol/LH2SO4溶液。
8、样品提取液：灭菌的0.9%NaCl溶液和PBS缓冲液共250mL。
为了增加检测的准确性，本发明试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。所述的阳性对照副溶血性弧菌阳性血清，所述的阴性对照为未免疫副溶血性弧菌的正常小鼠血清。
进一步，所述的ELISA试剂盒制备主要步骤如下：
1、单克隆抗体的制备及筛选；
2、酶标板包被抗体；
3、辣根过氧化物酶标记特异性副溶血性弧菌单克隆抗体；
4、配备所需试剂；
5、将所有试剂按如下规格组成试剂盒。
本发明具有以下有益效果。首先，本发明针对水产制品样品专门制备样品提取液，避免了水产制品的样品存放时间过长会导致样品的变质，对检测结果带来不良影响；其次，所采用双抗夹心法设计检测，其特异性实验显示了本发明的试剂盒在水产制品中检测中有良好的特异性和稳定性；最后，灵敏度实验证明，本发明试剂盒的检测灵敏度为104cfu/mL，有良好的灵敏度和准确性。
附图说明
图1是检测水产制品中副溶血性弧菌的ELISA试剂盒原理中关键步骤的示意图。
图2是检测水产制品中副溶血性弧菌的ELISA试剂盒的标准曲线。
具体实施方式
实施例1一种检测水产制品中副溶血性弧菌的ELISA试剂盒的制备
1、单克隆抗体的制备及配对筛选：
采用副溶血性弧菌抗原作为免疫原，免疫8周龄健康Balb/c小鼠，首次与等量完全弗氏佐剂混合，以后换用不完全弗氏佐剂。免疫方案见表1。每周眼眶采血后间接ELISA法测定抗体效价，待血清效价达到1：104800后加强免疫，3天后进行细胞融合实验。
有限稀释法筛选阳性克隆，体内扩增法大量制备单克隆抗体。用蛋白A亲和层析柱纯化副溶血性弧菌单克隆抗体，通过夹心ELISA法筛选得到配对的抗副溶血性弧菌抗原的单克隆抗体一和抗副溶血性弧菌抗原抗原单克隆抗体二。产生抗体一和抗体二的细胞株分别保存命名为3A12和6C7。
血清的采取选择眼眶采血法。将所取血样4℃12000rpm离心3min，将上清移入无菌离心管中，-20℃保存备用。
表1免疫方案
2、酶标板包被抗体：
（1）用稀释液将抗体一稀释成10μg/mL,100μL/孔加入聚苯乙烯96孔酶标板中；
（2）4℃放置过夜；
（3）次日倾去凹孔内的液体，用PBST洗涤液洗3次；
（4）加l00μL/孔封闭液，37℃放置2小时；
（5）洗涤液洗3次，甩干，干燥后真空密封保存。
3、辣根过氧化物酶标记抗副溶血性弧菌单克隆抗体：将辣根过氧化物酶与所制备的单克隆抗体二采用过碘酸盐氧化法进行偶联。用稀释液l：3000稀释。
4、将所有试剂按如下规格组成试剂盒：
（1）已被真空封存的96孔酶标板1块；
（2）抗体二-HRP0.15mL；
（3）稀释液15mL；
（4）10倍洗涤液25mL；
（5）显色液A10mL；
（6）显色液B10mL；
（7）终止液15mL；
（8）阴性对照血清和阳性对照血清各0.2mL。
实施例2检测水产制品中副溶血性弧菌ELISA试剂盒的使用方法
1、待测样品的前处理
取待测样品增菌液1mL，12000rpm离心后弃上清，用PBS缓冲液洗涤后，加入200μLPBS重悬沉淀。沸水浴5min。冷却至室温备用。
2、加待测样品
将上述样品100μL/孔加到已包被的板上。阳性对照为灭活的副溶血性弧菌，阴性对照为未免疫副溶血性弧菌的正常小鼠血清。以相同的剂量加入对应的孔中。加盖37℃恒温箱温育40min。
3、用洗涤液洗3次，甩干。
4、加酶标抗抗体
抗体二-HRP，100μL／孔，加盖37℃恒温箱温育40min。
5、洗涤
用洗涤液洗5次，蒸馏水洗2次，甩干。
6、显色
加新鲜配制的底物溶液100μL/孔，37℃暗处放置15min，显示蓝色。
7、终止反应
加50μL/孔终止液。颜色变黄。
8、用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值即OD450nm。
9、结果的判定
经实验，计算得阴性的临界值为0.16，即OD值大于0.16即为阳性。此结果阳性表明样品中副溶血性弧菌已经超过了相关规定中的最大限量。
本检测水产制品中副溶血性弧菌的ELISA试剂盒的鉴定结果
通过双抗夹心ELISA对试剂盒的特异性和灵敏度进行检测，通过P/N来判定结果。实验（表2、表3）表明试剂盒与单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157等食源性致病菌都没有交叉反应。此试剂盒用来检测水产制品中的副溶血性弧菌含量是本发明最大的创新点并且灵敏度可达到104cfu/mL。
表2试剂盒特异性检测
表3试剂盒灵敏度检测结果
最后应当表明，虽然以上所述对本发明的具体实施方案有了较为详细的描述，但是在本发明的基础上，对于本领域的技术人员来说，其依然可以在本发明所述的基础上进行改进或修改，抑或对其中的部分技术手段进行替换，这是显而易见的。故凡是在本发明的框架之内所进行的改进或修改，均应该属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种检测水产制品中副溶血性弧菌的ELISA试剂盒，其特征在于，包括包被有特异性副溶血性弧菌的单克隆抗体一的96孔酶标板，用辣根过氧化物酶标记的特异性副溶血性弧菌的单克隆抗体二，稀释液，洗涤液，显色液,样品提取液以及终止液。
2.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所检测的对象为食品安全标准所规定的水产制品中的副溶血性弧菌。
3.根据权利要求2所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所检测的水产制品为鱼类，虾类，蟹类，贝类，海藻以及龟鳖类。
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