CN105153292B - 一种弓形虫gra10复合表位肽及其制备的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种弓形虫GRA10复合表位肽及其制备的疫苗，将筛选出的弓形虫GRA10的三段表位(GRA1080‑94、GRA10161‑169、GRA10192‑215)人工合成为复合表位肽，与乳化交联法获得的壳聚糖微球相结合，获得装载弓形虫GRA10复合表位肽的壳聚糖微球疫苗。本发明的微球疫苗可有效地增强体液免疫和细胞免疫反应，有效地降低免疫小鼠在接受弓形虫PRU株(II型)攻击后大脑包囊的形成率，以及延长弓形虫攻击后小鼠的存活时间。该疫苗可作为预防弓形虫感染，控制宿主脑组织中包囊形成的有效候选疫苗。

Description

一种弓形虫GRA10复合表位肽及其制备的疫苗
技术领域
本发明涉及弓形虫疫苗领域，具体涉及一种弓形虫GRA10复合表位肽及其制备的疫苗，其基于弓形虫GRA10的复合抗原表位，用壳聚糖微球装载的弓形虫疫苗，用于人或动物弓形虫病的预防。
背景技术
弓形虫(Toxoplasma gondii)是世界性分布的寄生原虫，广泛寄生于人体及动物的有核细胞内，引起严重的人兽共患病。弓形虫感染孕早期妇女可导致流产、早产甚至死产，亦可通过胎盘引起新生儿畸形和胎儿眼部并发症。对于免疫力缺乏或者低下的人群(如艾滋病和肿瘤患者)，弓形虫可导致严重的临床症状(如弓形虫脑病)甚至死亡。在免疫功能正常的宿主体内，弓形虫往往形成慢性感染，引起不可逆的中枢神经系统和视力的损害。作为一种机会致病性胞内寄生的原虫，弓形虫在宿主体内主要引起细胞免疫反应，是通过识别抗原蛋白的十几个氨基酸序列发挥作用，这就是抗原表位。研制针对弓形虫同时具有人类及BALB/c小鼠MHC分子限制性T细胞表位和B细胞表位的新疫苗是非常迫切和必要的。
弓形虫GRA家族是构成弓形虫速殖子纳虫空泡膜和缓殖子囊壁的主要成分，在修饰调理纳虫泡形成过程中起着重要作用，其中GRA10蛋白更与虫体在胞内的生长和发育息息相关。我们通过筛选获得了GRA10蛋白的T细胞和B细胞优势表位，通过实验验证了这些表位肽的免疫保护性。
此外，疫苗载体的选择，对于疫苗的作用效果也极为关键；作为非病毒载体，微球颗粒材料具有较好的生物相容性和独特的理化性质，如易于加工修饰、促进功能分子入胞、保护DNA和蛋白质等免受降解，在疫苗载体或佐剂的研究与开发过程中逐渐成为关注的热点。针对弓形虫所使用种类的抗原，如何选择合适的载体来增强疫苗免疫效果，也是本领域内亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，发明人通过实验研究，提供了一种弓形虫GRA10复合表位肽及其制备的疫苗。
首先，本发明提供了一种人工合成弓形虫GRA10蛋白复合表位肽—SGFSLSSGSGVSVVEGSLGYCALLPLGSTQSPPESRKKRRRSGKKKRGKRSV；
所述复合表位肽是通过如下方法获得的：用IEDB筛选出的同时具有人类及BALB/C小鼠MHC分子限制性的弓形虫GRA10的CD+8T细胞优势表位(GRA10161-169)和CD+4T细胞优势表位(GRA1080-94)，用DNAStar-Protean软件综合分析预测GRA10的B细胞优势表位(GRA10192-215)，通过两个氨基酸序列GS连接起来，人工合成弓形虫GRA10复合表位肽。
其次，本发明提供了所述人工合成弓形虫GRA10复合表位肽用于制备弓形虫疫苗的应用；
优选的，用于制备用于预防和/治疗人或动物弓形虫病的疫苗。
进一步的，本发明提供了装载所述弓形虫GRA10复合表位肽的壳聚糖微球疫苗，可用于预防人或动物弓形虫病。
所述弓形虫GRA10复合表位肽壳聚糖微球疫苗采用乳化交联法获得壳聚糖微球颗粒，使之吸附结合GRA10复合表位肽，获得装载GRA10复合表位肽的壳聚糖微球疫苗，并观察该疫苗肌肉注射免疫BALB/c小鼠的免疫原性和小鼠抗RH株弓形虫(I型株，主要为速殖子造成急性期感染)和PRU株弓形虫(II型株，易形成包囊的虫株)攻击的保护效果。
本发明的装载弓形虫GRA10复合表位肽的壳聚糖微球疫苗，对BALB/c小鼠进行肌肉注射免疫。通过测定细胞和体液免疫反应指标来评价疫苗的免疫原性，通过计数PRU株弓形虫攻击实验后小鼠大脑中包囊的数量及RH株弓形虫攻击后小鼠生存率来评估疫苗的免疫保护性。结果表明：与对照组相比，装载弓形虫GRA10复合表位肽的壳聚糖微球疫苗组能有效地降低免疫小鼠在弓形虫PRU株(II型)攻击后大脑包囊的形成率，提高弓形虫攻击后小鼠的免疫保护性反应及生存率。本发明的突出效果是：该疫苗可作为控制弓形虫慢性感染过程中脑组织包囊形成及急性感染时提高免疫反应及生存率的有效的候选疫苗。
上述评估该疫苗的免疫原性的方式为：将微球疫苗经肌肉注射免疫BALB/c小鼠2次，间隔3周。分别于第1次免疫前和免疫后2周，第2次免疫后2周和4周，于免疫鼠眼内眦静脉取血，分离血清，测定血样中的IgG及分型。于末次免疫后4周，无菌取免疫鼠的脾脏，通过200目铜网研磨制备脾单细胞悬液，加入GRA10复合表位肽刺激培养后流式细胞术检测细胞因子来评估该疫苗的的免疫原性。
上述评估该疫苗的免疫保护性的方式为：小鼠于末次免疫后4周，用II型弓形虫PRU虫株包囊20个攻击。8周后处死小鼠，无菌条件下取脑，物理研磨制备脑组织匀浆液。显微镜下包囊计数。通过比较实验组和对照组小鼠脑的包囊数来评价疫苗的免疫保护性。
本发明取得了以下有益效果：
(1)通过疫苗的免疫原性试验，证明了人工合成弓形虫GRA10复合表位肽及其制备的疫苗，具有极好的免疫原性，可有效地引发机体的体液和细胞免疫应答；
(2)提高了生物体在弓形虫攻击下的存活率；
(3)减少免疫小鼠的大脑包囊形成的数量，有效的保护免疫动物免于弓形虫包囊的攻击；
(4)对于控制弓形虫慢性感染，起到良好效果。
附图说明
图1：装载弓形虫GRA10复合表位肽的壳聚糖微球疫苗的构建。将筛选出的弓形虫GRA10的CD+8T细胞优势表位(GRA10161-169)、CD+4T细胞优势表位(GRA1080-94)和B细胞优势表位(GRA10192-215)通过两个氨基酸序列GS连接起来，人工合成弓形虫GRA10复合表位肽。采用乳化交联法获得壳聚糖微球颗粒，使之吸附结合GRA10复合表位肽，获得装载GRA10复合表位肽的壳聚糖微球疫苗。
图2：装载弓形虫GRA10复合表位肽的壳聚糖微球疫苗的扫描电镜成像示意图。
图3：免疫鼠血清中抗弓形虫免疫球蛋白IgG含量的测定。分别在第0，14，35，49天免疫鼠内眼眦取血法取血，分离血清。使用酶联免疫吸附试验测定血清中总抗弓形虫免疫球蛋白(Ig)的含量。如图所示，在两次免疫接种后，与对照组PBS和空微球CS组相比，微球疫苗CS-G10E免疫组的抗体滴度水平增加明显，在第35天和第49天，微球疫苗CS-G10E免疫组小鼠中均检测到高水平的弓形虫特异性IgG抗体(P<0.01)。
图4：免疫鼠脾细胞中细胞因子(IL-2和IFN-γ)含量的测定。于末次免疫后4周，无菌取免疫鼠的脾脏，通过200目铜网研磨制备脾单细胞悬液，加入GRA10复合表位肽刺激培养后流式细胞术检测细胞因子的含量。如图所示，与对照组PBS和空微球CS组相比，微球疫苗CS-G10E免疫组的细胞因子含量显著增加(P<0.01)
图5：装载弓形虫GRA10复合表位肽的壳聚糖微球疫苗的免疫保护性。小鼠经口感染悬浮于0.1毫升PBS中的弓形虫包囊20个。感染两个月后，所有小鼠均被处死，分离小鼠大脑进行物理研磨，制备脑组织匀浆液。将脑组织匀浆液混匀，取10微升于显微镜下计数三次取平均值，小鼠脑的包囊数为10倍的平均值。免疫小鼠的攻击实验表明：与对照组PBS和空微球CS组相比，微球疫苗CS-G10E免疫组的小鼠存活率明显提高，且脑中检测到包囊数量显著减少(P<0.01)
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
本发明中未详尽描述的试剂、方法均为所属领域的常规试剂、方法。
实例1.弓形虫GRA10复合表位肽的合成
将筛选出的弓形虫GRA10的CD+8T细胞优势表位(GRA10161-169)、CD+4T细胞优势表位(GRA1080-94)和B细胞优势表位(GRA10192-215)通过两个氨基酸序列GS连接起来，人工合成弓形虫GRA10复合表位肽(SGFSLSSGSGVSVVEGSLGYCALLPLGSTQSPPESRKKRRRSGKKKRGKRSV)(图1)。
实例2.装载弓形虫GRA10复合表位肽的壳聚糖微球疫苗
将壳聚糖原材料溶于2％的醋酸中作为水相，制备含有5％Span80的液体石蜡作为油相，将水相逐滴加入油相，机械搅拌2h，逐渐滴加25％戊二醛(交联剂)，继续搅拌2h，3000rpm收集产物，依次用石油醚、异丙醇和蒸馏水各清洗3次，置于真空冷冻干燥机冻干，获得空白壳聚糖微球颗粒。扫描电镜下观测微球形态，粒径均匀，分散性好(图2)。将弓形虫GRA10复合表位肽和乳化交联法获得的壳聚糖微球置于4℃连续震荡24小时，获得装载弓形虫GRA10复合表位肽的壳聚糖微球疫苗。
实例3.弓形虫GRA10复合表位肽的壳聚糖微球疫苗免疫BALB/c鼠
SPF级雌性BALB/c鼠(6-8周)购自山东大学实验动物中心。45只小鼠随机分成3组，实验组每组小鼠经后腿肌肉注射667μg微球疫苗CS-G10E(含100μgG10E)，对照组注射免疫667μg空壳聚糖微球颗粒CS和100μl PBS。小鼠共免疫两次，间隔三周。
实例4.免疫鼠体液免疫和细胞免疫水平的测定
分别在第0，14，35，49天小鼠内眼眦取血法取血，血样先在室温下静置3h，然后3000rpm，离心30min，收集血清。使用酶联免疫吸附试验测定血清中总抗弓形虫免疫球蛋白(Ig)的含量。结果如图3所示。在两次免疫接种后，与对照组PBS和空微球CS组相比，疫苗免疫组的抗体滴度水平增加明显，在第35天和第49天，微球疫苗CS-G10E免疫组小鼠中检测到高水平的弓形虫特异性IgG抗体(P<0.01)(图3)。
在末次免疫后4周，无菌取免疫鼠的脾脏，通过200目铜网研磨制备脾单细胞悬液。使用红细胞裂解缓冲液除去脾细胞中的红细胞后，重悬于含有10％胎牛血清的1640培养基中，调整细胞悬浮液的浓度为3×107个细胞/ml，加入GRA10复合表位肽刺激培养后流式细胞术检测细胞因子的含量。结果表明，微球疫苗CS-G10E免疫组的小鼠脾细胞中检测出大量的IL-2及IFN-γ，明显高于对照组(P<0.01)。提示该微球疫苗主要诱导小鼠产生Th1型细胞免疫应答(图4)。
实例5.装载弓形虫GRA10复合表位肽的壳聚糖微球疫苗的免疫保护性研究
末次免疫后4周，免疫小鼠进行攻击实验。小鼠经口感染悬浮于0.1毫升PBS中的弓形虫包囊20个。感染两个月后，所有小鼠均被处死，分离小鼠大脑进行物理研磨，制备脑组织匀浆液。将脑组织匀浆液混均，取10微升于显微镜下计数三次取平均值，小鼠脑的包囊数为10倍的平均值。免疫小鼠的攻击实验表明：与对照组PBS或空微球CS组相比，微球疫苗CS-G10E免疫组的小鼠存活率明显提高，且脑中检测到包囊数量显著减少(P<0.01)(图5)。
综上所述，装载弓形虫GRA10复合表位肽的壳聚糖微球疫苗可以有效的诱导小鼠产生有效的体液和细胞免疫应答。微球疫苗免疫不仅可以成功地提升体液免疫和细胞免疫反应，提高小鼠生存率，而且有效的保护免疫小鼠免于弓形虫包囊的攻击，减少免疫小鼠的大脑包囊形成的数量。该疫苗可作为控制弓形虫急性或慢性感染的有效的候选疫苗，用于人和动物弓形虫病的预防。
上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (9)

1.一种弓形虫GRA10复合表位肽，其特征在于，该复合表位肽的序列为SGFSLSSGSGVSVVEGSLGYCALLPLGSTQSPPESRKKRRRSGKKKRGKRSV。
2.编码权利要求1所述复合表位肽的核酸。
3.权利要求1所述肽或权利要求2所述核酸用于制备弓形虫疫苗的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述疫苗用于预防人或动物弓形虫病。
5.根据权利要求3或4所述应用，其特征在于，所述疫苗用于控制弓形虫急性或慢性感染。
6.一种弓形虫GRA10复合表位肽壳聚糖微球疫苗的制备方法，其特征在于，制备获得权利要求1所述弓形虫GRA10复合表位肽，然后用乳化交联法获得壳聚糖微球颗粒，使之吸附结合GRA10复合表位肽，最终获得装载GRA10复合表位肽的壳聚糖微球疫苗。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，将壳聚糖原材料溶于醋酸中作为水相，制备含有Span80的液体石蜡作为油相，将水相逐滴加入油相，机械搅拌，逐渐滴加戊二醛，搅拌收集产物，清洗，冻干，获得空白壳聚糖微球颗粒；将弓形虫GRA10复合表位肽和乳化交联法获得的壳聚糖微球置于4℃连续震荡24小时，获得装载弓形虫GRA10复合表位肽的壳聚糖微球疫苗。
8.根据权利要求6或7所述方法，其特征在于，将壳聚糖原材料溶于2%醋酸中作为水相，制备含有5%Span80的液体石蜡作为油相，将水相逐滴加入油相，机械搅拌2h，逐渐滴加25%戊二醛，继续搅拌2h，3000rpm收集产物，依次用石油醚、异丙醇和蒸馏水各清洗3次，置于真空冷冻干燥机冻干，获得空白壳聚糖微球颗粒；将弓形虫GRA10复合表位肽和乳化交联法获得的壳聚糖微球置于4℃连续震荡24小时，获得装载弓形虫GRA10复合表位肽的壳聚糖微球疫苗。
9.根据权利要求6-8任一项所述方法制备得到的弓形虫GRA10复合表位肽壳聚糖微球疫苗。
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