CN105154469A - 一种提高大豆发状根阳性转化率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高大豆发状根阳性转化率的方法。本发明的方法包括如下步骤：1)将外源DNA导入植物外植体，得到转入后外植体；2)将所述转入后外植体依次经过发芽培养、恢复培养和诱导培养，得到转基因发状根；所述诱导培养的培养体系为含有草丁膦的培养体系。通过试验证明：本发明的方法降低了获得的发状根中非转基因发状根的数量和比例，提高了转基因发状根的比例，减少了后期的筛选、鉴定工作量，提高工作效率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高大豆发状根阳性转化率的方法。
背景技术
大豆(GlycinemaxL.Merr.)是重要的粮油兼用作物，也是目前转基因品种种植面积最大的作物。2013年，全球转基因大豆的种植面积已达8450万公顷，约占世界大豆种植总面积的79％，转基因技术已成为大豆新品种培育的重要手段。目前使用较为广泛的大豆转化体系，以根癌农杆菌介导的子叶节转化体系和基因枪介导的幼胚转化体系为主。但两个转化体系均存在转化周期较长、转化效率较低等问题，不利于目标基因在大豆中育种应用价值快速评估工作的开展。
近年来，随着基因功能分析研究需求的不断增加，发根农杆菌介导的大豆发状根转化体系越来越受到重视。该转化体系具有转化周期短、转化效率高、单细胞分化而来的发状根变异性低等突出优点。尽管目前尚不能用这种方法获得转基因再生植株，但已在固氮、抗病、耐盐等与根系密切相关的基因功能分析和育种价值评价等方面发挥了重要作用。利用适宜的培养条件，还可将诱导出的发状根进一步诱导出愈伤组织，从而进一步拓展基因功能分析的范围。
常用的大豆发状根转化体系，在转化过程中不使用筛选剂对转化体进行筛选，尽管能够产生较多的发状根，但由于其中非转化体的频率通常高达70％以上，后期需对其进行大量的鉴定工作，识别出转基因发状根用于后续研究和工作，鉴定工作量巨大，费时、费力。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种使外源DNA导入植物产生发状根的方法。
本发明提供的使外源DNA导入植物产生发状根的方法包括如下步骤：
1)将外源DNA导入植物外植体，得到转入后外植体；
2)将所述转入后外植体进行诱导培养，得到带有发状根的外植体；
所述诱导培养的培养体系为含有草丁膦的培养体系。
上述方法中，所述草丁膦在所述培养体系中的浓度为1.5-2.5mg/L。
上述方法中，所述草丁膦在所述培养体系中的浓度为2mg/L。
上述方法中，所述含有草丁膦的培养体系为含有草丁膦的1/2MS固体诱导培养基。
上述方法中，所述含有草丁膦的1/2MS固体诱导培养基为将草丁膦、1/2MS液体培养基和凝固剂混匀得到的培养基。
上述方法中，所述诱导培养的温度为22-26℃；
所述诱导培养的光量子为100-150mol/m2s；
所述诱导培养的光照周期为16h光照/8h黑暗；
所述诱导培养的时间为23-27天。
上述方法中，在步骤1)和2)之间，还包括将所述转入后外植体进行恢复培养的步骤。
所述恢复培养采用的培养基为1/2MS固体培养基，采用的培养条件为24℃、光量子为100-150mol/m2s、光照周期为16h光照/8h培养2d。
上述方法中，步骤1)中，所述外源DNA通过农杆菌介导导入植物外植体。
上述方法中，所述植物外植体为植物的子叶；
所述外源DNA为GUS基因；
所述外源DNA通过重组菌与所述植物外植体共培养，实现导入植物外植体。
上述方法中，所述重组菌为将重组载体pGFPGUS-bar导入农杆菌得到的菌；
所述重组载体pGFPGUS-bar为将bar基因表达盒插入表达载体的多克隆位点中得到的载体。
上述方法中，所述农杆菌为发根农杆菌；所述发根农杆菌具体为发根农杆菌K599；所述表达载体为pGFPGUSplus载体。
所述重组载体pGFPGUS-bar为将pGFPGUSplus载体的EcoRI和XhoI酶切位点间的DNA片段替换为bar基因表达盒，且保持pGFPGUSplus载体的其他序列不变得到的载体。
本发明的另一个目的是提供一种使外源DNA导入植物产生发状根的培养体系。
本发明提供的使外源DNA导入植物产生发状根的培养体系包括含有草丁膦的1/2MS固体诱导培养基；所述草丁膦在所述含有草丁膦的1/2MS固体诱导培养基中的浓度为1.5-2.5mg/L。
上述培养体系中，所述草丁膦在所述含有草丁膦的1/2MS固体诱导培养基中的浓度为2mg/L。
本发明还有一个目的是提供上述方法或上述培养体系的新用途。
本发明提供了上述方法或上述培养体系在提高植物发状根的阳性转化率中的应用。
上述应用中，所述发状根的阳性转化率的计算公式＝导入外源DNA的发状根的个数/发状根的个数。
上述方法或上述培养体系或上述应用中，所述植物为双子叶植物；所述双子叶植物为大豆。
本发明提供了一种提高植物发状根的阳性转化率的方法。本发明将外源DNA导入大豆子叶中，然后依次经过发芽培养、恢复培养和诱导培养，诱导培养的培养体系为含有草丁膦的培养体系，最后得到转基因发状根。通过试验证明：本发明的提高植物发状根的阳性转化率的方法降低了发状根中非转基因发状根的数量和比例，提高了转基因发状根的比例，减少了后期的筛选、鉴定工作量，提高工作效率。
附图说明
图1为重组质粒pGFPGUS-bar的结构示意图。
图2为经过草丁膦适宜筛选临界浓度筛选后所获发状根的GUS检测。其中，CK：非转化发状根的GUS检测；A：吉林小粒1号；B：吉育47；C：中黄30。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的大豆品种吉林小粒1号：吉林省农业科学院于1979年以栽培品种平顶四为母本，半野生大豆GD50477为父本，通过种间有性杂交，经系统选育而成。1988年吉林省粮油食品进出口公司将该品系命名为吉林小粒1号，1990年经吉林省农作物品种审定委员会认定推广。“吉林小粒1号”在国家农作物种质保存中心(依托单位为中国农业科学院作物科学研究所)长期保存，可免费提供给国内从事大豆科研工作的研究人员使用；“吉林小粒1号”在文献“吉林省农业科学院大豆研究所主编.中国大豆品种志(1978-1992)，农业出版社，1993年5月第1版，96-97”中公开过；公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
下述实施例中的大豆品种吉林47(吉育47)：吉林省农业科学院1990年以海交8403-74为母本，[合丰25×(吉林20×鲁豆4号)F1]F1为父本进行有性杂交，采用系谱法选育而成。1999年经吉林省农作物品种审定委员会审定推广，又名吉育47。“吉林47”在国家农作物种质保存中心(依托单位为中国农业科学院作物科学研究所)长期保存，可免费提供给国内从事大豆科研工作的研究人员使用；“吉林47”在文献“国农业科学院作物科学研究所、吉林省农业科学院大豆研究中心主编.中国大豆品种志(1993-2004)，中国农业出版社，2007年12月第1版，123”中公开过；公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
下述实施例中的大豆品种中黄30：中国农业科学院作物科学研究所以中品661为母本、中黄14为父本进行有性杂交，采用摘荚法选育而成。2006年通过国审，2009年通过北京市审定，品种权号为CNA20060446.5。“中黄30”在国家农作物种质保存中心(依托单位为中国农业科学院作物科学研究所)长期保存，可免费提供给国内从事大豆科研工作的研究人员使用；“中黄30”在文献“黄玉锋，王康宁.大豆中黄30栽培密度研究.宁夏农林科技,2012,53(04):8-9”中公开过；公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
下述实施例中的pGFPGUSplus载体在文献“ClaudiaE.Vickers,PeerM.Schenk,DongxueLi,etal.pGFPGUSPlus,anewbinaryvectorforgeneexpressionstudiesandoptimisingtransformationsystemsinplants.BiotechnolLett,2007,29:1793–1796”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
下述实施例中的pTF101.1载体在文献“PazM,ShouH,GuoZ,ZhangZ,BanerjeeA,etal.AssessmentofconditionsaffectingAgrobacterium-mediatedsoybeantransformationusingthecotyledonarynodeexplant.Euphytica.2004；136:167–179”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
下述实施例中的发根农杆菌K599在文献“ClaudiaE.Vickers,PeerM.Schenk,DongxueLi,etal.pGFPGUSPlus,anewbinaryvectorforgeneexpressionstudiesandoptimisingtransformationsystemsinplants.BiotechnolLett,2007,29:1793–1796”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
下述实施例中的发芽培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度如下：3.12g/LB5盐(GAMBORGBASALSALTMIXTURE：购自Phytotech公司，货号G768)、30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂。
下述实施例中的共培养培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度如下：0.43g/LMS盐(MURASHIGE&SKOOGBASALSALTMIXTURE：购自Phytotech公司，货号M524)、200mM乙酰丁香酮、150mg/L二硫苏糖醇、100mg/L半胱氨酸、30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂、3.9mg/L2-吗啉乙磺酸，pH＝5.4。
下述实施例中的1/2MS液体诱导培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度如下：2.17g/LMS盐(MURASHIGE&SKOOGBASALSALTMIXTURE：购自Phytotech公司，货号M524)、0.6mg/L2-吗啉乙磺酸、250mg/L头孢霉素、250mg/L羧苄青霉素、30g/L蔗糖，pH＝5.8；
下述实施例中的1/2MS固体诱导培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度如下：2.17g/LMS盐(MURASHIGE&SKOOGBASALSALTMIXTURE：购自Phytotech公司，货号M524)、0.6mg/L2-吗啉乙磺酸、250mg/L头孢霉素、250mg/L羧苄青霉素、30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂，pH＝5.8；
下述实施例中的草丁膦(Phosphinothricin，PPT)是Sigma公司的产品。
下述实施例中的GUS染液的配制方法：将80ml磷酸钠缓冲液、1ml铁氰化钾母液、1ml亚铁氰化钾母液、2mlEDTA母液、5mlx-Gluc溶液和20ml甲醇混匀得到的，避光保存。
下述实施例中的x-Gluc溶液是将100mgx-Gluc(-20℃保存)溶于5ml二甲基亚砜得到的。
下述实施例中的磷酸钠缓冲液(pH7.0)是将39mlA液与61mlB液混匀，并用蒸馏水定容至400ml得到的；A液：将3.12gNaH2PO4.2H2O溶于蒸馏水并用蒸馏水定容至100ml(浓度为0.2mol/L)；B液：将7.17gNa2HPO4.12H2O溶于蒸馏水并用蒸馏水定容至100ml(浓度为0.2mol/L)。
下述实施例中的铁氰化钾母液是将3.295g铁氰化钾溶于蒸馏水并用蒸馏水定容至200ml(浓度为50mmol/L)得到的，避光保存。
下述实施例中的亚铁氰化钾是将4.224g亚铁氰化钾溶于蒸馏水并用蒸馏水定容至200ml(浓度为50mmol/L)得到的，避光保存。
下述实施例中的EDTA母液(pH8.0)的配制方法：称取EDTA-Na2·2H2O18.6g，加入6gNaOH，用约80ml超纯水溶解并定容为100ml(终浓度为0.5mol/L)。
下述实施例中的YEP液体培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度如下：酵母提取物(Yeastextract)5g/L，胰化蛋白胨(Tryptone)10g/L，氯化钠5g/L，卡那霉素50mg/L。
实施例1、不同大豆品种对草丁膦的敏感性测定实验
一、农杆菌制备
将发根农杆菌K599接种于YEP液体培养基，28℃、270rmp振荡培养，得到OD600＝0.6-0.8的农杆菌菌液。
二、外植体制备、侵染与培养
1、种子灭菌
取无病虫害和斑点、饱满、均一、干燥的吉林小粒1号、吉林47(吉育47)以及中黄30种子，完全平铺在培养皿中，加盖培养皿盖并封口，然后将培养皿放入干燥器中；并在干燥器中放入100ml容量的烧杯，倒入80ml次氯酸钠水溶液(次氯酸钠浓度为12M)，再慢慢加入4ml浓盐酸；然后迅速盖上干燥器，用凡士林密封灭菌，放置16h。
2、发芽培养
灭菌结束后，取出培养皿，在超净台中打开培养皿盖，释放残余氯气；然后用镊子夹取种子，在超净台中将种子接种于发芽培养基上，盖上培养皿但不封口，在温度为24℃，光量子为100-150mol/m2s的条件下进行发芽培养，培养时间为5d(每天光照16小时，黑暗8小时)，得到发芽培养后的种子。
3、侵染及共培养
(1)用镊子剥去发芽培养后的种子的种皮，切除部分下胚轴(剩余部分还保留3-5mm的下胚轴)，在剩余部分的子叶节点(又称子叶基部)处平行划伤5-7次，得到划伤的外植体。
(2)将划伤的外植体置于步骤一制备的农杆菌菌液中，浸泡30min后倒掉菌液，将子叶内面(平滑面)向下，平铺于已铺有无菌滤纸的共培养培养基上，置于温度22℃，光照周期为16h光照/8h黑暗的光照培养箱中培养5d，得到共培养后的外植体(转入后外植体)。
(3)恢复培养
将步骤(2)获得的共培养后的外植体用1/2MS液体培养基清洗3-4遍，再用1/2MS液体培养基浸泡30min，然后倒掉培养基；用无菌滤纸吸干培养液；然后将外植体内面(平滑面)向上斜插入1/2MS固体培养基中，透气膜封口，然后在温度为24℃、光量子为100-150mol/m2s、光照周期为16h光照/8h黑暗的培养条件下进行恢复培养，培养时间为2d，得到恢复培养后的外植体。
三、发状根的诱导培养
将步骤(2)获得的恢复培养后的外植体，分别移入含有0、1、2、3、4、5、6、7、8mg/L草丁膦的1/2MS固体诱导培养基中，在温度为24℃、光量子为100-150mol/m2s、光照周期为16h光照/8h黑暗的培养条件下进行诱导培养，诱导培养25天后统计产生发状根的数量。每个草丁膦浓度处理20个外植体，重复3次。
四、草丁膦对不同大豆品种在发状根诱导阶段的敏感性分析
不同浓度草丁膦处理对不同品种未诱导出发状根子叶节平均数、诱导产生的发状根数量的平均数的统计分析结果如表1所示。
从表1可以看出：在发状根诱导阶段，通过草丁膦筛选能够明显降低诱导出发状根的数量及能够产生发状根的子叶数量，且不同品种对草丁膦的耐受性并未存在差异，当草丁膦浓度达到2mg/L时，均能有效地抑制3个大豆品种诱导产生发状根。因此选择0、2mg/L的草丁膦浓度来研究草丁膦对大豆发状根阳性转化率的影响。
表1、草丁膦对不同大豆品种发状根诱导的影响
注：每个处理20个子叶外植体，重复3次。
实施例2、一种提高发状根阳性转化率的方法
一、重组质粒pGFPGUS-bar的构建
用限制性内切酶EcoRI和XhoI对pTFT101.1载体进行双酶切，回收得到大小为2170bp的bar基因表达盒；用限制性内切酶EcoRI和XhoI对pGFPGUSplus载体进行双酶切，回收得到大小为11607bp的骨架载体，连接大小为2170bp的bar基因表达盒和大小为11607bp的骨架载体，得到重组质粒pGFPGUS-bar，其结构如图1所示。重组质粒pGFPGUS-bar的T-DNA区含有GUS、GFP和bar基因表达盒。
对重组质粒pGFPGUS-bar进行测序验证，结果表明：重组质粒pGFPGUS-bar为将pGFPGUSplus载体的EcoRI和XhoI酶切位点间的DNA片段替换为bar基因表达盒，且保持pGFPGUSplus载体的其他序列不变得到的载体。
二、农杆菌制备
1、将步骤一制备的重组质粒pGFPGUS-bar转化发根农杆菌K599感受态细胞，得到重组农杆菌pGFPGUS-bar/K599。
2、将重组农杆菌pGFPGUS-bar/K599接种于YEP液体培养基，28℃、260rmp振荡培养，得到OD600＝0.6-0.8的重组农杆菌pGFPGUS-bar/K599菌液。
三、外植体制备、侵染与培养
1、种子灭菌
取无病虫害和斑点、饱满、均一、干燥的吉林小粒1号、吉林47(吉育47)以及中黄30种子，完全平铺在培养皿中，加盖培养皿盖并封口，然后将培养皿放入干燥器中；并在干燥器中放入100ml容量的烧杯，倒入80ml次氯酸钠水溶液(次氯酸钠浓度为12M)，再慢慢加入4ml浓盐酸；然后迅速盖上干燥器，用凡士林密封灭菌，放置16h。
2、发芽培养
灭菌结束后，取出培养皿，在超净台中打开培养皿盖，释放残余氯气；然后用镊子夹取种子，在超净台中将种子接种于发芽培养基上，盖上培养皿但不封口，在温度为24℃，光量子为100-150mol/m2s的条件下进行发芽培养，培养时间为5d(每天光照16小时，黑暗8小时)，得到发芽培养后的种子。
3、侵染及培养
(1)外植体的处理
用镊子剥去发芽培养后的种子的种皮，切除部分下胚轴(剩余部分还保留3-5mm的下胚轴)，在剩余部分的子叶节点(又称子叶基部)处平行划伤5-7次，得到划伤的外植体。
(2)外植体侵染及共培养
将划伤的外植体置于步骤二制备的重组农杆菌pGFPGUS-bar/K599菌液中，浸泡30min后倒掉菌液，将子叶内面(平滑面)向下，平铺于已铺有无菌滤纸的共培养培养基上，置于温度22℃，光照周期为16h光照/8h黑暗的光照培养箱中培养5d，得到共培养后的外植体。
(3)外植体的恢复培养
将步骤(2)获得的共培养后的外植体用1/2MS液体培养基清洗3-4遍，再用1/2MS液体培养基浸泡30min，然后倒掉培养基；用无菌滤纸吸干培养液；然后将外植体内面(平滑面)向上斜插入1/2MS固体培养基中，透气膜封口，然后在温度为24℃、光量子为100-150mol/m2s、光照周期为16h光照/8h黑暗的培养条件下进行恢复培养，培养时间为2d，得到恢复培养后的外植体。
四、发状根的筛选培养
将步骤三获得的恢复培养后的外植体，分别移入含有0、2mg/L草丁膦的1/2MS固体诱导培养基中进行筛选培养，在温度为24℃、光量子为100-150mol/m2s、光照周期为16h光照/8h黑暗的培养条件下进行进行诱导培养，诱导培养25d后，得到筛选培养后的发状根，对筛选培养后的发状根进行染色并统计产生发状根的数量和GUS染色呈阳性的发状根(转基因发状根)数量。每个草丁膦浓度处理50个外植体，重复3次。
发状根GUS染色(β-葡萄糖醛酸糖苷酶显色反应)的具体步骤：切下筛选培养后的发状根，并将筛选培养后的发状根上部的一段浸入GUS染液中(确保发状根根尖不损伤)，将筛选培养后的发状根下端按顺序平放于1/2MS固体培养基上，在37℃培养箱培养1d，显示蓝色的筛选培养后的发状根为GUS检测阳性，即为转基因发状根。
五、草丁膦筛选对转基因发状根阳性率的影响
筛选培养后的发状根的数量统计结果如表2所示，其中阳性发状根是指GUS染色呈阳性的发状根，发状根的阳性率＝GUS染色呈阳性的发状根的个数/发状根的个数。由表2可见：在不添加任何筛选压的条件下，子叶诱导出发状根的阳性率为23-29％，而当在诱导培养基中加入2mg/L草丁膦筛选压后，子叶诱导出发状根的阳性率表现出了显著的上升，为87-93％，2mg/L草丁膦筛选压诱导出的发状根的阳性率明显高于不添加任何筛选压诱导出的发状根的阳性率。说明本发明用2mg/L草丁膦对发状根的筛选培养不仅可以提高子叶诱导出的发状根的阳性率，还可以降低后期对发状根进行鉴定的工作量。
表2、草丁膦筛选压下转基因发状根的个数及阳性率的统计分析
Claims (10)
1.一种使外源DNA导入植物产生发状根的方法，包括如下步骤：
1)将外源DNA导入植物外植体，得到转入后外植体；
2)将所述转入后外植体进行诱导培养，得到带有发状根的外植体；
所述诱导培养的培养体系为含有草丁膦的培养体系。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述草丁膦在所述培养体系中的浓度为1.5-2.5mg/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述草丁膦在所述培养体系中的浓度为2mg/L；
所述含有草丁膦的培养体系为含有草丁膦的1/2MS固体诱导培养基。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：
所述诱导培养的温度为22-26℃；
所述诱导培养的光量子为100-150mol/m2s；
所述诱导培养的光照周期为16h光照/8h黑暗；
所述诱导培养的时间为23-27天。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：在步骤1)和2)之间，还包括将所述转入后外植体进行恢复培养的步骤。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述外源DNA通过农杆菌介导导入所述植物外植体。
7.一种使外源DNA导入植物产生发状根的培养体系，包括含有草丁膦的1/2MS固体诱导培养基；
所述草丁膦在所述含有草丁膦的1/2MS固体诱导培养基中的浓度为1.5-2.5mg/L。
8.根据权利要求7所述的培养体系，其特征在于：所述草丁膦在所述含有草丁膦的1/2MS固体诱导培养基中的浓度为2mg/L。
9.权利要求1-6中任一所述的方法或权利要求7或8所述的培养体系在提高植物发状根的阳性转化率中的应用。
10.根据权利要求1-6中任一所述的方法或权利要求7或8所述的培养体系或权利要求9所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物；所述双子叶植物为大豆。
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