CN105148266B - 一种w/o型疫苗油佐剂制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种W/O型疫苗油佐剂制剂及其制备方法。所述制剂为W/O型乳液，其中水相为含有抗原的溶液，油相包含白油、乳化剂和稳定剂；所述W/O型乳液的平均粒径在0.1‑8.22μm之间，分散系数小于0.1。所述方法通过将预乳液转移至快速膜乳化的储料罐中，在0.1‑2.5MPa压力下过微孔膜，得到所述W/O型疫苗油佐剂制剂。本发明的W/O型疫苗油佐剂制剂尺寸均一、可控，乳液均一性的提高有利于乳滴稳定性增强，奥氏熟化过程比传统方法制备的乳液更慢，进而使其在注射进体内后，抗原突释低，而后期抗原持续释放，诱导快速、高效、持续的免疫应答水平。

Description

一种W/O型疫苗油佐剂制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，尤其涉及兽用疫苗领域中均一、可控的W/O型疫苗油佐剂制剂及其制备方法，可用于提高制剂稳定性，诱导快速免疫应答以及提升免疫应答强度和水平。

背景技术

随着经济全球化进程的加快，动物及动物产品的流通越来越频繁，动物疫病的传播媒介不断增多，发病和病害流行的几率显著增加，在造成经济损失的同时，也严重危害了人类的健康和生命安全。据不完全统计，近20年来，新增加的动物疫病就有10余种，其中猪蓝耳病、猪伪狂犬病、圆环病毒等疫病均对我国的养猪业造成了较大影响。2004年以来全球蔓延爆发的高致病性禽流感疫情更是对我国养禽业发展构成了严重挑战。近十年来，虽然我国畜牧业的产值平均以10％的速度增长，但是因疫病造成的畜禽死亡率，比西方国家至少高出1倍多，严重制约了现代畜牧产业的发展。如猪传染性疫病中因呼吸道引起的疾病特别突出，发病率达30％～60％，死亡率达5％～30％。而疫苗发展是积极有效防控动物疫病的策略之一。

目前已发展的动物疫苗包括活疫苗(弱毒疫苗、基因缺失疫苗、载体疫苗和病毒抗体复合物疫苗)和灭活疫苗(灭活病毒疫苗、化学合成疫苗、分泌抗原疫苗、基因工程亚单位疫苗、抗独特型抗体疫苗和免疫复合体疫苗)。随着生物技术的快速发展，一些新型疫苗不断研制成功，推动了免疫佐剂研制的发展。免疫佐剂是指先于抗原或与抗原同时，或与抗原混合后注射动物，能非特异性增强机体对抗原免疫应答的物质。目前，在兽用疫苗中应用和发展的佐剂包括化学类免疫佐剂(如氢氧化铝、弗氏佐剂、矿物油、水花生油乳剂、吐温-80、司盘、左旋咪唑和脂质体等)、微生物类免疫佐剂(如分枝杆菌、BCC、脂多糖、胞壁酰二肽、胞肽、脂溶性蜡质D和短小棒状杆菌)、植物类免疫佐剂(如茯苓多糖、红花多糖、酵母多糖、香菇多糖和中草药类等)、生化类免疫佐剂(如胸腺肽、转移因子、白细胞介素、干扰素和肿瘤坏死因子等)、抗生素类免疫佐剂(如红霉素和伊维菌素)，聚合物微球载体、硒、维生素(如维生素E、D、C)免疫刺激复合物(1SCOMS)等也在作为免疫佐剂被研究。

在众多佐剂中，矿物油佐剂是兽用疫苗尤其是禽类疫苗中应用最多的佐剂。以矿物油为佐剂的疫苗制剂中，通过乳化过程将抗原包覆于油滴中，油滴发挥了抗原储库作用，在注射部位持续释放抗原，防止抗原从注射部位的快速清除，诱导高效、持续的免疫应答水平。因此，油佐剂制剂中抗原在注射部位的释放行为是影响抗原特异性免疫应答强度、水平和持续时间的关键。

抗原的释放行为与乳液的性质密切相关，包括乳滴粒径大小、乳液粒径分布和油相组成等。基于奥氏熟化理论，乳液粒径分布的不同，会导致其储存稳定性的差异，粒径分布越不均一，越容易发生小粒径乳滴逐渐瓦解、大粒径乳滴逐渐长大，而大乳滴长大到一定程度又会发生破裂，因此在小液滴瓦解和大液滴长大的融合过程中，伴随着抗原的释放；而乳滴尺寸越均一，稳定性就越好。由此可以看出，粒径分布的差异会导致抗原释放行为的差异。而这种差异会进一步导致体内免疫效果的差异。本发明旨在兽用疫苗油佐剂疫苗制剂中建立一种新型的乳液制备方法即快速膜乳化法，制备粒径均一、可控的油佐剂疫苗制剂，克服传统高速搅拌、均质乳化、超声等方法制备的乳液粒径不均一、不可控、批次间重复性不佳的问题；同时，在粒径均一的基础上获得高效、持续的免疫应答效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种尺寸均一、可控、免疫应答水平高、免疫应答持久的W/O型疫苗油佐剂制剂及其制备方法。本发明提供的W/O型疫苗油佐剂制剂尺寸均一、可控，乳液均一性的提高有利于乳滴稳定性增强，奥氏熟化过程比传统方法制备的乳液更慢，进而使其在注射进体内后，抗原突释低，而后期抗原持续释放，诱导快速、高效、持续的免疫应答水平。

为实现本发明的目的，采用以下技术方案：

在第一方面，本发明提供一种W/O型疫苗油佐剂制剂，所述制剂为W/O型乳液，其中水相为含有抗原的溶液，油相包含白油、乳化剂和稳定剂；所述W/O型乳液的平均粒径在0.1-8.22μm之间，分散系数(PDI)小于0.1。

本发明提供的乳滴尺寸均一、可控的W/O型疫苗油佐剂制剂，其乳滴的粒度分散系数(PDI)小于0.1，粒径在纳米级至微米级可控，可有效提高储存稳定性并降低突释。该均一乳液可稳定储存6个月以上不发生分层，抗原在前2天几乎不释放，后期能持续释放4周或更长时间。

本发明中，所述PDI的定义为：多分散系数，代表乳滴均匀分散的程度，即粒度分布系数。该数值越小，乳滴分布越均匀。相反地，该数值越大，乳滴分布越宽泛。一般认为PDI小于0.1的乳液具有单分散性。

作为本发明的优选方案，所述W/O型乳液的平均粒径在0.59-8.22μm之间，优选0.59-5.0μm之间。

作为本发明的优选方案，所述抗原选自禽流感灭活病毒、新城疫灭活病毒、猪圆环病毒和口蹄疫病毒中的1种或至少2种的组合。需要说明的是，这里列举的抗原仅是几种典型但非限定性的实例，本领域的技术人员应当理解本发明的W/O型疫苗油佐剂制剂及其制备方法具有普适性，可采用各种抗原。

作为本发明的优选方案，所述乳化剂为亲水亲油平衡值在3.5～6.0之间的表面活性剂。

优选地，所述乳化剂选自Span60、Span80和Span83中的1种或至少2种的组合。需要说明的是，这里列举的乳化剂仅是几种典型但非限定性的实例，本领域的技术人员应当理解本发明的W/O型疫苗油佐剂制剂及其制备方法具有普适性，可采用各种制备乳液常用的乳化剂。

作为本发明的优选方案，所述稳定剂选自硬脂酸、硬酯酸铝和单硬酯酸甘油酯中的1种或至少2种的组合。需要说明的是，这里列举的稳定剂仅是几种典型但非限定性的实例，本领域的技术人员应当理解本发明的W/O型疫苗油佐剂制剂及其制备方法具有普适性，可采用各种制备乳液常用的稳定剂。

在第二方面，本发明提供一种制备第一方面所述的W/O型疫苗油佐剂制剂的方法，包括以下步骤：

(1)将含有抗原的溶液作为水相分散于包含白油、乳化剂和稳定剂的油相中，获得W/O(油包水)型预乳液；

(2)将所述W/O型预乳液转移至快速膜乳化的储料罐中，在0.1-2.5MPa压力下过微孔膜，得到所述W/O型疫苗油佐剂制剂。

本发明提供的乳滴尺寸均一、可控的W/O型疫苗油佐剂制剂，其粒径大小可通过所选用的微孔膜的孔径实现控制，其粒径均一性可通过过膜压力和过膜次数进行优化调控。

上述制备方法中，所述压力可在0.1-2.5MPa之间调节，这主要由制备过程中使用的微孔膜孔径的大小及目标乳液大小的制备要求所决定。

作为本发明的优选方案，所述步骤(1)中水相与油相的体积比为1:1～1:10。在此范围内形成的W/O型预乳液稳定性高，利于下一步过微孔膜的操作。

作为本发明的优选方案，所述抗原选自禽流感灭活病毒、新城疫灭活病毒、猪圆环病毒和口蹄疫病毒中的1种或至少2种的组合。

优选地，所述乳化剂为亲水亲油平衡值在3.5～6.0之间的表面活性剂。

优选地，所述乳化剂选自Span60、Span80和Span83中的1种或至少2种的组合。

优选地，所述稳定剂选自硬脂酸、硬酯酸铝和单硬酯酸甘油酯中的1种或至少2种的组合。

本发明的制备方法中，所述预乳液粒径大小最好大于膜孔径，预乳液的制备方法，可通过均质乳化、超声乳化、机械搅拌或磁力搅拌等常规方法制备。

本发明的制备方法中，所述的微孔膜可选择选亲水性膜，如玻璃膜、聚碳酸酯膜、纤维膜或陶瓷膜等。在制备过程中，可通过选择不同孔径的微孔膜来控制乳滴的粒径大小，常用的微孔膜孔径为0.5-50μm，更优选为0.8-9.2μm。

本发明方法制备效率很高，预乳液过膜时的流速大小高达10ml·s^-1，因而制备过程大多瞬间完成。

本发明的制备方法中，所述的步骤(2)中过微孔膜可反复进行多次，即将步骤(2)所得的乳液作为预乳液用压力再次通过微孔膜，直至得到的乳液的粒径大小与均一性满足要求。对于大多数体系而言，过膜次数为3-5次。

本发明的制备方法与现有技术相比，具有如下特点：

(1)本发明提供的乳滴粒径均一、可控的油佐剂疫苗制剂制备方法，均一的乳液不仅储存稳定，大大减慢奥氏熟化进程，作为兽用疫苗制剂时，有效降低抗原在注射部位前2天的抗原释放，而后期抗原持续稳定释放，提升免疫应答水平和持续性。

(2)本发明的W/O型疫苗油佐剂制剂，乳滴尺寸均一、可控，分散系数(PDI)小于0.1，乳液稳定性好，能够储存6个月以上；抗原能持续释放4周或更长时间。

(3)本发明的W/O型疫苗油佐剂制剂的制备方法，可通过控制制备过程中的微孔膜孔径大小和操作压力来控制产品的粒径大小和均一性。

(4)本发明的W/O型疫苗油佐剂制剂的制备方法，克服了现有技术制备的油佐剂乳液制剂粒径不均一、不可控的问题，保证了批次间产品的可重复性，特别是保障了抗原释放的可控性。

(5)本发明方法制备条件耗能低、温和；制备参数可控性强、重现性好；制备出的油佐剂乳液粒径均一、可控，利于大规模工业化生产。

本发明的有益效果体现在：针对兽用疫苗油佐剂乳液制剂，提供一种乳滴尺寸均一、可控的乳液制备方法，所制备的乳液制剂乳滴粒径分布窄，储存稳定性显著提升，同时，可大大降低注射后在注射部位抗原的突释效应，持续释放可达1个月之久，体内免疫结果表明，均一油佐剂制剂可有效提升抗原特异性免疫应答水平和持续性。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是本发明中快速膜乳化法制备乳液的装置和原理示意图。

图2是实施例1中传统高速搅拌法制备的乳液显微镜照片。

图3是实施例2中快速膜乳化法制备的乳液显微镜照片。

图4是实施例1和实施例2所述的乳液粒径分布图。

图5是实施例4中以BSA为模型抗原高速搅拌下制备的乳液的显微镜照片。

图6是实施例5中以BSA为模型抗原快速膜乳化制备的乳液的显微镜照片。

图7是实施例6所述的抗原体外释放行为结果图。

图8是实施例7中抗原在注射部位的募集情况。

图9是实施例8中不同乳液免疫后的新城疫的血凝抑制结果。

图10是实施例9中不同乳液免疫后的禽流感的血凝抑制结果。

图11是实施例10中不同乳液免疫后的新城疫的特异性抗体结果。

图12是实施例11中不同乳液免疫后的禽流感的特异性抗体结果。

图13是实施例12中的免疫后外周血中CD4^-CD8⁺/CD4⁺CD8^-的结果。

图14是实施例12中不同乳液免疫后的外周血中CD4⁺CD8⁺比例。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。

实施例1

量取20mL含灭活新城疫和禽流感病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含Span80和稳定剂硬脂酸铝的白油作为油相(O)，将油相加入至匀浆机中，在3500转/分钟条件下，将水相(W)加入至油相(O)中，均质匀浆3分钟，随后，将转数调整至10000转/分钟，继续乳化5分钟，得到W/O型油佐剂鸡新城疫-禽流感二联疫苗制剂。光学显微镜照片如图2所示，结果表明所制备的乳液中有较大的液滴；所制备的乳液进行粒径和粒径分布的测定，采用带有粒径分析功能的ZetaPlus测定，用移液管取1滴上述制备的乳液加入至1mL的油相中，将其转移至ZetaPlus的样品池中，采用ZetaPlus仪进行乳液粒径与粒径分布的测定，结果如图4所示，结果表明，传统高速搅拌制备的乳液平均粒径为2.226μm，粒径分布系数PDI为0.187，粒径分布较宽。所制备乳液在常温下储存7个月后分层，在低温下储存12个月后分层，在高温(40℃下)储存3个月后分层。

实施例2

采用孔径为2.8μm的微孔膜制备含鸡新城疫-禽流感二联疫苗的油佐剂制剂，量取20mL含灭活新城疫和禽流感病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含Span80和稳定剂硬脂酸铝的白油作为油相(O)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/O预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在0.45MPa的氮气压力下，反复过膜3次，得到的W/O型油佐剂疫苗制剂。光学显微镜照片如图3所示，结果表明所制备的乳液粒径均一性好；所制备的乳液进行粒径和粒径分布的测定，采用带有粒径分析功能的ZetaPlus测定，用移液管取1滴上述制备的乳液加入至1mL的油相中，将其转移至ZetaPlus的样品池中，采用ZetaPlus仪进行乳液粒径与粒径分布的测定。结果如图4所示，结果表明，快速膜乳化制备的乳液平均粒径为2.446μm，粒径分布系数PDI为0.057，与实施例1中高速搅拌制备的乳液相比，粒径均一性更佳。所制备乳液在常温下储存12个月不分层，在低温下储存18个月后不分层，在高温(40℃下)储存6个月后不分层。

实施例3

由于所用的鸡新城疫-禽流感灭活病毒疫苗未经纯化，很难进行抗原量的准确定量，导致无法进行抗原体外释放行为研究。为此，采用牛血清白蛋白(BSA)为模型抗原，进行乳液制备，进行抗原体外释放行为研究。精确称取一定量的BSA，将其溶于一定体积的去离子水中，配制浓度为500mg/mL的BSA溶液，量取20mL的BSA溶液作为水相(W)，量取60mL含Span80的白油和稳定剂硬脂酸铝作为油相(O)，将油相加入至匀浆机中，在3500转/分钟条件下，将水相(W)加入至油相(O)中，均质匀浆3分钟，随后，将转数调整至10000转/分钟，继续乳化5分钟，得到W/O型油佐剂鸡新城疫-禽流感二联疫苗制剂。其平均粒径和粒径分布采用带有粒径分析功能的ZetaPlus测定纳，其平均粒径为2.312μm，粒径分布系数PDI为0.198，光学显微镜照片如图5所示，结果表明所制备的乳液中有较大的液滴，粒径分布比较宽。

实施例4

由于所用的鸡新城疫-禽流感灭活病毒疫苗未经纯化，很难进行抗原量的准确定量，导致无法进行抗原体外释放行为研究。为此，采用牛血清白蛋白(BSA)为模型抗原，进行乳液制备，进行抗原体外释放行为研究。同样采用孔径为2.8μm的微孔膜进行乳液制备。精确称取一定量的BSA，将其溶于一定体积的去离子水中，配制浓度为500mg/mL的BSA溶液，量取20mL的BSA溶液作为水相(W)，量取60mL含Span80和稳定剂硬脂酸铝的白油作为油相(O)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/O预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在0.45MPa的氮气压力下，反复过膜3次，得到的W/O型油佐剂疫苗制剂。其平均粒径和粒径分布采用带有粒径分析功能的ZetaPlus测定纳，其平均粒径为2.458μm，粒径分布系数PDI为0.060，光学显微镜照片如图6所示，结果表明所制备的乳液粒径分布窄，粒径均一性好。

实施例5

分别精确量取实施例3和实施例4中所制备的含模型抗原BSA的乳液1mL，将其加入至透析袋中，两端封好，将其置于140mL含0.01M磷酸盐的等渗缓冲液(pH7.2)中，在37℃的恒温摇床中进行抗原释放，在预先设定的时间点，从透析袋外的缓冲液中取样400μL，同时，补加新鲜的磷酸盐缓冲液确保总体积不变，取样至第20天；采用微量BCA法测定样品中BSA蛋白含量，进而计算各时间点的蛋白累积释放量，并以时间作图，得到不同方法乳液中蛋白的释放行为曲线。结果如图7所示，从图中可以看出，在前2天，传统高速搅拌制备的乳液，抗原突释比较高，达20％左右，而快速膜乳化制备的乳液则几乎没有抗原的释放，第3天仅有3％的抗原发生了释放。

实施例6

采用Balb/c小鼠(雌性，6-8周)开展注射部位免疫细胞募集实验，实验分两组，即高速搅拌制备的乳液与快速膜乳化制备的乳液，每组6只，以实施例3和实施例4中制备的乳液进行免疫实验，免疫剂量为100μL乳液/只，其中含有BSA量为10μg，采用皮下注射方式免疫。在预先设定的时间点，将免疫后的小鼠处死，取下注射部位的皮肤及其皮下组织，将其用pH7.4的磷酸盐缓冲液彻底冲洗，并剪成小块儿。将这些组织用酶消化后过细胞筛，得到单细胞悬液。将此单细胞悬液采用流失抗体Ly6C-APC、CD11b-eFlour450、Ly6G-FITC、CD11c-APC-Cy7和F4/80-PE进行染色，上流式细胞仪进行免疫细胞募集情况分析。结果如图8所示，结果表明，高速搅拌制备的油佐剂疫苗制剂和快速膜乳化法制备的油佐剂疫苗制剂在注射部位对免疫细胞募集具有相似的结果趋势，其中，中性粒细胞NPh在注射后24-48h达到峰值，单核细胞Mo和巨噬细胞MPh在注射后48h达到峰值，树突状细胞DC在注射后72h达到峰值，通常认为，DC是体内最强大的抗原提呈细胞，因此，认为72h之前释放的抗原大部分没有被DC所摄取发挥免疫应答功能，只有72h及其之后释放的抗原才能被最大程度加工、呈递，并最终发挥提升免疫应答的功能。

实施例7

以7-10日龄的雌性SPF鸡(female White Leghorn chickens)开展免疫实验，共分4组，每组10只，采用皮下注射免疫方式。实验组分别取实施例1和实施例2中所制备的油佐剂疫苗制剂对SPF鸡进行免疫，免疫剂量分别为250μL/只；对照组1为无油佐剂组，即每只鸡各免疫31μL的新城疫(NDV)和禽流感(AIV)的抗原溶液；对照组2为不免疫组。免疫后分别于第10、15、22和28天取血，用于新城疫和禽流感血凝抑制抗体检测。抗新城疫抗原的HI滴度结果如图9所示，结果表明，第10天时，膜乳化制备的油佐剂疫苗能够诱导显著高于高速搅拌组的HI抗体滴度，而后续15天、22天和28天，两者诱导了相似的HI抗体滴度，表明快速膜乳化制备的油佐剂疫苗制剂能够诱导更快和更强的体液免疫应答水平。

实施例8

以7-10日龄的雌性SPF鸡(female White Leghorn chickens)开展免疫实验，共分4组，每组10只，采用皮下注射免疫方式。实验组分别取实施例1和实施例2中所制备的油佐剂疫苗制剂对SPF鸡进行免疫，免疫剂量分别为250μL/只；对照组1为无油佐剂组，即每只鸡各免疫31μL的新城疫(NDV)和禽流感(AIV)的抗原溶液；对照组2为不免疫组。免疫后分别于第10、15、22和28天取血，用于新城疫和禽流感血凝抑制抗体检测。抗禽流感抗原的HI滴度结果如图10所示，结果表明，在第10天和第22天，膜乳化制备的油佐剂疫苗能够诱导显著高于高速搅拌组的HI抗体滴度，而在第15天和第28天，两者诱导了相似的HI抗体滴度，表明快速膜乳化制备的油佐剂疫苗制剂能够诱导更快和更强的体液免疫应答水平。

实施例9

以7-10日龄的雌性SPF鸡(female White Leghorn chickens)开展免疫实验，共分4组，每组10只，采用皮下注射免疫方式。实验组分别取实施例1和实施例2中所制备的油佐剂疫苗制剂对SPF鸡进行免疫，免疫剂量分别为250μL/只；对照组1为无油佐剂组，即每只鸡各免疫31μL的新城疫(NDV)和禽流感(AIV)的抗原溶液；对照组2为不免疫组。免疫后分别于第10、15、22和28天取血，用于抗原特异性抗体IgG的检测。结果如图11所示，结果表明，快速膜乳化制备的油佐剂疫苗制剂诱导的特异性抗体水平在各时间点均显著高于高速搅拌制备的油佐剂疫苗制剂，进一步证实，快速膜乳化制备的均一乳液能够诱导更强的体液免疫应答水平。

实施例10

以7-10日龄的雌性SPF鸡(female White Leghorn chickens)开展免疫实验，共分4组，每组10只，采用皮下注射免疫方式。实验组分别取实施例1和实施例2中所制备的油佐剂疫苗制剂对SPF鸡进行免疫，免疫剂量分别为250μL/只；对照组1为无油佐剂组，即每只鸡各免疫31μL的新城疫(NDV)和禽流感(AIV)的抗原溶液；对照组2为不免疫组。免疫后分别于第10、15、22和28天取血，用于抗原特异性抗体IgG的检测。结果如图12所示，结果表明，快速膜乳化制备的油佐剂疫苗制剂诱导的特异性抗体水平在第10天、第22天和第28天均高于高速搅拌制备的油佐剂疫苗制剂，进一步证实，快速膜乳化制备的均一乳液能够诱导更强的体液免疫应答水平。

实施例11

提取免疫后的鸡外周血，并分离获得外周血淋巴细胞，采用流式抗体RPE-CD4和CY5-CD8分别标记CD4和CD8，避光、4℃下孵育30min；染色完毕后，上流式细胞仪进行CD4⁺和CD8⁺细胞定量检测。免疫后外周血中CD4^-CD8⁺/CD4⁺CD8^-的结果如图13所示，结果表明，免疫油乳剂后，外周血中CD8⁺/CD4⁺显著高于纯抗原组，表明通过免疫油乳剂能够有效提高免疫系统的活化水平。通过对比膜乳化技术制备的油乳剂与常规方法制备的油乳剂发现，快速膜乳化技术制备的油乳剂能够诱导产生更高的CD8⁺/CD4⁺，该结果也可表明与常规高速搅拌方法制备的油乳剂相比，快速膜乳化技术制备的油乳剂能够诱导产生更强的免疫活化。不同乳液免疫后的外周血中CD4⁺CD8⁺比例结果如图14所示，结果表明，在鸡外周血中存在着CD4⁺CD8⁺双阳性的细胞(DP T细胞)，研究表明，这些双阳性细胞为抗原特异性记忆细胞，能够产生疫苗诱导的记忆性免疫应答。外周循环DP T细胞是一种独特的T细胞群，是成熟的记忆细胞,具有典型的CD4⁺和CD8⁺T细胞功能。由图14可明显看出，免疫快速膜乳化技术制备的油乳剂后，外周血中DP T细胞的比例显著高于常规高速搅拌方法制备的油乳剂组，表明快速膜乳化技术的油乳剂能够诱导更高水平的免疫应答。

实施例12

采用孔径为2.8μm的微孔膜制备含猪圆环病毒疫苗的油佐剂制剂，量取60mL含猪圆环病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含Span60(1.0％)和稳定剂硬脂酸(0.5％)的白油作为油相(O)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/O预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在0.45MPa的氮气压力下，反复过膜3次，得到平均粒径为2.22μm、PDI值为0.059的均一W/O型油佐剂疫苗制剂。免疫后在7、14、35天的抗体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.6个滴度)。

实施例13

采用孔径为2.8μm的微孔膜制备含猪圆环病毒疫苗的油佐剂制剂，量取10mL含猪圆环病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含乳化剂Span83(0.8％)和稳定剂单硬脂酸甘油酯(1.0％)的白油作为油相(O)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/O预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在0.45MPa的氮气压力下，反复过膜3次，得到平均粒径为2.19μm、PDI值为0.052的均一W/O型油佐剂疫苗制剂。免疫后在7、14、35天的抗体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.4个滴度)。

实施例14

采用孔径为2.8μm的微孔膜制备含猪圆环的油佐剂制剂，量取6mL含猪圆环病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含乳化剂Span60和Span83及稳定剂硬脂酸和单硬脂酸甘油脂的白油作为油相(O)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/O预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在0.45MPa的氮气压力下，反复过膜3次，得到平均粒径为2.28μm、PDI值为0.053的均一W/O型油佐剂疫苗制剂。免疫后在7、14、35天的抗体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.2个滴度)。

实施例15

采用孔径为0.5μm的微孔膜制备含口蹄疫病毒疫苗的油佐剂制剂，量取20mL含灭活口蹄疫病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含乳化剂Span83(0.2％)和稳定剂单硬脂酸甘油酯(2.0％)的白油作为油相(O)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/O预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在1.00MPa的氮气压力下，反复过膜3次，得到平均粒径为0.59μm、PDI值为0.058的均一W/O型油佐剂疫苗制剂。免疫后在7、28、35天的抗体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.3个滴度)。

实施例16

采用孔径为9.2μm的微孔膜制备含口蹄疫病毒疫苗的油佐剂制剂，量取20mL含灭活口蹄疫病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含乳化剂(0.6％)Span83和稳定剂单硬脂酸甘油酯(2.0％)的白油作为油相(O)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/O预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在0.15MPa的氮气压力下，反复过膜3次，得到平均粒径为8.22μm、PDI值为0.072的均一W/O型油佐剂疫苗制剂。免疫后在7、28、35天的抗体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.15个滴度)。

实施例17

采用孔径为2.8μm的微孔膜制备含猪蓝耳病病毒疫苗的油佐剂制剂，量取30mL含灭活猪蓝耳病病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含乳化剂Span83和稳定剂单硬脂酸甘油酯的白油作为油相(O)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/O预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在0.45MPa的氮气压力下，反复过膜5次，得到平均粒径为2.32μm、PDI值为0.060的均一W/O型油佐剂疫苗制剂。免疫后在10、28、42天的抗体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.8个滴度)。

实施例18

采用孔径为2.8μm的微孔膜制备含猪蓝耳病病毒疫苗的油佐剂制剂，量取6mL含灭活猪蓝耳病病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含乳化剂Span83和稳定剂单硬脂酸甘油酯的白油作为油相(O)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/O预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在0.45MPa的氮气压力下，反复过膜3次，得到平均粒径为2.21μm、PDI值为0.050的均一W/O型油佐剂疫苗制剂。免疫后在10、28、42天的抗体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.3个滴度)。

实施例19

采用孔径为2.8μm的微孔膜制备含猪蓝耳病病毒疫苗的油佐剂制剂，量取20mL含灭活猪蓝耳病病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含乳化剂Span83和稳定剂单硬脂酸甘油酯的白油作为油相(O)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/O预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在0.45MPa的氮气压力下，反复过膜3次，得到平均粒径为2.26μm、PDI值为0.055的均一W/O型油佐剂疫苗制剂。免疫后在10、28、42天的抗体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.5个滴度)。

实施例20

采用孔径为0.5μm的微孔膜制备含鸡新城疫-禽流感二联疫苗的油佐剂制剂，量取20mL含灭活新城疫和禽流感病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含Span80和稳定剂硬脂酸铝的白油作为油相(O)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/O预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在2.5MPa的氮气压力下，反复过膜3次，得到的W/O型油佐剂疫苗制剂。所制备的乳液平均粒径为0.1234μm、PDI值为0.078，粒径均一性好。免疫后在10、28、42天的抗体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.6个滴度)。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (17)

1.一种W/O型疫苗油佐剂制剂，其特征在于，所述制剂为W/O型乳液，其中水相为含有抗原的溶液，油相包含白油、乳化剂和稳定剂；所述W/O型乳液的平均粒径在0.1-8.22μm之间，分散系数小于0.1。

2.根据权利要求1所述的W/O型疫苗油佐剂制剂，其特征在于，所述W/O型乳液的平均粒径在0.59-8.22μm之间。

3.根据权利要求2所述的W/O型疫苗油佐剂制剂，其特征在于，所述W/O型乳液的平均粒径在0.59-5.0μm之间。

4.根据权利要求1所述的W/O型疫苗油佐剂制剂，其特征在于，所述抗原选自禽流感灭活病毒、新城疫灭活病毒、猪圆环病毒和口蹄疫病毒中的1种或至少2种的组合。

5.根据权利要求1所述的W/O型疫苗油佐剂制剂，其特征在于，所述乳化剂为亲水亲油平衡值在3.5～6.0之间的表面活性剂。

6.根据权利要求5所述的W/O型疫苗油佐剂制剂，其特征在于，所述乳化剂选自Span60、Span80和Span83中的1种或至少2种的组合。

7.根据权利要求1所述的W/O型疫苗油佐剂制剂，其特征在于，所述稳定剂选自硬脂酸、硬酯酸铝和单硬酯酸甘油酯中的1种或至少2种的组合。

8.一种制备权利要求1-7任一项所述的W/O型疫苗油佐剂制剂的方法，包括以下步骤：

(1)将含有抗原的溶液作为水相分散于包含白油、乳化剂和稳定剂的油相中，获得W/O型预乳液；

(2)将所述W/O型预乳液转移至快速膜乳化的储料罐中，在0.1-2.5MPa压力下过微孔膜，得到所述W/O型疫苗油佐剂制剂。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中水相与油相的体积比为1:1～1:10。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗原选自禽流感灭活病毒、新城疫灭活病毒、猪圆环病毒和口蹄疫病毒中的1种或至少2种的组合。

11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述乳化剂为亲水亲油平衡值在3.5～6.0之间的表面活性剂。

12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述乳化剂选自Span60、Span80和Span83中的1种或至少2种的组合。

13.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述稳定剂选自硬脂酸、硬酯酸铝和单硬酯酸甘油酯中的1种或至少2种的组合。

14.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中采用均质乳化、超声乳化、机械搅拌或磁力搅拌将所述水相分散于所述油相中，获得W/O型预乳液。

15.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中微孔膜的孔径为0.5-50μm。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中微孔膜的孔径为0.8-9.2μm。

17.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中过微孔膜反复进行，次数为3-5次。