CN113121682A - 特异性识别o3:k6型副溶血性弧菌的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

特异性识别o3:k6型副溶血性弧菌的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种特异性识别O3:K6血清型副溶血性弧菌的单克隆抗体及其应用。本发明人筛选获得一株独特的杂交瘤细胞株，其产生抗副溶血性弧菌的抗体，该抗体具有优异的识别特性，对于特定型别(O3:K6血清型)的副溶血性弧菌具有结合/识别能力，而对于O3:K6血清型以外的其它副溶血性弧菌、以及其它非副溶血性弧菌则不发生结合/识别，特异性和敏感性俱佳。

Description

特异性识别O3:K6型副溶血性弧菌的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于微生物诊断或检测领域，更具体地，本发明涉及特异性识别 O3:K6血清型副溶血性弧菌的单克隆抗体及其应用。
背景技术
副溶血性弧菌是一种嗜盐性海洋弧菌，易引起食物中毒，其污染主要来自海产品，如墨鱼、海鱼、海虾、海蟹、海蜇，以及含盐分较高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。临床症状以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。在中国，副溶血弧菌是细菌性食物中毒事件最主要病原菌。因此，针对食品及环境中污染的副溶血性弧菌，建立快速有效的检测技术，实现副溶血弧菌的有效监控，对降低微生物性的食源性疾病的发生，有极其重大的意义。
目前中国食品中副溶血弧菌的检测主要依据“金标准”的是国标GB/T 4789-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》或 PCR检测方法，国标方法检测需要专业的微生物技术人员，而PCR方法对仪器设备和检测环境要求很高。基于免疫学的ELISA方法操作简便，检测时间短，可实现样品的高通量(最高可达96个样品)检测，在食源性致病菌检测监测与控制体系中发挥着至关重要的作用。但是，ELISA检测方法中使用的结果的准确性取决于抗体的质量。弧菌类细菌有大量的同源蛋白，而副溶血性弧菌这一种属又有多个血清型，要筛选出能同时检测多种血清型的副溶血性弧菌而不与其他细菌发生交叉反应的抗体并非易事。
副溶血性弧菌的基因型和血清型都具有高度多样性。但是，自1996年后世界范围内出现的副溶血性弧菌临床分离株(致病菌)以O3:K6血清型流行株为主，偶有其他血清型出现。中国副溶血性弧菌流行株亦是O3:K6血清型副溶血性弧菌。针对食品及环境中污染O3:K6血清型副溶血性弧菌，建立快速有效的检测技术，是尤为重要的。但是，鉴于副溶血性弧菌基因系及血清型非常多，且其它的一些非副溶血性弧菌与它也有高的相似度，造成了其生物学检测的困难，如何进行精确的判断、减少误判，是目前亟待研究和解决的。
综上，本领域很有必要针对副溶血性弧菌开发特异性好且交叉干扰少的抗体，以满足食品及其它多种样本检测等方面的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性识别O3:K6血清型副溶血性弧菌的单克隆抗体及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种单克隆抗体，其是由保藏号为CCTCC NO: C202023的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
在本发明的另一方面，提供一种杂交瘤细胞株，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号是CCTCC NO:C202023。
在一个优选例中，所述的单克隆抗体或所述的杂交瘤细胞株的用途，用于制备特异性地识别或检测O3:K6型副溶血性弧菌的检测试剂或检测试剂盒。
在另一优选例中，所述的检测O3:K6型副溶血性弧菌包括：(1)定性检测 O3:K6型副溶血性弧菌；或(2)定量检测O3:K6型副溶血性弧菌。
在本发明的另一方面，提供一种免疫缀合物，所述的免疫缀合物包括：所述的单克隆抗体；以及与所述单克隆抗体连接的可检测标记物；较佳地，所述可检测标记物包括：荧光标记物、显色标记物；更佳地包括：辣根过氧化物酶、生物素、胶体金或荧光等可适合于抗体标记的可检测标记物。
在本发明的另一方面，提供一种用于特异性识别或检测O3:K6型副溶血性弧菌的试剂盒，其包括：所述的单克隆抗体，所述的杂交瘤细胞株；和/或所述的免疫缀合物。
在一个优选例中，所述试剂盒中包括：捕获抗体(包被抗体)和检测抗体；其中所述捕获抗体为所述的单克隆抗体，所述检测抗体为所述的免疫缀合物。
在另一优选例中，所述的捕获抗体被固定在固相载体上；较佳地，所述固相载体包括(但不限于)：试纸、微球、包被板、玻片或芯片；较佳地，所述的试纸为胶体金试纸。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：与标记物相对应的底物；显色剂；洗涤液；和/或终止液。
在本发明的另一方面，提供一种离体非诊断性地识别或检测O3:K6型副溶血性弧菌的方法，利用所述的单克隆抗体作为包被抗体捕获待测样品，利用所述的免疫缀合物检测，获得O3:K6型副溶血性弧菌的存在情况以及存在量。
在一个优选例中，所述的待测样品不是直接来自动物或人的样品；较佳地所述的待测样品包括：食品、水生动植物(如但不限于鱼类、蟹类、虾类、贝类、藻类等)或其加工产物、临床样本等。
在另一优选例中，所述的检测副溶血性弧菌的方法为非诊断性的方法；较佳地，所述的方法应用于针对含菌场所、含菌环境、物品(如器皿)或食品、水生动植物等的检测。
在本发明的另一方面，提供一种用于检测O3:K6型副溶血性弧菌的测试件，其包括固相载体，以及附着于所述固相载体上的所述的单克隆抗体；较佳地，所述的测试件为测试试纸(条)；更佳地，其是免疫胶体金测试试纸(条)。
在本发明的另一方面，提供一种制备包含所述的单克隆抗体的免疫胶体金测试试纸的方法，所述方法包括：(1)将所述的单克隆抗体以0.5～2mg/mL 的包被浓度点到硝酸纤维素膜上，羊抗鼠二抗以0.5～2mg/ml作为Control点到硝酸纤维素膜上；干燥；(2)将所述的单克隆抗体以胶体金(如15～40nM)标记，点到经干燥的硝酸纤维素膜上。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、利用VP48A胶体金试纸条检测O3:K6血清型副溶血性弧菌。图中，上侧的线为C线(Control线)，下侧的线条为T线(Test线)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，筛选获得一株独特的杂交瘤细胞株，其产生抗副溶血性弧菌的抗体，该抗体具有优异的识别特性，对于特定型别 (O3:K6血清型)的副溶血性弧菌具有结合/识别能力，而对于O3:K6血清型以外的其它副溶血性弧菌、以及其它非副溶血性弧菌则不发生结合/识别，特异性和敏感性俱佳。
如本文所用，术语“待测样品”涵盖了多种样品类型，包括各种需要进行微生物特别是含有(感染)或潜在/预期含有(感染)副溶血性弧菌检测的样品。例如，所述的“待测样品”可以来自于含菌场所、含菌环境、物品(如器皿)或食品、乳品、饮料或药品等。
如本文所用，“捕获抗体”、“包被抗体”、“第一抗体”、与“一抗”可互换使用，都是指用于从样品中富集副溶血性弧菌的抗体。在本发明的优选方式中，所述的捕获抗体为本发明的由CCTCC NO:C202023的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
如本文所用，“检测抗体”、“第二抗体”、与“二抗”可互换使用，都是指与相应的捕获抗体配合进行识别或结合的抗体。对于本发明中感兴趣的O3:K6血清型副溶血性弧菌而言，相应的捕获抗体和检测抗体均为所述由 CCTCC NO:C202023的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体；较佳地在检测抗体上携带可检测标记物。
如本文所用，所述的“可检测标记物(信号)”是指与所述检测抗体连接并用于显示检测抗体与O3:K6血清型副溶血性弧菌特异性结合的信号。
单克隆抗体
尽管现有的免疫检测方法例如酶联免疫检测法(ELISA)已经广泛地被研究和适用，但是其检测的准确性依赖于抗体的质量。当进行微生物检测时，鉴于微生物种类繁多，种属之间即存在共性又存在个性，使得此方面的检测仍需不断探索。弧菌类细菌有大量的同源蛋白，而副溶血性弧菌这一种属又有多个血清型，要筛选出能同时检测多种血清型的副溶血性弧菌而不与其他细菌发生交叉反应的抗体非常困难。面对现有技术的这些问题，本发明人致力于寻找实现不同型别的副溶血性弧菌的特异性鉴定且能避免交叉干扰的抗体，分离了副溶血性弧菌的多种蛋白，以它们作为免疫原制备抗体，考察所获得的抗体的特异性。经过广泛地实验和论证，确定了以外膜蛋白U(OMPU) (即VPA0526，NC_004605.1)作为免疫原以及由此筛选获得的特异性抗体。
本发明提供了能结合O3:K6血清型副溶血性弧菌的单克隆抗体。优选地，本发明的单克隆抗体呈现对于O3:K6血清型副溶血性弧菌的特异性结合/识别活性。
本发明的单克隆抗体利用杂交瘤技术来制备。在获得了所述杂交瘤细胞的情况下，可按照常规的动物细胞培养方法，体外培养扩增所述的杂交瘤细胞，从而使之分泌所述的单克隆抗体。作为一种实施方式，所述的单克隆抗体可以由下列制备方法制备：(1)提供佐剂预处理的小鼠；(2)在小鼠腹腔内接种所述的杂交瘤细胞并分泌单克隆抗体；(3)抽取腹水，分离获得所述的单克隆抗体。
作为一种方式，从腹水中分离单克隆抗体的方法是：收集腹水，经硫酸铵，接着用Protein G层析柱纯化，获得高纯度的所述单克隆抗体。
在获得了本发明的抗体后，本领域技术人员可以通过本领域已知的测序技术来获得该单抗的序列信息，例如测得其重链和轻链的序列。从而可应用生物工程技术人工制备。
本发明的单克隆抗体可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。本领域人员均了解，在得到了所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系或通过测序等手段得知所述的单克隆抗体后，本领域人员可以方便地获得所述的抗体。
本发明的单克隆抗体来自于杂交瘤细胞株CCTCC NO:C202023。应理解，当从该细胞株获得本发明的抗体后，可以进行针对该抗体的多种改造，也可以对其进行测序，基于测序后的抗体结构进行优化改造，这些抗体变化方式均被包含在本发明的范围内。因此，本发明的抗体可以是完整的免疫球蛋白分子，也可以是抗原结合片段，包括但不限于Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、 dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体以及至少含有足以赋予与O3:K6 血清型副溶血性弧菌的特异性抗原结合免疫球蛋白的片段的(多)肽或其片段。
本发明还提供了一种免疫缀合物，其包含本文所述抗体以及进一步包含至少一种其它类型的功能性分子。所述的功能性分子包括但不限于：可检测标记物。所述抗体与所述功能性分子可以通过共价连接、偶联、附着、交联等方式构成辍合物。
在确定了本发明的试剂盒所采用的包被抗体和/或检测抗体后，可以采用本领域常规用于与检测抗体结合来进行检测的各种可检测标记物。本发明对所采用的标记物没有特别的限制，只要是能够与本发明的单克隆抗体结合，且在适当处理后能够准确地指示待检测样品中目标菌株的存在与否以及存在量的标记物均是可用的。所述的可检测标记物可包括但不限于：胶体金、荧光标记物、显色标记物；如：酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。也可包含一个以上的标记物。为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记抗体的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。
所述的标记物可直接被设置于检测抗体上；或者，所述的标记物也可被设置于特异性抗第二抗体的抗抗体上，本领域人员可根据所采用的抗体的种类和特性，选择适宜的标记物。例如，所述的标记物可以选自：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β–D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖淀粉酶或生物素。当采用如上所示的一些酶标记物时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从而可通过显色等方式来报导标记物的存在情况或者存在量。如本文所用，所述的“与标记物相对应的底物”是指可被标记物所催化显色，用于显示第二抗体与目标菌株发生结合的识别信号。所述的底物例如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(MB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)；用于生物素的藻红蛋白(链亲和素-藻红蛋白，又称为PE标记的链亲和素，SA-R-PE)；等等。本领域人员可根据所采用的标记物的种类和特性，选择适宜的底物。
作为一种具体的实例，所述的可检测标记物是HRP，该HRP作为显示标志，当与OPD、MB或ABTS等结合后，产生信号。
作为一种具体的实例，所述的可检测标记物是生物素，该生物素作为显示标志，当与链霉菌亲和素偶联的藻红蛋白(链亲和素-藻红蛋白，又称为PE 标记的链亲和素，SA-R-PE)结合后，通过激光激发产生荧光信号。
本发明的单克隆抗体，即可以作为检测O3:K6血清型副溶血性弧菌的捕获抗体(包被抗体)，也可以作为其检测抗体。提供一种试剂盒或检测方法，所述捕获抗体为本发明所述的来自于杂交瘤细胞株CCTCC NO:C202023的单克隆抗体，所述检测抗体为所述的免疫缀合物(由所述来自于杂交瘤细胞株 CCTCC NO:C202023加上可检测标记物而获得)。
检测试剂和试剂盒
在获得了本发明的单克隆抗体后，本领域人员可通过多种途径来灵敏地检测样品中是否存在O3:K6血清型副溶血性弧菌或其浓度，采用的技术可以是免疫学领域中常用的技术。包括定性检测和定量检测方法。较佳地，所述的定性检测包括：通过免疫印迹方法或免疫荧光的方法鉴定O3:K6血清型副溶血性弧菌的存在情况；例如通过ELISA法、免疫胶体金试纸条、免疫荧光试纸条、均相酶免疫等方法对O3:K6血清型副溶血性弧菌进行测定。
作为本发明的一种检测方式，采用间接ELISA法，将待测的抗原包被于固相载体上，利用本发明的单克隆抗体进行检测。
所述的固相载体的包括但不限于：试纸或试纸条，微球，玻片，孔板(如 48孔板，96孔板)，芯片等。
作为本发明的一种进一步优选的方式，根据双抗夹心法的原理来实施检测。所述的双抗夹心法是将捕获抗体(本发明的抗O3:K6血清型副溶血性弧菌的抗体)固定于载体，然后使捕获抗体与抗原反应，洗涤后再与检测抗体反应，所述的检测抗体携带可检测信号的所述抗O3:K6血清型副溶血性弧菌的抗体)，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。
本发明的单克隆抗体可用于制备识别/检测O3:K6血清型副溶血性弧菌的试剂或试剂盒。以所述的单克隆抗体为基础，可制备方便、快速且准确地检测O3:K6血清型副溶血性弧菌的试剂盒。
因此，本发明提供了一种用于检测样品中是否存在O3:K6血清型副溶血性弧菌的检测试剂盒，该试剂盒中含有本发明的抗O3:K6血清型副溶血性弧菌的单克隆抗体。
为了在检测时更方便，所述试剂盒中除了含有本发明的单克隆抗体以外，还可以包含其它检测试剂或辅助试剂，所述的辅助试剂例如是ELISA试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的，如显色剂、增敏剂、杂交液、抗原修复液、封闭液、PBS、二甲苯、乙醇、H2O2甲醇液等等。本领域人员应理解，各种变化形式的检测试剂盒均是包含在本发明中的，只要在其中利用了本发明的单克隆抗体作为识别O3:K6血清型副溶血性弧菌的试剂。此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。
在获得了本发明提供的单克隆抗体和/或试剂盒后，可以利用多种免疫学相关方法来检测样品中O3:K6血清型副溶血性弧菌存在情况或其存在量，从而得知待测样品的供体是否含有副溶血性弧菌，这些方法均被包含在本发明中。较佳地，所述的方法是以非疾病诊断为目的的。
作为一种优选方式，本发明提供一种体外(非诊断或治疗性地)检测副溶血性弧菌的方法，包括以下步骤：
(a1)将所述抗O3:K6血清型副溶血性弧菌的抗体(包被抗体)包被于固相载体；
(a2)将待测样品加样于(a1)的固相载体，从而使待测样品中的副溶血性弧菌与包被抗体结合，形成带有“O3:K6血清型副溶血性弧菌-包被抗体”二元复合物的固相载体；
(a3)将携带可检测标记物的所述抗体加样于加样于(a2)的固相载体，形成带有“检测抗体-O3:K6血清型副溶血性弧菌-包被抗体”复合物的固相载体；
(a4)检测(a3)复合物中的标记物，确定待检测样品中O3:K6血清型副溶血性弧菌的存在与否以或存在的量。
作为一种测定方法，可通过设置已知浓度的抗原对照，制作浓度标准曲线，之后比照浓度标准曲线就可以得出待测样品中的副溶血性弧菌含量。
作为本发明的优选方式，所述的单克隆抗体被制备于一种测试件(包括测试板或测试条等)上，其包括固相载体(通常为玻璃、纸、塑料或膜材料)，以及附着于所述固相载体上的所述的单克隆抗体，如试纸或试纸条。更优选地，所述的单克隆抗体被制备成免疫胶体金测试板或免疫荧光试纸条。
作为本发明的优选方式，所述的测试板包含固相载体(如支撑板)、样品垫、吸附有胶体金标记(或荧光标记)的抗体的金标垫(结合物垫)，含有检测线(T)和质控线(C)的分析膜，以及吸水垫。在检测线上包被有单克隆抗体，质控线上包被有与抗体免疫原相同的羊抗鼠第二抗体。应用免疫层析双抗体夹心法原理检测待测样品。以胶体金免疫层析技术构建的测试板与传统的检测方法相比还具有如下优点：a.操作简单，不需特殊设备，不需专业技术人员操作；b.
方便快捷，只需5-10分钟即可得出结果，可迅速采取应对措施；c.经济实惠，可用于对大量样品进行筛选。以上这些性能特征都为其商品化提供了现实的开发和应用前景。
本领域技术人员均了解，细菌包含有多种蛋白抗原，每种抗原可能含有多个抗原表位(抗原决定簇)，因此，针对一种细菌可以获得难以计数的抗体，这些抗体对抗原(细菌)的结合特性(如特异性等)均可能是不同的。因此，针对一种细菌，往往需要进行大量的反复比较、筛选和鉴定，才能找到适合于特异性结合、并适用于产业化应用的单抗。本发明筛选获得的抗体具有良好的检测效果，可准确鉴定出O3:K6血清型副溶血性弧菌，及时避免其从食物或水进入餐桌，降低消费者感染O3:K6血清型副溶血性弧菌的几率，从而降低微生物性的食源性疾病的发生。此外，O3:K6血清型副溶血性弧菌快速检测技术还可应用于制备临床诊断试剂，指导临床用药。
本发明的主要优点在于：
(1)提供了一种具有全新具有特异性识别O3:K6血清型副溶血性弧菌能力的单克隆抗体，其对于O3:K6血清型副溶血性弧菌具有特异性，而对于该血清型以外的副溶血性弧菌以及其它近缘种属的菌株则无交叉反应性，特异性非常高。
(2)所述的抗体即可以作为检测抗体，又可以作为包被抗体，特别适用于双抗夹心法ELISA检测。
(3)应用所述的抗体检测待测样本中副溶血性弧菌的灵敏度可达1-10 CFU/25g，灵敏度非常高。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、单克隆抗体的筛选
针对多种多样的微生物菌株，本发明人致力于寻找实现副溶血性弧菌的特异性鉴定、能避免其它菌株的交叉干扰的抗体。由于菌株自身存在非常多的蛋白，而其作为免疫原的免疫效果差异很大，本发明人分离了副溶血性弧菌的多种蛋白，以它们作为免疫原制备抗体，考察所获得的抗体的特异性。经过广泛地实验和论证，确定了以外膜蛋白U(OMPU)作为免疫原以及由此筛选获得的特异性抗体。
1、免疫小鼠，筛选出抗副溶血性弧菌的单克隆抗体
杂交瘤细胞株筛选方法：将经表达纯化的OMPU蛋白(即VPA0526， NC_004605.1)经腹腔免疫注射6～8周大的Balb/c雌性小鼠，每只小鼠免疫 6次，每次免疫间隔2周。首次免疫剂量100μg/只，后面5次免疫剂量50μg/ 只。最后一次免疫三天后检测小鼠血清效价，取血清效价>10万的小鼠脾脏与SP2/0细胞进行杂交瘤细胞融合，融合7～10天后，采用间接ELISA筛选分泌抗副溶血性弧菌抗体的杂交瘤细胞。本发明人进行了先后3轮“亚克隆- 筛选”循环，获得抗副溶血性弧菌的阳性杂交瘤细胞株。
为筛选出只检测O3:K6血清型副溶血性弧菌的杂交瘤细胞株，本发明人运用间接ELISA试验，对筛选出副溶血性弧菌阳性杂交瘤细胞株进一步进行筛选，以期找到理想杂交瘤细胞株。
经过大量筛选工作，本发明人获得了一株特异性良好、无交叉反应的杂交瘤细胞株，其产生的抗体称为VP48A。
将获得的杂交瘤细胞株接种6～8周龄的F1小鼠，制备腹水。采用ELISA 方法检测腹水的效价，VP48A腹水的效价>512,000。
实施例2、应用本发明的抗体进行O3:K6型副溶血性弧菌特异性检测
1、ELISA方法分析抗体的效价
副溶血性弧菌(ATCCBAA-239)经富集培养后，收集菌体，0.01M PB悬浮菌体，煮沸10分钟后，将其浓度调整为OD600为0.2包被96孔酶标板过夜， 1％的明胶37℃封闭2小时，加入1:10000稀释的羊抗鼠二抗反应45min，显色，OD450读值。结果如表1。
表1
Figure BDA0002374753830000101
Figure BDA0002374753830000111
根据表1，本发明的VP48A抗体在稀释1024000倍后，仍然能检测到副溶血性弧菌，抗体效价达到1024000。
(3)Sandwich ELISA分析抗体的检测灵敏度
109CFU/ml副溶血性弧菌(ATCCBAA-239)煮沸10分钟后，倍比稀释至 105CFU/ml，作为待检测物。
将VP48A单抗用辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)标记，获得HRP标记的VP48A(VP48A-HRP)。将该VP48A-HRP作为检测抗体，VP48A抗体作为包被抗体。针对待测样品，进行基于Sandwich ELISA方法的检测。
结果显示，VP48A抗体作为包被抗体，VP48A-HRP作为检测抗体，检测富集培养后的副溶血性弧菌菌体浓度的灵敏度达到105CFU/mL，如表2。
表2
Figure BDA0002374753830000112
实施例3、抗体的种间特异性分析
以副溶血性弧菌(ATCCBAA-239)以及27种其它类型的菌株(表3)作为检测对象，测试本发明的抗体的交叉反应性。样品处理：将表3中的菌株，经培养后收集菌体，PBS稀释至109CFU/ml，煮沸10分钟后作为检测对象。
将实施例1制备的VP48A单抗作为包被抗体，将该VP48A-HRP作为检测抗体，进行基于Sandwich ELISA方法的检测，结果如表3，其中，++， OD450>1.5；-，OD450<0.1。
表3
Figure BDA0002374753830000121
Figure BDA0002374753830000131
结果显示，VP48A抗体作为包被抗体，VP48A-HRP作为检测抗体，仅与O3:K6型副溶血性弧菌反应，与非副溶血性弧菌菌株不发生交叉反应。
由于同一种属细菌中共用大量的同源蛋白，细菌抗体极易与同一菌属中的其他细菌发生交叉反应，如副溶血性弧菌抗体易与表3中的弧菌属细菌河流弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、拟态弧菌、霍乱弧菌、哈氏弧菌、弗氏弧菌、溶藻弧菌、坎氏弧菌等发生交叉反应；此外，不同种属之间的细菌也共用一些同源蛋白，细菌抗体也易与表3中的其他菌属抗体发生交叉反应。而本发明则有效改变了这一状况。
实施例4、抗体的种内特异性分析
以32株不同分离来源的O3:K6血清型副溶血性弧菌和47株其他血清型的副溶血性弧菌(表4)为检测对象，而与其它血清型测试本发明的抗体的种内特异性。
样品处理：将下表中的菌株，经培养后收集菌体，PBS稀释至109CFU/ml, 煮沸10分钟后作为检测对象。
将实施例1制备的VP48A单抗作为包被抗体，将该VP48A-HRP作为检测抗体，进行基于Sandwich ELISA方法的检测。
Sandwich ELISA结果，VP48A抗体作为包被抗体，VP48A-HRP作为检测抗体检测不同血清型副溶血性弧菌。结果如表4，+++：OD450>2.0，++：OD450>1.5，-：OD450<0.1。
表4
Figure BDA0002374753830000141
Figure BDA0002374753830000151
Figure BDA0002374753830000161
上述结果显示，VP48A/VP48A-HRP抗体对只识别O3:K6型副溶血性弧菌，与其他血清型副溶血性弧菌无反应。
实施例5、食品检测应用
本实施例中，以VP48A抗体作为包被抗体，VP48A-HRP作为检测抗体应用检测副溶血性弧菌含量在1-10CFU/25g食品。
实验方法：称取25g三文鱼，在无菌条件下剪碎加入无菌袋，用均质仪拍打均匀后加入225ml 3％NaCL LB培养基。取副溶血性弧菌 (ATCCBAA-239)，过夜培养后，稀释至1-10CFU接种到上述培养基中，37℃培养过夜，取1mL培养上清，收集细菌，加入1mL PBS煮沸，检测Sandwich ELISA的灵敏度。
结果显示，以VP48A抗体作为包被抗体，VP48A-HRP作为检测抗体，进行SandwichELISA的检测灵敏度是1-10CFU/25g食品，如表5。
表5
1-10CFU/25g PBS
+++ -
这一结果说明，VP48A/VP48A-HRP抗体对能够准确检测食品中的副溶血性弧菌，灵敏度达1-10CFU/25g，说明食品中的副溶血性弧菌只要能在培养基中富集生长，VP48A抗体就能够检测出来。
实施例6、VP48A胶体金试纸条的制备及检测
1、VP48A胶体金试纸条的制备
将1mg/mL的VP48A单克隆抗体按喷量1.0μL/cm包被到硝酸纤维素膜上，作为T线；同时将原浓度为1.0mg/mL的羊抗鼠二抗按喷量1.0μL/cm也包被到硝酸纤维素膜上，作为C线，
37℃烘箱干燥45min；将VP48A用20nM的胶体金标记后，用VP48A 金标抗体喷量3.0μL/cm的胶体金结合垫和空白样品垫组装成试纸条。
2、利用VP48A胶体金试纸条检测O3:K6血清型副溶血性弧菌
将O3:K6血清型副溶血性弧菌VP48A抗体的分别接种于墨鱼肉、墨鱼内脏、墨鱼须和墨鱼汁，接种量为1-10CFU/mL，作为待测样品。将待测样品滴加于前述制备的VP48A胶体金试纸条，观测反应情况；设置对照组，仅滴加未接种副溶血性弧菌的培养基。
结果如图1所示，接种了墨鱼肉、墨鱼内脏、墨鱼须和墨鱼汁的试纸条呈阳性，而检测未接种的培养基结果呈阴性。VP48A胶体金试纸条可用于检测O3:K6血清型副溶血性弧菌。
综上，本发明的抗体与从不同分离来源的32株O3:K6型副溶血性弧菌均呈阳性反应(实施例4)，而与47株其它血清型的副溶血性弧菌无交叉反应 (实施例4)，且与其它非副溶血性弧菌不具有交叉反应性。本发明人测试的非副溶血性弧菌多达27株，包括霍乱弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、创伤弧菌、哈氏弧菌、弗氏弧菌、坎氏弧菌、沙门氏菌等(实施例3)。
生物材料的保藏
本发明的杂交瘤细胞株VP48A已在中国典型培养物保藏中心(中国武汉，武汉大学)保藏，保藏日期：2020年1月8日，其保藏编号为CCTCC NO: C202023。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.一种单克隆抗体，其是由保藏号为CCTCC NO:C202023的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
2.一种杂交瘤细胞株，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号是CCTCC NO:C202023。
3.权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求2所述的杂交瘤细胞株的用途，用于制备特异性地识别或检测O3:K6型副溶血性弧菌的检测试剂或检测试剂盒。
4.一种免疫缀合物，其特征在于，所述的免疫缀合物包括：
权利要求1所述的单克隆抗体；以及
与所述单克隆抗体连接的可检测标记物；较佳地，所述可检测标记物包括：荧光标记物、显色标记物；更佳地包括：辣根过氧化物酶、生物素、胶体金或荧光等可适合于抗体标记的可检测标记物。
5.一种用于特异性识别或检测O3:K6型副溶血性弧菌的试剂盒，其包括：
权利要求1所述的单克隆抗体，
权利要求2所述的杂交瘤细胞株；和/或
权利要求4所述的免疫缀合物。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：捕获抗体和检测抗体；其中所述捕获抗体为权利要求1所述的单克隆抗体，所述检测抗体为权利要求4所述的免疫缀合物。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的捕获抗体被固定在固相载体上；较佳地，所述固相载体包括：试纸、微球、包被板、玻片或芯片；较佳地，所述的试纸为胶体金试纸。
8.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：
与标记物相对应的底物；
显色剂；
洗涤液；和/或
终止液。
9.一种离体非诊断性地识别或检测O3:K6型副溶血性弧菌的方法，利用权利要求1所述的单克隆抗体作为包被抗体捕获待测样品，利用权利要求4所述的免疫缀合物检测，获得O3:K6型副溶血性弧菌的存在情况以及存在量。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的待测样品不是直接来自动物或人的样品；较佳地所述的待测样品包括：食品、水生动植物或其加工产物、临床样本等。
11.一种用于检测O3:K6型副溶血性弧菌的测试件，其特征在于，其包括固相载体，以及附着于所述固相载体上的权利要求1所述的单克隆抗体；较佳地，所述的测试件为测试试纸；更佳地，其是免疫胶体金测试试纸。
12.一种制备包含权利要求1所述的单克隆抗体的免疫胶体金测试试纸的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将权利要求1所述的单克隆抗体以0.5～2mg/mL的包被浓度点到硝酸纤维素膜上，羊抗鼠二抗以0.5～2mg/ml作为Control点到硝酸纤维素膜上；干燥；
(2)将权利要求1所述的单克隆抗体以胶体金标记，点到经干燥的硝酸纤维素膜上。
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