CN105153319B - 一种黄精β-半乳聚糖及其制备方法和抗炎方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄精β‑半乳聚糖HJW0S300‑2，其中聚糖的结构式如下：分子量范围在8‑15KDa，其平均分子量Mw为10KDa。本发明还涉及上述黄精β‑半乳聚糖的制备方法及其抗炎方面的应用。

Description

一种黄精β-半乳聚糖及其制备方法和抗炎方面的应用

技术领域

本发明涉及中草药提取多糖，更具体地说，涉及一种从黄精中提取分离纯化得到的β-半乳聚糖HJW0S300-2以及其制备方法和应用。本发明涉及从中草药黄精分离纯化得到的β-半乳聚糖HJW0S300-2的抗炎作用。具体涉及该多糖在制备用于缓解或治疗炎症相关的药物，保健品及化妆品中的用途。

背景技术

黄精(Polygonatum sibiricum)，又名老虎姜、鸡头姜，为百合科黄精属多种植物的干燥块茎。黄精具有滋肾养阴，补中益气，延年益寿等功效。主要分布于甘肃和陕西。药理研究表明，黄精具有抗衰老、增强免疫、提高学习和记忆能力、抗炎、抗病毒、降血糖等作用。黄精含有黄精皂苷、烟酸、糖类、醌类、氨基酸及微量元素。对黄精水提物的化学成分进行分析的过程中发现，黄精水提物的主要有效成分为黄精多糖。黄精在治癣、抗衰老等方面的作用，与其水溶性成分密切相关。黄精多糖具有多种生理功能，例如黄精多糖具有抗菌、抗炎、抗氧化、调节免疫力、抗肿瘤等功效(林产化学与工业，2005,25(2)：80-82；中成药，2012,34(4)：694-697；中草药，2006，37(8)：1132-1134；Carbohydrate polymers,2007,70:304-309)。但是，迄今为止对黄精多糖中的单一均一组分的研究报道还不多，对于各种单一组分的构效关系以及药理活性作用机制也不明确。这种情况并不利于黄精多糖的应用和开发。

由于多糖是极性大分子化合物，酸性条件下能引起多糖苷链的断裂。因此，它常用的提取分离方法大多为热水提取，酶提取法。提取液中的游离蛋白质主要用Sevage法、三氟乙酸法和三氟三氯乙烷法三种方法沉淀去除。小分子杂质可用一定截留范围的透析袋，利用透析法除去。得到透析袋内物质浓缩醇沉后的植物提取粗多糖。

本发明首次从黄精中分离纯化得到β-半乳聚糖HJW0S300-2，经过甲基化、¹³C NMR、¹H NMR分析可知，该多糖是一种新型的β-半乳聚糖，与已知报道的黄精均一多糖的结构不同。

炎症是机体对非致命性伤害的反应，其主要特征为增加内皮细胞的渗入，富含蛋白分泌物的释放以及白细胞浸润在血管外组织中。炎症对于病毒感染以及伤口愈合至关重要，过量以及无法控制的炎症变化将导致慢性疾病，如动脉粥样硬化，癌症等。因此，抑制炎症在控制和防御很多疾病的过程中是一项很重要的因素。

研究表明，NF-κB在炎症发生过程中发挥着很重要的作用。NF-κB通路调节大量与炎症，免疫有关的基因。(Hoesel and Schmid Molecular Cancer,12:86,2013)。核转录因子NF-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)起初发现在B淋巴细胞中免疫蛋白轻链基因启动子上有他们结合的位点，与抗体的轻链形成相关，因此而得名。现在的研究表明NF-κB蛋白实际上是一个由一些结构相似的真核转录因子组成的蛋白家族。这些转录因子参与调控许多正常细胞以及组织的生理生活过程。在体内，NF-κB的活化过程受到精细调控，其中反馈调节是主要的调节方式。NF-κB的正反馈调节是通过细胞外机制运行，其作用是增强炎症信号。研究证实，NF-κB可促进前炎症因子(IL-1,TNF-α，IL6)等炎性基因的转录，而IL-1,TNF-α作为细胞外刺激信号又可激活NF-κB，进一步放大炎症反应。负反馈调节在NF-ΚB活化的调节过程中也非常重要，其作用是限制NF-κB活化，降低机对某种刺激的反应。负反馈也可由于细胞外刺激(内毒素，TNF-α，IL-1β等)导致反向细胞因子如IL-10等的产生，后者可抑制前炎症细胞因子的产生(世界华人消化杂志，9：420-421，2001)。本发明首次研究了黄精β-半乳聚糖HJW0S300-2对NF-κB的负反馈调节作用，抑制NF-κB的活化，说明黄精β-半乳聚糖HJW0S300-2可缓解炎症。

研究认为，自由基长期以来被认为是炎症反应的主要因素之一，与慢性炎症的产生和发展密切相关。细胞内活性氧自由基(ROS)水平的升高，破坏细胞膜的完整性和细胞内的抗氧化系统，导致胞内液体外溢，引起炎症的发生等等。本发明中得到的黄精β-半乳聚糖HJW0S300-2被证实具有降低细胞内ROS水平的作用说明该多糖可缓解炎症。

近年来，有关多糖类的研究进展迅速，多糖的抗炎作用已得到人们的肯定。多糖的抗炎作用机制有通过抑制NF-κB的活化从而减缓炎症的发展；通过对细胞膜上选择素的抑制作用减少白细胞在炎症部位的游走和渗出，也可作为清道夫受体的配体或者调节炎症相关因子的生成而发挥抗炎作用以及抑制外周血淋巴细胞类肝素酶以及促炎性因子表达，从而发挥抗炎性损伤治疗作用；通过减少细胞自由基的生成从而达到抗炎作用(药学与临床研究，20，335-338，2012；中西医结合心脑血管病杂志，11，1374-1376，2013；Journal ofocular pharmacology and therapeutics,20:151-157,2004)等等。

本发明首次研究了从黄精中获得的一种新型的β-半乳聚糖HJW0S300-2(区别于已报道的黄精半乳聚糖(Carbohydrate polymers,2007,70:304-309)，因其重复单元不一致，分支程度不同，两者具有的生物活性也不同。本发明首次发现黄精β-半乳聚糖HJW0S300-2具有降低ROS水平以及抑制NF-κB的活性，因此认为该半乳聚糖具有抗炎作用，可以应用于化妆品，保健品和药品中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的黄精β-半乳聚糖。

在本发明的一方面，提供了一种新型的黄精β-半乳聚糖HJW0S300-2，该黄精β-半乳聚糖的结构式重复单元如下：

分子量范围在8-15KDa，其平均分子量Mw为10KDa。

本发明的另一方面涉及黄精β-半乳聚糖HJW0S300-2的制备方法，该方法包括以下步骤：

a)脱脂，然后热水提取；

b)透析，然后脱蛋白，然后碱中和；

c)透析，然后醇沉；

d)收集沉淀，得到水提黄精粗多糖HJW；

e)水提黄精粗多糖用DEAE-纤维素阴离子交换柱层析进行分离，洗脱后透析，得到产物HJW0；

f)取步骤e)所得产物HJW0，上Sephacryl S-300凝胶柱，洗脱后透析，得到最终产物HJW0S300-2。

在本发明的一个实施方式中，所述步骤a)包括取黄精生药材，用有机溶剂浸泡脱脂，然后用热水提取。在本发明的一个实施方式中，所述步骤b)包括合并提取液，浓缩，用流动水透析，透析内液浓缩后加入30％(w/v)的三氟乙酸水溶液脱蛋白，然后碱中和至pH值7.0-8.0。在本发明的一个实施方式中，所述步骤c)包括用流动水透析，透析内液浓缩后，加入2-5倍体积的95％乙醇进行醇沉。在本发明的一个实施方式中，所述步骤d)包括收集沉淀，用无水乙醇和丙酮洗涤，烘干，得到水提黄精粗多糖HJW。在本发明的一个实施方式中，所述步骤e)包括水提黄精粗多糖用DEAE-纤维素阴离子交换柱层析进行分离，用去离子水进行洗脱，洗脱液浓缩后用去离子水透析，透析液经减压浓缩并冷冻干燥，得到产物HJW0。在本发明的一个实施方式中，所述步骤f)包括取步骤e)所得产物HJW0，用氯化钠溶解，离心，上清液上Sephacryl S-300凝胶柱，用0.2mol/L氯化钠溶液洗脱，洗脱液浓缩后用去离子水透析，透析液经减压浓缩并冷冻干燥，得到最终产物HJW0S300-2。

在本发明的一个优选实施方式中，使用的有机溶剂选自：乙醇，丙酮，氯仿。

在本发明的一个优选实施方式中，所述步骤a)使用的温度范围：60～100℃。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述步骤a)一直进行到采用硫酸-苯酚法检测无颜色。

在本发明的又一个优选实施方式中，所述步骤b)中加入三氟乙酸水溶液脱蛋白的操作是以1:1(v/v)的浓缩液:三氟乙酸水溶液加入的。

在本发明的又一方面，提供了本发明所述的黄精β-半乳聚糖在抑制NF-κB活性和降低细胞内ROS水平2种途径中的应用。

在本发明的又一方面，提供了一种具有抗炎作用的化妆品、保健品或药品，其特征在于，所述化妆品、保健品或药品包含本发明制备得到的黄精β-半乳聚糖以及化妆品、保健品或药品领域可接受的赋形剂。在一个优选的实施方式中，所述黄精β-半乳聚糖的使用量为0.0001％-10％(w/w)。优选的浓度范围为0.001％-5％(w/w)。更优选的浓度范围为0.005％-1％(w/w)。最优选的是黄精β-半乳聚糖HJW0S300-2在0.005％-0.05％(w/w)的浓度范围。

在本发明的又一方面，提供了本发明的黄精β-半乳聚糖在制备具有抗炎作用的化妆品、保健品或药品中的应用。

附图说明

图1是本发明的黄精β-半乳聚糖HJW0S300-2的红外图谱。

图2是本发明的黄精β-半乳聚糖HJW0S300-2的HPLC图谱。

图3是本发明的黄精β-半乳聚糖HJW0S300-2的气相图谱。

图4是本发明的黄精β-半乳聚糖HJW0S300-2的¹H NMR图。

图5是本发明的黄精β-半乳聚糖HJW0S300-2的¹³C NMR图。

图6是本发明的黄精β-半乳聚糖HJW的提取工艺流程图。

图7是本发明的黄精β-半乳聚糖HJW0S300-2对NF-κB活性抑制的结果。

图8是本发明的黄精β-半乳聚糖HJW0S300-2降低H₂O₂刺激导致成纤维细胞ROS水平降低的流式细胞结果图。

具体实施方式

本发明的发明人在经过了广泛而深入的研究之后发现了一种新的黄精β-半乳聚糖。

下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。但是，应该明白，这些实施例仅用于说明本发明而不构成对本发明范围的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，所有的百分比和份数按重量计。

本发明实施例中使用的仪器设备如下：

SHB-III循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸易有限公司。

85-2型恒温磁力搅拌器：上海思乐仪器有限公司。

DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司。

N-1100D-WD真空旋转蒸发仪：日本EYELA公司。

UV260可见分光光度计：日本Shimadzu。

GL-21M低温高速离心机：上海离心机研究所有限公司。

Labconco大型冷冻干燥机：美国Labconco公司。

Edwards小型冷冻干燥机：英国Edwards公司。

细胞培养箱：美国Thermo serial II

流式细胞仪：美国Becton Dickson FACSCalibur

全波长双板多功能仪(酶标仪)：美国BMG Labtech公司，Novostar

多标记微孔板检测仪：PerkinElmer Multilabel Reader

实施例1：黄精β-半乳聚糖的提取

取2.0kg黄精生药材(产地：安徽，购自上海华宇药业有限公司)，加有机溶剂(如乙醇，丙酮，氯仿等)，室温下浸泡，五天一次共两次，以除去脂溶性小分子。倾去上清液，固体静置于通风处晾干，然后用热水进行提取，每次加入约20-40L，提取时间为5-7小时，用苯酚-硫酸法检测提取液的糖含量，至糖反应不明显为止，共计提取6次。每次的提取液经过滤合并，加热浓缩至小体积，对流动水透析两天，透析内液浓缩后离心，1：1(v/v)加入30％的三氯乙酸溶液去除蛋白，在4℃条件下反应2-4小时，加碱(如NaOH，KOH，CH₃COONa等)溶液中和至pH值为7左右后扎袋对流动水透析48小时，透析内液浓缩后离心至小体积，上清液加入2-5倍体积的95％乙醇，静置过夜。离心收集沉淀，分别经无水乙醇和丙酮洗涤后，于40℃真空干燥，得水提粗多糖HJW为55g。

水提黄精粗多糖HJW用DEAE-纤维素阴离子交换柱(60cm×5cm)层析进行分离，用去离子水进行洗脱。水提粗多糖HJW(30g)上样，去离子水洗脱收集，经浓缩透析，冻干得白色絮状物HJW02.6g。取150mgHJW0，用2ml的0.2mol/L氯化钠溶解，离心，上清液上SephacrylS-300凝胶柱，洗脱液经去离子水透析，透析袋内液冷冻干燥后得到白色粉末，为HJW0S300-2。

物化性质测定：按照多糖的常规方法，以分子量已知的右旋糖酐T-700，T-110，T-80，T-40，T-11为标准，绘制分子量与出峰时间的标准曲线，使用Agilent HPGPC(Ultrahydragel500串联Ultrahydragel2000柱)测定HJWS300-2平均分子量为经HPLC检测为一均一多糖，分子量Mw为10KDa。使用旋光仪Perkin-Elmer241M测得HJW0S300-2比旋光度为[α]²⁵ _D+42°(c0.5mg/ml，H₂O)。

糖组成分析：取3mg HJW0S300-2样品，110℃下用2M三氟乙酸(TFA)水解2小时，水解产物冷却后于40℃减压浓缩蒸干，重复操作4-5次，以除尽未反应的TFA。然后用3ml去离子水溶解样品，加入20-30mg硼氢化钠，室温下还原3小时(间歇震荡)，然后用25％乙酸中和多余的硼氢化钠，至溶液不再产生气泡，pH应在4-5之间，加甲醇多次，减压蒸干，110℃加热10分钟，除去残留的水分，加3ml醋酐，密塞，100℃反应1小时，冷却，加甲苯4-5次(每次2-3ml)共蒸除去多余醋酐，直至完全干燥。所得的乙酰化产物用10ml氯仿萃取，经等体积蒸馏水洗涤4次，氯仿层用无水硫酸钠干燥，浓缩至0.1ml后用岛津GC-14B气相色谱仪分析。结果显示，对照标准样品，只有半乳糖的峰，所以该多糖为半乳聚糖。

化学结构鉴定：

核磁共振分析：室温下，取30mg HJW0S300-2，用500μl重水溶解后，用核磁共振仪Brucker AM-400获得其¹H NMR以及¹³C NMR谱图。

甲基化分析：取10mg HJW0S300-2样品于甲基化反应瓶中，加入2ml干燥DMSO，密塞，室温搅拌15min，使样品完全溶解，加入预先磨成粉状的NaOH约20mg，继续搅拌10min，然后冰浴约5min，在冰水浴下缓慢滴加约0.3ml碘甲烷(滴加速度：12滴/min)，然后在室温下继续搅拌反应30min。减压除去过量的碘甲烷，溶液对去离子水透析24h(2L×4)，透析内液减压浓缩至2～3ml，冷冻干燥，重复甲基化反应3～4次后，取少量样品进行IR光谱检测，如IR谱图中在3300cm^-1左右的O-H振动吸收峰消失，则表明该多糖样品已经完全甲基化，否则则表明样品未甲基化完全，还需要继续进行甲基化反应1～2次。

表1：HJW0S300-2的全甲基化后的气质连用(GC-MS)图谱分析结果

在糖化学领域中，即使重复单元一样，但由于分子量不一样，其空间结构会不同，这种空间结构的变化可以带来活性的显著变化。与已报道的黄精β-半乳聚糖(Carbohydrate polymers,2007,70:304-309)相比较，可以发现其重复单元也不一样，同时分子量相差一半以上。可认为本发明中的黄精β-半乳聚糖为一新型的多糖化合物。

实施例2：黄精β-半乳聚糖HJW0S300-2抑制NF-κB活性实验

1.1HEK293/NF-κB-luc稳定株的构建

该细胞株由上海药物研究所丁侃研究员实验室方建平博士构建(Journal ofAgriculture and Food Chemistry,61(47):11400-9,2013，Glycoconjugate journal,2012,29,389)。具体步骤如下：

将HEK293以3×10⁵cells/ml接种于12孔板，1ml/孔。过夜培养后，密度达到70％-90％之间，按照Lipofectamine2000(Invitrogen)的说明书进行转染。过夜培养后，以1：60的比例将细胞传代，换到100mm细胞培养皿中，24h后加入G418(美国Merk)800μg/ml，继续培养。每周换液一次，补加新的G418。大约5-6周后，有单克隆形成，用枪头跳出，换到96孔板中继续培养，维持G418浓度不变。待长满后换到48孔板，而后转到24孔板中。等到24孔板长满以后，胰酶消化细胞接种到96孔板中，进行检测。

检测时同一克隆一般种4个孔，2个阳性，加LPS(脂多糖)1μg/ml刺激，另2个为阴性，不加刺激。刺激过夜后，吸去上清，每孔加入细胞裂解液CCLR(Promega)100μl，放-20℃冻融一次，将裂解液转移至萤光素酶专用检测板上，加萤光素酶检测试剂20μl，检测各孔的荧光强度。

如果同一克隆的阳性孔与阴性孔的荧光值差距达到4倍以上，暂认定为阳性克隆，继续扩增培养，传代超过10代以上重新进行检测，如果仍为阳性，可认定克隆稳定，并冻存。经上述步骤，最后筛选到几株不同NF-κB报告基因活性的克隆，选择其中一株(阳性与阴性荧光比值在50附近)做为后续实验的稳定株。

1.2萤光素酶报告系统的检测

HEK293/NF-κB-Luc生长于含10％FBS(Gibico)的DMEM培养基。以5×10⁴cells/100μl孔接种至96孔板，培养过夜。加入含有HJW0S300-2的培养基100μl/孔，使其终浓度分别为0.005％，0.01％，0.05％，继续培养20min。加入20μl/孔LPS(终浓度1μg/ml)，同时设置阴性(未加化合物和LPS)和阳性(只加LPS)对照孔继续培养6h。

弃上清，加入1×CCLR裂解液，20μl/孔，冻存于-80℃。冻融一次后，将裂解液转移至荧光素酶活性检测板(Lumitrac200,Greiner)。每孔加入35μl荧光素酶检测底物。用多标记微孔板检测仪PerkinElmer Multilabel Reader检测自发光读数，检测在5min内完成。

抑制率计算公式为：

结果表明，LPS能明显地激活NF-κB，使其荧光强度显著增加，加入0.005％浓度的HJW0S300-2，能显著抑制由LPS引起的NF-κB的激活，抑制率为19.01％。当浓度升高时，抑制率下降，这与多糖在提取过程中本身可能混有内毒素有关(Journal of Agriculture andFood Chemistry,61(47):11400-9,2013)。

2.利用流式细胞仪测定黄精β-半乳聚糖对成纤维细胞过氧化氢处理后ROS水平的变化

原代人成纤维细胞Human Fibroblast cell(购自Life technologies)。在6孔板内加入含有人体成纤维细胞的培养基悬浮液2ml，细胞浓度为1×10⁵个。37℃5％CO₂培养箱孵育24小时，吸出培养基，分别加入含有姜黄素以及HJW0S300-2的培养基2ml，使其终浓度分别为5μM和0.005％。培养基为含有10％胎牛血清(Gibico)、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM培养基。37℃5％CO₂培养箱培养72小时。去除培养基，加入含有终浓度为0.0035％H₂O₂的培养基培养后，加入按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA(碧云天，活性氧检测试剂盒)，使终浓度为10μM。去除细培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA，每孔加入1ml。37℃5％CO₂培养箱培养半小时。

用无血清的培养基清洗一遍，加入300μl胰酶，消化细胞2min。将细胞悬液移入1.5ml离心管内，3000g离心5min弃上清。加入1ml PBS吹打均匀后，3000g离心5min弃上清。加入500μl PBS溶液混匀，滤膜过滤，上流式细胞仪进行检测。结果表明，当细胞用H₂O₂处理后，ROS水平显著升高53.9％，而预先用0.005％HJW0S300-2孵育，发现ROS水平与单独用H₂O₂处理组相比较，下降到25.9％。重复实验说明，HJW0S300-2能显著抑制ROS水平的升高。

Claims (9)

1.一种黄精β-半乳聚糖HJW0S300-2，其中聚糖的结构式如下：

分子量范围在8-15KDa，其平均分子量Mw为10KDa。

2.如权利要求1所述的黄精β-半乳聚糖，其特征在于，所述聚糖的比旋光度为[α]²⁵ _D+42°，其中测定条件为25℃，浓度为0.5mg/mL的水溶液。

3.一种从黄精块茎中提取权利要求1所述黄精β-半乳聚糖的方法，该方法包括以下步骤：

a)取黄精生药材，用有机溶剂浸泡脱脂，然后用热水提取；

b)合并步骤a)所得的提取液，浓缩，用流动水透析，透析内液浓缩后加入30％重量/体积的三氟乙酸水溶液脱蛋白，然后碱中和至pH值7.0-8.0；

c)用流动水透析，透析内液浓缩后，加入2-5倍体积的95％乙醇进行醇沉；

d)收集步骤c)得到的沉淀，用无水乙醇和丙酮洗涤，烘干，得到水提黄精粗多糖HJW；

e)步骤d)所得的水提黄精粗多糖用DEAE-纤维素阴离子交换柱层析进行分离，用去离子水进行洗脱，洗脱液浓缩后用去离子水透析，透析液经减压浓缩并冷冻干燥，得到产物HJW0；

f)取步骤e)所得产物HJW0，用氯化钠溶解，离心，上清液上Sephacryl S-300凝胶柱，用0.2mol/L氯化钠溶液洗脱，洗脱液浓缩后用去离子水透析，透析液经减压浓缩并冷冻干燥，得到最终产物HJW0S300-2。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述热水的温度范围为60～100℃。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤a)一直进行到采用硫酸-苯酚法检测无颜色。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中加入三氟乙酸水溶液脱蛋白的操作是以体积比1:1的浓缩液:三氟乙酸水溶液加入的。

7.如权利要求1所述的黄精β-半乳聚糖在制备抑制NF-κB活性或降低细胞内ROS水平的药物中的应用。

8.一种具有抗炎作用的保健品或药品，其特征在于，所述保健品或药品包含如权利要求1所述的黄精β-半乳聚糖以及保健品或药品领域可接受的赋形剂。

9.如权利要求8所述的保健品或药品，其特征在于，所述黄精β-半乳聚糖的使用量为0.0001重量％-10重量％。