CN105153291A - 一种拟黑腹瘤虻来源的免疫抑制肽ha及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种拟黑腹瘤虻来源的免疫抑制肽HA，其氨基酸序列如SEQ？ID？No.：2所示。本发明还公开了上述拟黑腹瘤虻来源的免疫抑制肽HA的编码基因及其在制备免疫抑制药物中的应用。本发明中免疫抑制肽HA具有分子量小、人工合成简单、作用效果显著点优点，具有广泛的应用前景。

Description

一种拟黑腹瘤虻来源的免疫抑制肽HA及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种拟黑腹瘤虻来源的免疫抑制肽HA及其编码基因和在制药中的应用。

背景技术

牛虻(虻虫)是我国重要的传统药材，作为一种吸血的寄生动物，牛虻为了血餐的顺利进行，其唾液腺在与寄主协同进化的漫长岁月里进化出多种生物活性物质，牛虻寄生成功的关键是通过唾液中产生的特异拮抗剂来回避宿主免疫反应。众多吸血节肢动物中，蜱及蚊子的唾液腺中的活性物质研究较多而牛虻唾液腺的活性物质研究却很少。但对这些物质活性研究表明它们存在显著的生化和药理学多样性，这种物质的天然多样性用在治疗学和生化研究中将有很好前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种拟黑腹瘤虻来源的具良好免疫抑制效果和极低的溶血活性的新型免疫抑制肽HA，以及编码这条多肽的核酸序列。

本发明还要解决的技术问题是提供上述拟黑腹瘤虻来源的免疫抑制肽HA及其编码基因的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种拟黑腹瘤虻来源的免疫抑制肽HA，其氨基酸序列如SEQIDNo.：2所示，其是由30个氨基酸残基组成，分子量3178.2Da，等电点3.42。

一种拟黑腹瘤虻来源的免疫抑制肽HA的编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.：1所示，由365个核苷酸组成，其中，编码成熟的活性免疫抑制肽HA为SEQIDNo.：1中的第115-204位核苷酸。

上述拟黑腹瘤虻来源的免疫抑制肽HA的制备方法，根据SEQIDNo.：2所示的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。

上述拟黑腹瘤虻来源的免疫抑制肽HA在制备免疫抑制药物中的应用也在本发明的保护范围之内，特别是在炎症免疫抑制药物中的应用也在本发明的保护范围之内。本发明从拟黑腹瘤虻唾液腺提取物中分离纯化得到新的免疫抑制肽HA，它的靶向作用细胞因子是免疫抑制因子IL-10。在机体中主要产生IL-10的Treg细胞在自身免疫疾病的进程中起着重要的作用。而在器官移植的免疫排斥的过程中，细胞介导的免疫(细胞毒性T细胞、巨噬细胞、NK细胞及相关的细胞因子)也起着关键的作用。这两种免疫相关途径中，IL-10扮演着关键因子的角色。因此免疫抑制肽HA和含有HA的组合物对开发新型的免疫抑制药物有着重要的意义。

上述拟黑腹瘤虻来源的免疫抑制肽HA的编码基因在制备免疫抑制药物中的应用也在本发明的保护范围之内，特别是在炎症免疫抑制药物中的应用也在本发明的保护范围之内，例如可以应用于多肽重组表达、转基因动物、植物、或动/植物细胞中。

有益效果：本发明中的拟黑腹瘤虻免疫抑制肽HA具有分子量小、人工合成简单、作用效果良好、溶血活性低的优点，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为免疫抑制肽immunoregulinHA对不同细胞因子的作用，其中，A为immunoregulinHA对细胞因子IL-10的作用，B为immunoregulinHA对细胞因子IFN-γ的作用，C为immunoregulinHA对细胞因子MCP-1的作用；

图2为免疫抑制肽immunoregulinHA抑制完全弗氏佐剂导致的小鼠足底炎症模型。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：拟黑腹瘤虻免疫抑制肽HA编码基因克隆。

1)拟黑腹瘤虻唾液腺RNA提取：

①拟黑腹瘤虻解剖的方法如下：拟黑腹瘤虻用胶水粘在放置于冰上的平皿中，转移到体式显微镜下(Olympus-szx12)，用小剪刀将虫体沿背中线剪开，放入预冷的生理盐水(0.9％NaCl的缓冲液)中浸泡3-5min，用镊子迅速挑出30对唾液腺，置于液氮中，然后加入1ml总RNA提取缓冲液(Trizol，美国Life公司产品)，充分混匀，而后于4℃，12000rpm离心10min。

②离心取上清，加入0.2ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，而后以4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。

③上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4℃，12000rpm离心10分钟，收集沉淀用75％(V/V)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为拟黑腹瘤虻唾液腺总RNA。

2)拟黑腹瘤虻唾液腺的二链合成：采用CLONTECH公司In-FusionSMARTerTMDirectionalcDNALibraryConstructionKit合成。

(1)cDNA第一链合成(mRNA反转录)：

①RNase-free的PCR管中加入1μl拟黑腹瘤虻唾液腺总RNA、1μl3’端一链合成引物(3’In-FusionSMARTerCDSPrimer)和2.5μlRNase-free水使总体积达到4.5μl，混匀后短暂离心(2000rpm，30s)，离心后于72℃保温3分钟；保温后再将离心管在42℃孵育2分钟。

②在上述离心管中加入以下试剂(均为CLONTECH公司In-FusionSMARTerTMDirectionalcDNALibraryConstructionKit建库试剂盒中配备)，2.0μl5×第一链缓冲液、0.25μl100mMDTT、1.0μl10mMdNTPMix、1.0μlSMARTerVOligonucleotide、0.25μlRNaseInhibitor和1.0μlSMARTScribeReverseTranscriptase反转录酶，混合离心管中试剂并短暂离心(2000rpm，30s)，在42℃保温90min，然后68℃保温10min。保温处理后将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。

(2)采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链(所用试剂均为CLONTECH公司In-FusionSMARTer^TMDirectionalcDNALibraryConstructionKit建库试剂盒中配备)

①将2μlcDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl10×Advantage2PCR缓冲液、2μl50×dNTP混合物、2μl5’PCR引物、2μlCDSIII/3’PCR引物以及2μl50×Advantage2PolymeraseMix在95℃预热的PCR管中进行混合。

②在PCR仪中按以下程序扩增：

95℃，1min；18个循环：95℃，15sec，65℃，30sec，68℃，6min。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链－80℃保存。

(3)拟黑腹瘤虻免疫抑制肽HA的编码基因克隆：

根据之前所获得Edman降解法测得的免疫抑制肽HA的氨基酸序列，设计正向引物：

F15’-Gg(A/T/C/G)gg(A/T/C/G)gt(A/T/C/G)ac(A/T/C/G)gg(A/T/C/G)gt(A/T/C/G)ac(A/T/C/G)ga(A/G)T-3’。

反向引物为CLONTECH公司In-FusionSMARTerTMDirectionalcDNALibraryConstructionKit中的3’-PCR引物，其序列为5’-CGGGGTACGATGAGACACCAT-3’。

PCR反应在如下条件下进行：95℃4min，95℃30sec，57℃30sec和72℃1min，30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒(天根生物)进行目的片段回收。将回收的目的片段连接到pMD19-T载体(Takara,大连)，转化DH5α感受态细胞。涂板并进行氨苄青霉素筛选，挑取单菌落用M13引物PCR检测插入片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒，使用AppliedBiosystemsDNAsequencer,modelABIPRISM377进行核苷酸测序。

实施例2：拟黑腹瘤虻免疫抑制肽HA的制备。

(1)拟黑腹瘤虻免疫抑制肽HA的化学合成方法：根据编码基因推导的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A,AppliedBiosystems)合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。

(2)纯化的拟黑腹瘤虻免疫抑制肽HA用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

拟黑腹瘤虻免疫抑制肽HA是基因编码的一种小分子线性多肽，由30个氨基酸残基组成，分子量3178.2Da，等电点3.42，其氨基酸序列如SEQIDNo.：1所示。

实施例3：拟黑腹瘤虻免疫抑制肽HA抑制炎症因子活性的检测。

1.大鼠脾细胞的采集、培养及样品处理

①取Wistar大鼠，采用颈部脱臼法处死，取出脾脏，在RPMI1640培养基中研磨至碎，过滤网(200目)，4℃，1,500rpm离心3～5min；

②用红细胞裂解液轻轻悬浮沉淀，4℃，1,500rpm离心3～5min；

③用RPMI1640培养基洗涤沉淀两次，4℃，1,500rpm离心3～5min；

④用RPMI1640培养基轻轻悬浮细胞，血细胞计数板计数，确定细胞浓度；

⑤用RPMI1640培养基将细胞浓度稀释至细胞接种于96孔板，每孔100μl含6×106个/mL，在37℃，3.5％的二氧化碳的条件下用含10％胎牛血清和青链霉素(各100u/ml)的RPMI1640培养基培养。

⑥分阴性对照组、单加样组和样品-LPS共刺激组，阴性对照组加生理盐水，单加样组仅加HA(终浓度为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)，样品-LPS共刺激组为终浓度2μg/ml的LPS诱导+HA(5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)，每组重复五孔。

2.间接ELISA方法检测样品处理的由LPS诱导的脾细胞因子释放

①包被抗原：以PBSBuffer(pH7.4)稀释一定比例的纯化蛋白(0.2～10μg/mL)做为检测用抗原溶液，充分混匀后，用多道移液器将抗原溶液加入到96孔酶标板中，100μL/孔，并轻轻振晃滴定板以使抗原均匀分布，将板置于湿盒中，4℃包被过夜。

②洗涤：取出4℃包被好的滴定板，室温下平衡5min，将板中溶液弃掉，将PBST(pH7.4)洗液加满板孔进行洗涤，静置5min，反复洗涤3次，甩掉废液，将板倒扣在干净的吸水纸上吸掉多余水分。

③封闭：将封闭液(含1％BSA的PBST溶液)加入到96孔酶标板中，200μL/孔，并轻轻振晃滴定板以使溶液均匀分布，将板置于湿盒中，37℃孵育1h。

④洗涤：同上。

⑤加入一抗：用封闭液亦即样品稀释液稀释好一定比例的血清或杂交瘤细胞上清，加入到96孔酶标板中，并设立阴性或阳性对照，100μL/孔，轻轻振晃滴定板以使溶液均匀分布，将板置于湿盒中，37℃孵育1h。

⑥洗涤：同上。

⑦加入二抗：用封闭液亦即样品稀释液稀释好一定比例的二抗，加入到96孔酶标板中，100μL/孔，轻轻振晃滴定板以使溶液均匀分布，将板置于湿盒中，37℃孵育1h。

⑧洗涤：同上。

⑨底物显色：以试剂配制说明配制适量的底物显色液，现用现配，充分混匀后，加入到96孔酶标板中，100μL/孔，轻轻振晃滴定板以使溶液均匀分布，将板置于湿盒中，37℃避光孵育15min。

终止反应：显色结束后，将2MH2SO4溶液加入到96孔酶标板中，50μL/孔，轻轻振晃滴定板以使溶液均匀分布，立即置于MultiskanMK3型酶标仪中读取OD450下的吸光值。

ELISA结果判定标准：以被检样本的OD值是一组阴性样本OD值的2或3倍，即为阳性，比值以P/N表示，1.5<P/N<2.0为可疑，P/N<1.5为阴性。

不同浓度的免疫抑制肽和脂多糖LPS与脾细胞共培养，做三组重复。48小时后收获上清，用ELISA检测试剂盒检测白细胞介素10(IL-10)，干扰素-γ(IFN-γ)和单核细胞趋化蛋白(MCP-1)等细胞因子。

图1中，不同颜色的条带分别对应不同的处理；单加样组和样品-LPS共刺激组间差异显著P<0.05用*标出，差异极显著P<0.01用**标出；medium表示培养基，+和-分别表示加入和未加入相应的试剂；如图1所示，用ELISA的方法，检测大鼠脾细胞细胞因子的释放水平发现免疫抑制肽HA能显著增加由LPS诱导的小鼠脾细胞白介素10(IL-10)的分泌并抑制干扰素IFN-γ和单核细胞趋化蛋白MCP-1的分泌。存在明显的量效关系。

实施例4：拟黑腹瘤虻免疫抑制肽HA溶血活性测定。

将采集的新鲜C57小鼠血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成107-108cell/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液与溶解于生理盐水的拟黑腹瘤虻免疫抑制肽HA样品混合，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用TritonX-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比H％＝A样品-A阴性对照/A阳性对照×100％。

结果表明HA浓度为200μg/ml时，溶血百分比为2.45％。说明拟黑腹瘤虻免疫抑制肽HA对哺乳动物红细胞具有极低的溶血活性。

实施例5：拟黑腹瘤虻免疫抑制肽HA的动物体内炎症免疫抑制模型：

我们采用弗氏完全佐剂致炎模型评价HA体内潜在的抗炎能力。在昆明小鼠右后足底注射20μl生理盐水(阴性对照组)或弗氏完全佐剂(Sigma)(12只/组)。并使用游标卡尺记录下小鼠足底厚度。随后的1-14天，小鼠在后腿部肌肉注射不同剂量(2,4和8mg/kg)免疫抑制肽HA。对照注射同样体积的生理盐水。然后在用游标卡尺测量0，1，4，8，11和14天小鼠的足底厚度以作为炎症指标。

如图2所示，随着处理时间的增加，免疫抑制肽HA的抗炎作用随着浓度的升高而增强。1天给药后，8毫克/公斤的注射剂量便可使足底厚度恢复到正常状态，14天之后，各个给药组均可很好的抑制弗氏完全佐剂所致的足底炎症模型。

Claims (7)

1.一种拟黑腹瘤虻来源的免疫抑制肽HA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo.：2所示。

2.一种拟黑腹瘤虻来源的免疫抑制肽HA的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo.：1所示。

3.权利要求1所述的拟黑腹瘤虻来源的免疫抑制肽HA的制备方法，其特征在于，根据SEQIDNo.：2所示的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。

4.权利要求1所述的拟黑腹瘤虻来源的免疫抑制肽HA在制备免疫抑制药物中的应用。

5.权利要求1所述的拟黑腹瘤虻来源的免疫抑制肽HA在制备炎症免疫抑制药物中的应用。

6.权利要求2所述的拟黑腹瘤虻来源的免疫抑制肽HA的编码基因在制备免疫抑制药物中的应用。

7.权利要求2所述的拟黑腹瘤虻来源的免疫抑制肽HA的编码基因在制备炎症免疫抑制药物中的应用。