CN105148266B - 一种w/o型疫苗油佐剂制剂及其制备方法 - Google Patents
一种w/o型疫苗油佐剂制剂及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105148266B CN105148266B CN201410239171.XA CN201410239171A CN105148266B CN 105148266 B CN105148266 B CN 105148266B CN 201410239171 A CN201410239171 A CN 201410239171A CN 105148266 B CN105148266 B CN 105148266B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- emulsion
- oil
- preparation
- oil adjuvant
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 96
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 86
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 title claims abstract description 85
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims abstract description 134
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims abstract description 73
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 64
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 64
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 64
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 40
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 34
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims abstract description 24
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims abstract description 8
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 claims description 20
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 claims description 18
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 claims description 17
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 13
- CUNWUEBNSZSNRX-RKGWDQTMSA-N (2r,3r,4r,5s)-hexane-1,2,3,4,5,6-hexol;(z)-octadec-9-enoic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O CUNWUEBNSZSNRX-RKGWDQTMSA-N 0.000 claims description 11
- NWGKJDSIEKMTRX-AAZCQSIUSA-N Sorbitan monooleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O NWGKJDSIEKMTRX-AAZCQSIUSA-N 0.000 claims description 9
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 claims description 8
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- HVUMOYIDDBPOLL-XGKPLOKHSA-N [2-[(2r,3r,4s)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-2-hydroxyethyl] octadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O HVUMOYIDDBPOLL-XGKPLOKHSA-N 0.000 claims description 6
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 claims description 6
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 4
- -1 glycidic acid ester Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000006210 lotion Substances 0.000 claims 4
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 claims 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 claims 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 claims 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims 2
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 claims 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 abstract description 60
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract description 57
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 abstract description 20
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 16
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 64
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 62
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 33
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 28
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 23
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 23
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 22
- 238000009775 high-speed stirring Methods 0.000 description 22
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 15
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 15
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 15
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 13
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 13
- 238000010907 mechanical stirring Methods 0.000 description 12
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 10
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 9
- 229940075507 glyceryl monostearate Drugs 0.000 description 9
- 239000001788 mono and diglycerides of fatty acids Substances 0.000 description 9
- 241000202347 Porcine circovirus Species 0.000 description 8
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 8
- CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K aluminium tristearate Chemical compound [Al+3].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 7
- 229940063655 aluminum stearate Drugs 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 208000005342 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 5
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 5
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 4
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 4
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 238000003921 particle size analysis Methods 0.000 description 4
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 3
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 3
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 3
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 3
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 3
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- 229940124873 Influenza virus vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229960004274 stearic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- CVOFKRWYWCSDMA-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-(2,6-diethylphenyl)-n-(methoxymethyl)acetamide;2,6-dinitro-n,n-dipropyl-4-(trifluoromethyl)aniline Chemical compound CCC1=CC=CC(CC)=C1N(COC)C(=O)CCl.CCCN(CCC)C1=C([N+]([O-])=O)C=C(C(F)(F)F)C=C1[N+]([O-])=O CVOFKRWYWCSDMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZSNMRSAGSSBNP-UHFFFAOYSA-N 22,23-dihydroavermectin B1a Natural products C1CC(C)C(C(C)CC)OC21OC(CC=C(C)C(OC1OC(C)C(OC3OC(C)C(O)C(OC)C3)C(OC)C1)C(C)C=CC=C1C3(C(C(=O)O4)C=C(C)C(O)C3OC1)O)CC4C2 AZSNMRSAGSSBNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SPBDXSGPUHCETR-JFUDTMANSA-N 8883yp2r6d Chemical compound O1[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](OC)C[C@H](O[C@@H]2C(=C/C[C@@H]3C[C@@H](C[C@@]4(O[C@@H]([C@@H](C)CC4)C(C)C)O3)OC(=O)[C@@H]3C=C(C)[C@@H](O)[C@H]4OC\C([C@@]34O)=C/C=C/[C@@H]2C)/C)O[C@H]1C.C1C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@@]21O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]1O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C1)[C@@H](C)\C=C\C=C/1[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\1)O)C[C@H]4C2 SPBDXSGPUHCETR-JFUDTMANSA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 235000003255 Carthamus tinctorius Nutrition 0.000 description 1
- 244000020518 Carthamus tinctorius Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241001533384 Circovirus Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 229920001491 Lentinan Polymers 0.000 description 1
- HLFSDGLLUJUHTE-SNVBAGLBSA-N Levamisole Chemical compound C1([C@H]2CN3CCSC3=N2)=CC=CC=C1 HLFSDGLLUJUHTE-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000635201 Pumilus Species 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102000007501 Thymosin Human genes 0.000 description 1
- 108010046075 Thymosin Proteins 0.000 description 1
- 108010074506 Transfer Factor Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 229920000392 Zymosan Polymers 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940029202 anti-idiotypic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000032625 disorder of ear Diseases 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 238000007499 fusion processing Methods 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 description 1
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 1
- 230000005931 immune cell recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229960002418 ivermectin Drugs 0.000 description 1
- 229940115286 lentinan Drugs 0.000 description 1
- 229960001614 levamisole Drugs 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003836 peripheral circulation Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005316 response function Methods 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N thymosin Chemical compound SC[C@@H](N)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H]([C@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(O)=O LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明涉及一种W/O型疫苗油佐剂制剂及其制备方法。所述制剂为W/O型乳液，其中水相为含有抗原的溶液，油相包含白油、乳化剂和稳定剂；所述W/O型乳液的平均粒径在0.1‑8.22μm之间，分散系数小于0.1。所述方法通过将预乳液转移至快速膜乳化的储料罐中，在0.1‑2.5MPa压力下过微孔膜，得到所述W/O型疫苗油佐剂制剂。本发明的W/O型疫苗油佐剂制剂尺寸均一、可控，乳液均一性的提高有利于乳滴稳定性增强，奥氏熟化过程比传统方法制备的乳液更慢，进而使其在注射进体内后，抗原突释低，而后期抗原持续释放，诱导快速、高效、持续的免疫应答水平。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗技术领域，尤其涉及兽用疫苗领域中均一、可控的W/O型疫苗油佐剂制剂及其制备方法，可用于提高制剂稳定性，诱导快速免疫应答以及提升免疫应答强度和水平。
背景技术
随着经济全球化进程的加快，动物及动物产品的流通越来越频繁，动物疫病的传播媒介不断增多，发病和病害流行的几率显著增加，在造成经济损失的同时，也严重危害了人类的健康和生命安全。据不完全统计，近20年来，新增加的动物疫病就有10余种，其中猪蓝耳病、猪伪狂犬病、圆环病毒等疫病均对我国的养猪业造成了较大影响。2004年以来全球蔓延爆发的高致病性禽流感疫情更是对我国养禽业发展构成了严重挑战。近十年来，虽然我国畜牧业的产值平均以10％的速度增长，但是因疫病造成的畜禽死亡率，比西方国家至少高出1倍多，严重制约了现代畜牧产业的发展。如猪传染性疫病中因呼吸道引起的疾病特别突出，发病率达30％～60％，死亡率达5％～30％。而疫苗发展是积极有效防控动物疫病的策略之一。
目前已发展的动物疫苗包括活疫苗(弱毒疫苗、基因缺失疫苗、载体疫苗和病毒抗体复合物疫苗)和灭活疫苗(灭活病毒疫苗、化学合成疫苗、分泌抗原疫苗、基因工程亚单位疫苗、抗独特型抗体疫苗和免疫复合体疫苗)。随着生物技术的快速发展，一些新型疫苗不断研制成功，推动了免疫佐剂研制的发展。免疫佐剂是指先于抗原或与抗原同时，或与抗原混合后注射动物，能非特异性增强机体对抗原免疫应答的物质。目前，在兽用疫苗中应用和发展的佐剂包括化学类免疫佐剂(如氢氧化铝、弗氏佐剂、矿物油、水花生油乳剂、吐温-80、司盘、左旋咪唑和脂质体等)、微生物类免疫佐剂(如分枝杆菌、BCC、脂多糖、胞壁酰二肽、胞肽、脂溶性蜡质D和短小棒状杆菌)、植物类免疫佐剂(如茯苓多糖、红花多糖、酵母多糖、香菇多糖和中草药类等)、生化类免疫佐剂(如胸腺肽、转移因子、白细胞介素、干扰素和肿瘤坏死因子等)、抗生素类免疫佐剂(如红霉素和伊维菌素)，聚合物微球载体、硒、维生素(如维生素E、D、C)免疫刺激复合物(1SCOMS)等也在作为免疫佐剂被研究。
在众多佐剂中，矿物油佐剂是兽用疫苗尤其是禽类疫苗中应用最多的佐剂。以矿物油为佐剂的疫苗制剂中，通过乳化过程将抗原包覆于油滴中，油滴发挥了抗原储库作用，在注射部位持续释放抗原，防止抗原从注射部位的快速清除，诱导高效、持续的免疫应答水平。因此，油佐剂制剂中抗原在注射部位的释放行为是影响抗原特异性免疫应答强度、水平和持续时间的关键。
抗原的释放行为与乳液的性质密切相关，包括乳滴粒径大小、乳液粒径分布和油相组成等。基于奥氏熟化理论，乳液粒径分布的不同，会导致其储存稳定性的差异，粒径分布越不均一，越容易发生小粒径乳滴逐渐瓦解、大粒径乳滴逐渐长大，而大乳滴长大到一定程度又会发生破裂，因此在小液滴瓦解和大液滴长大的融合过程中，伴随着抗原的释放；而乳滴尺寸越均一，稳定性就越好。由此可以看出，粒径分布的差异会导致抗原释放行为的差异。而这种差异会进一步导致体内免疫效果的差异。本发明旨在兽用疫苗油佐剂疫苗制剂中建立一种新型的乳液制备方法即快速膜乳化法，制备粒径均一、可控的油佐剂疫苗制剂，克服传统高速搅拌、均质乳化、超声等方法制备的乳液粒径不均一、不可控、批次间重复性不佳的问题；同时，在粒径均一的基础上获得高效、持续的免疫应答效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种尺寸均一、可控、免疫应答水平高、免疫应答持久的W/O型疫苗油佐剂制剂及其制备方法。本发明提供的W/O型疫苗油佐剂制剂尺寸均一、可控，乳液均一性的提高有利于乳滴稳定性增强，奥氏熟化过程比传统方法制备的乳液更慢，进而使其在注射进体内后，抗原突释低，而后期抗原持续释放，诱导快速、高效、持续的免疫应答水平。
为实现本发明的目的，采用以下技术方案：
在第一方面，本发明提供一种W/O型疫苗油佐剂制剂，所述制剂为W/O型乳液，其中水相为含有抗原的溶液，油相包含白油、乳化剂和稳定剂；所述W/O型乳液的平均粒径在0.1-8.22μm之间，分散系数(PDI)小于0.1。
本发明提供的乳滴尺寸均一、可控的W/O型疫苗油佐剂制剂，其乳滴的粒度分散系数(PDI)小于0.1，粒径在纳米级至微米级可控，可有效提高储存稳定性并降低突释。该均一乳液可稳定储存6个月以上不发生分层，抗原在前2天几乎不释放，后期能持续释放4周或更长时间。
本发明中，所述PDI的定义为：多分散系数，代表乳滴均匀分散的程度，即粒度分布系数。该数值越小，乳滴分布越均匀。相反地，该数值越大，乳滴分布越宽泛。一般认为PDI小于0.1的乳液具有单分散性。
作为本发明的优选方案，所述W/O型乳液的平均粒径在0.59-8.22μm之间，优选0.59-5.0μm之间。
作为本发明的优选方案，所述抗原选自禽流感灭活病毒、新城疫灭活病毒、猪圆环病毒和口蹄疫病毒中的1种或至少2种的组合。需要说明的是，这里列举的抗原仅是几种典型但非限定性的实例，本领域的技术人员应当理解本发明的W/O型疫苗油佐剂制剂及其制备方法具有普适性，可采用各种抗原。
作为本发明的优选方案，所述乳化剂为亲水亲油平衡值在3.5～6.0之间的表面活性剂。
优选地，所述乳化剂选自Span60、Span80和Span83中的1种或至少2种的组合。需要说明的是，这里列举的乳化剂仅是几种典型但非限定性的实例，本领域的技术人员应当理解本发明的W/O型疫苗油佐剂制剂及其制备方法具有普适性，可采用各种制备乳液常用的乳化剂。
作为本发明的优选方案，所述稳定剂选自硬脂酸、硬酯酸铝和单硬酯酸甘油酯中的1种或至少2种的组合。需要说明的是，这里列举的稳定剂仅是几种典型但非限定性的实例，本领域的技术人员应当理解本发明的W/O型疫苗油佐剂制剂及其制备方法具有普适性，可采用各种制备乳液常用的稳定剂。
在第二方面，本发明提供一种制备第一方面所述的W/O型疫苗油佐剂制剂的方法，包括以下步骤：
(1)将含有抗原的溶液作为水相分散于包含白油、乳化剂和稳定剂的油相中，获得W/O(油包水)型预乳液；
(2)将所述W/O型预乳液转移至快速膜乳化的储料罐中，在0.1-2.5MPa压力下过微孔膜，得到所述W/O型疫苗油佐剂制剂。
本发明提供的乳滴尺寸均一、可控的W/O型疫苗油佐剂制剂，其粒径大小可通过所选用的微孔膜的孔径实现控制，其粒径均一性可通过过膜压力和过膜次数进行优化调控。
上述制备方法中，所述压力可在0.1-2.5MPa之间调节，这主要由制备过程中使用的微孔膜孔径的大小及目标乳液大小的制备要求所决定。
作为本发明的优选方案，所述步骤(1)中水相与油相的体积比为1:1～1:10。在此范围内形成的W/O型预乳液稳定性高，利于下一步过微孔膜的操作。
作为本发明的优选方案，所述抗原选自禽流感灭活病毒、新城疫灭活病毒、猪圆环病毒和口蹄疫病毒中的1种或至少2种的组合。
优选地，所述乳化剂为亲水亲油平衡值在3.5～6.0之间的表面活性剂。
优选地，所述乳化剂选自Span60、Span80和Span83中的1种或至少2种的组合。
优选地，所述稳定剂选自硬脂酸、硬酯酸铝和单硬酯酸甘油酯中的1种或至少2种的组合。
本发明的制备方法中，所述预乳液粒径大小最好大于膜孔径，预乳液的制备方法，可通过均质乳化、超声乳化、机械搅拌或磁力搅拌等常规方法制备。
本发明的制备方法中，所述的微孔膜可选择选亲水性膜，如玻璃膜、聚碳酸酯膜、纤维膜或陶瓷膜等。在制备过程中，可通过选择不同孔径的微孔膜来控制乳滴的粒径大小，常用的微孔膜孔径为0.5-50μm，更优选为0.8-9.2μm。
本发明方法制备效率很高，预乳液过膜时的流速大小高达10ml·s-1，因而制备过程大多瞬间完成。
本发明的制备方法中，所述的步骤(2)中过微孔膜可反复进行多次，即将步骤(2)所得的乳液作为预乳液用压力再次通过微孔膜，直至得到的乳液的粒径大小与均一性满足要求。对于大多数体系而言，过膜次数为3-5次。
本发明的制备方法与现有技术相比，具有如下特点：
(1)本发明提供的乳滴粒径均一、可控的油佐剂疫苗制剂制备方法，均一的乳液不仅储存稳定，大大减慢奥氏熟化进程，作为兽用疫苗制剂时，有效降低抗原在注射部位前2天的抗原释放，而后期抗原持续稳定释放，提升免疫应答水平和持续性。
(2)本发明的W/O型疫苗油佐剂制剂，乳滴尺寸均一、可控，分散系数(PDI)小于0.1，乳液稳定性好，能够储存6个月以上；抗原能持续释放4周或更长时间。
(3)本发明的W/O型疫苗油佐剂制剂的制备方法，可通过控制制备过程中的微孔膜孔径大小和操作压力来控制产品的粒径大小和均一性。
(4)本发明的W/O型疫苗油佐剂制剂的制备方法，克服了现有技术制备的油佐剂乳液制剂粒径不均一、不可控的问题，保证了批次间产品的可重复性，特别是保障了抗原释放的可控性。
(5)本发明方法制备条件耗能低、温和；制备参数可控性强、重现性好；制备出的油佐剂乳液粒径均一、可控，利于大规模工业化生产。
本发明的有益效果体现在：针对兽用疫苗油佐剂乳液制剂，提供一种乳滴尺寸均一、可控的乳液制备方法，所制备的乳液制剂乳滴粒径分布窄，储存稳定性显著提升，同时，可大大降低注射后在注射部位抗原的突释效应，持续释放可达1个月之久，体内免疫结果表明，均一油佐剂制剂可有效提升抗原特异性免疫应答水平和持续性。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明中快速膜乳化法制备乳液的装置和原理示意图。
图2是实施例1中传统高速搅拌法制备的乳液显微镜照片。
图3是实施例2中快速膜乳化法制备的乳液显微镜照片。
图4是实施例1和实施例2所述的乳液粒径分布图。
图5是实施例4中以BSA为模型抗原高速搅拌下制备的乳液的显微镜照片。
图6是实施例5中以BSA为模型抗原快速膜乳化制备的乳液的显微镜照片。
图7是实施例6所述的抗原体外释放行为结果图。
图8是实施例7中抗原在注射部位的募集情况。
图9是实施例8中不同乳液免疫后的新城疫的血凝抑制结果。
图10是实施例9中不同乳液免疫后的禽流感的血凝抑制结果。
图11是实施例10中不同乳液免疫后的新城疫的特异性抗体结果。
图12是实施例11中不同乳液免疫后的禽流感的特异性抗体结果。
图13是实施例12中的免疫后外周血中CD4-CD8+/CD4+CD8-的结果。
图14是实施例12中不同乳液免疫后的外周血中CD4+CD8+比例。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
实施例1
量取20mL含灭活新城疫和禽流感病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含Span80和稳定剂硬脂酸铝的白油作为油相(O)，将油相加入至匀浆机中，在3500转/分钟条件下，将水相(W)加入至油相(O)中，均质匀浆3分钟，随后，将转数调整至10000转/分钟，继续乳化5分钟，得到W/O型油佐剂鸡新城疫-禽流感二联疫苗制剂。光学显微镜照片如图2所示，结果表明所制备的乳液中有较大的液滴；所制备的乳液进行粒径和粒径分布的测定，采用带有粒径分析功能的ZetaPlus测定，用移液管取1滴上述制备的乳液加入至1mL的油相中，将其转移至ZetaPlus的样品池中，采用ZetaPlus仪进行乳液粒径与粒径分布的测定，结果如图4所示，结果表明，传统高速搅拌制备的乳液平均粒径为2.226μm，粒径分布系数PDI为0.187，粒径分布较宽。所制备乳液在常温下储存7个月后分层，在低温下储存12个月后分层，在高温(40℃下)储存3个月后分层。
实施例2
采用孔径为2.8μm的微孔膜制备含鸡新城疫-禽流感二联疫苗的油佐剂制剂，量取20mL含灭活新城疫和禽流感病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含Span80和稳定剂硬脂酸铝的白油作为油相(O)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/O预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在0.45MPa的氮气压力下，反复过膜3次，得到的W/O型油佐剂疫苗制剂。光学显微镜照片如图3所示，结果表明所制备的乳液粒径均一性好；所制备的乳液进行粒径和粒径分布的测定，采用带有粒径分析功能的ZetaPlus测定，用移液管取1滴上述制备的乳液加入至1mL的油相中，将其转移至ZetaPlus的样品池中，采用ZetaPlus仪进行乳液粒径与粒径分布的测定。结果如图4所示，结果表明，快速膜乳化制备的乳液平均粒径为2.446μm，粒径分布系数PDI为0.057，与实施例1中高速搅拌制备的乳液相比，粒径均一性更佳。所制备乳液在常温下储存12个月不分层，在低温下储存18个月后不分层，在高温(40℃下)储存6个月后不分层。
实施例3
由于所用的鸡新城疫-禽流感灭活病毒疫苗未经纯化，很难进行抗原量的准确定量，导致无法进行抗原体外释放行为研究。为此，采用牛血清白蛋白(BSA)为模型抗原，进行乳液制备，进行抗原体外释放行为研究。精确称取一定量的BSA，将其溶于一定体积的去离子水中，配制浓度为500mg/mL的BSA溶液，量取20mL的BSA溶液作为水相(W)，量取60mL含Span80的白油和稳定剂硬脂酸铝作为油相(O)，将油相加入至匀浆机中，在3500转/分钟条件下，将水相(W)加入至油相(O)中，均质匀浆3分钟，随后，将转数调整至10000转/分钟，继续乳化5分钟，得到W/O型油佐剂鸡新城疫-禽流感二联疫苗制剂。其平均粒径和粒径分布采用带有粒径分析功能的ZetaPlus测定纳，其平均粒径为2.312μm，粒径分布系数PDI为0.198，光学显微镜照片如图5所示，结果表明所制备的乳液中有较大的液滴，粒径分布比较宽。
实施例4
由于所用的鸡新城疫-禽流感灭活病毒疫苗未经纯化，很难进行抗原量的准确定量，导致无法进行抗原体外释放行为研究。为此，采用牛血清白蛋白(BSA)为模型抗原，进行乳液制备，进行抗原体外释放行为研究。同样采用孔径为2.8μm的微孔膜进行乳液制备。精确称取一定量的BSA，将其溶于一定体积的去离子水中，配制浓度为500mg/mL的BSA溶液，量取20mL的BSA溶液作为水相(W)，量取60mL含Span80和稳定剂硬脂酸铝的白油作为油相(O)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/O预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在0.45MPa的氮气压力下，反复过膜3次，得到的W/O型油佐剂疫苗制剂。其平均粒径和粒径分布采用带有粒径分析功能的ZetaPlus测定纳，其平均粒径为2.458μm，粒径分布系数PDI为0.060，光学显微镜照片如图6所示，结果表明所制备的乳液粒径分布窄，粒径均一性好。
实施例5
分别精确量取实施例3和实施例4中所制备的含模型抗原BSA的乳液1mL，将其加入至透析袋中，两端封好，将其置于140mL含0.01M磷酸盐的等渗缓冲液(pH7.2)中，在37℃的恒温摇床中进行抗原释放，在预先设定的时间点，从透析袋外的缓冲液中取样400μL，同时，补加新鲜的磷酸盐缓冲液确保总体积不变，取样至第20天；采用微量BCA法测定样品中BSA蛋白含量，进而计算各时间点的蛋白累积释放量，并以时间作图，得到不同方法乳液中蛋白的释放行为曲线。结果如图7所示，从图中可以看出，在前2天，传统高速搅拌制备的乳液，抗原突释比较高，达20％左右，而快速膜乳化制备的乳液则几乎没有抗原的释放，第3天仅有3％的抗原发生了释放。
实施例6
采用Balb/c小鼠(雌性，6-8周)开展注射部位免疫细胞募集实验，实验分两组，即高速搅拌制备的乳液与快速膜乳化制备的乳液，每组6只，以实施例3和实施例4中制备的乳液进行免疫实验，免疫剂量为100μL乳液/只，其中含有BSA量为10μg，采用皮下注射方式免疫。在预先设定的时间点，将免疫后的小鼠处死，取下注射部位的皮肤及其皮下组织，将其用pH7.4的磷酸盐缓冲液彻底冲洗，并剪成小块儿。将这些组织用酶消化后过细胞筛，得到单细胞悬液。将此单细胞悬液采用流失抗体Ly6C-APC、CD11b-eFlour450、Ly6G-FITC、CD11c-APC-Cy7和F4/80-PE进行染色，上流式细胞仪进行免疫细胞募集情况分析。结果如图8所示，结果表明，高速搅拌制备的油佐剂疫苗制剂和快速膜乳化法制备的油佐剂疫苗制剂在注射部位对免疫细胞募集具有相似的结果趋势，其中，中性粒细胞NPh在注射后24-48h达到峰值，单核细胞Mo和巨噬细胞MPh在注射后48h达到峰值，树突状细胞DC在注射后72h达到峰值，通常认为，DC是体内最强大的抗原提呈细胞，因此，认为72h之前释放的抗原大部分没有被DC所摄取发挥免疫应答功能，只有72h及其之后释放的抗原才能被最大程度加工、呈递，并最终发挥提升免疫应答的功能。
实施例7
以7-10日龄的雌性SPF鸡(female White Leghorn chickens)开展免疫实验，共分4组，每组10只，采用皮下注射免疫方式。实验组分别取实施例1和实施例2中所制备的油佐剂疫苗制剂对SPF鸡进行免疫，免疫剂量分别为250μL/只；对照组1为无油佐剂组，即每只鸡各免疫31μL的新城疫(NDV)和禽流感(AIV)的抗原溶液；对照组2为不免疫组。免疫后分别于第10、15、22和28天取血，用于新城疫和禽流感血凝抑制抗体检测。抗新城疫抗原的HI滴度结果如图9所示，结果表明，第10天时，膜乳化制备的油佐剂疫苗能够诱导显著高于高速搅拌组的HI抗体滴度，而后续15天、22天和28天，两者诱导了相似的HI抗体滴度，表明快速膜乳化制备的油佐剂疫苗制剂能够诱导更快和更强的体液免疫应答水平。
实施例8
以7-10日龄的雌性SPF鸡(female White Leghorn chickens)开展免疫实验，共分4组，每组10只，采用皮下注射免疫方式。实验组分别取实施例1和实施例2中所制备的油佐剂疫苗制剂对SPF鸡进行免疫，免疫剂量分别为250μL/只；对照组1为无油佐剂组，即每只鸡各免疫31μL的新城疫(NDV)和禽流感(AIV)的抗原溶液；对照组2为不免疫组。免疫后分别于第10、15、22和28天取血，用于新城疫和禽流感血凝抑制抗体检测。抗禽流感抗原的HI滴度结果如图10所示，结果表明，在第10天和第22天，膜乳化制备的油佐剂疫苗能够诱导显著高于高速搅拌组的HI抗体滴度，而在第15天和第28天，两者诱导了相似的HI抗体滴度，表明快速膜乳化制备的油佐剂疫苗制剂能够诱导更快和更强的体液免疫应答水平。
实施例9
以7-10日龄的雌性SPF鸡(female White Leghorn chickens)开展免疫实验，共分4组，每组10只，采用皮下注射免疫方式。实验组分别取实施例1和实施例2中所制备的油佐剂疫苗制剂对SPF鸡进行免疫，免疫剂量分别为250μL/只；对照组1为无油佐剂组，即每只鸡各免疫31μL的新城疫(NDV)和禽流感(AIV)的抗原溶液；对照组2为不免疫组。免疫后分别于第10、15、22和28天取血，用于抗原特异性抗体IgG的检测。结果如图11所示，结果表明，快速膜乳化制备的油佐剂疫苗制剂诱导的特异性抗体水平在各时间点均显著高于高速搅拌制备的油佐剂疫苗制剂，进一步证实，快速膜乳化制备的均一乳液能够诱导更强的体液免疫应答水平。
实施例10
以7-10日龄的雌性SPF鸡(female White Leghorn chickens)开展免疫实验，共分4组，每组10只，采用皮下注射免疫方式。实验组分别取实施例1和实施例2中所制备的油佐剂疫苗制剂对SPF鸡进行免疫，免疫剂量分别为250μL/只；对照组1为无油佐剂组，即每只鸡各免疫31μL的新城疫(NDV)和禽流感(AIV)的抗原溶液；对照组2为不免疫组。免疫后分别于第10、15、22和28天取血，用于抗原特异性抗体IgG的检测。结果如图12所示，结果表明，快速膜乳化制备的油佐剂疫苗制剂诱导的特异性抗体水平在第10天、第22天和第28天均高于高速搅拌制备的油佐剂疫苗制剂，进一步证实，快速膜乳化制备的均一乳液能够诱导更强的体液免疫应答水平。
实施例11
提取免疫后的鸡外周血，并分离获得外周血淋巴细胞，采用流式抗体RPE-CD4和CY5-CD8分别标记CD4和CD8，避光、4℃下孵育30min；染色完毕后，上流式细胞仪进行CD4+和CD8+细胞定量检测。免疫后外周血中CD4-CD8+/CD4+CD8-的结果如图13所示，结果表明，免疫油乳剂后，外周血中CD8+/CD4+显著高于纯抗原组，表明通过免疫油乳剂能够有效提高免疫系统的活化水平。通过对比膜乳化技术制备的油乳剂与常规方法制备的油乳剂发现，快速膜乳化技术制备的油乳剂能够诱导产生更高的CD8+/CD4+，该结果也可表明与常规高速搅拌方法制备的油乳剂相比，快速膜乳化技术制备的油乳剂能够诱导产生更强的免疫活化。不同乳液免疫后的外周血中CD4+CD8+比例结果如图14所示，结果表明，在鸡外周血中存在着CD4+CD8+双阳性的细胞(DP T细胞)，研究表明，这些双阳性细胞为抗原特异性记忆细胞，能够产生疫苗诱导的记忆性免疫应答。外周循环DP T细胞是一种独特的T细胞群，是成熟的记忆细胞,具有典型的CD4+和CD8+T细胞功能。由图14可明显看出，免疫快速膜乳化技术制备的油乳剂后，外周血中DP T细胞的比例显著高于常规高速搅拌方法制备的油乳剂组，表明快速膜乳化技术的油乳剂能够诱导更高水平的免疫应答。
实施例12
采用孔径为2.8μm的微孔膜制备含猪圆环病毒疫苗的油佐剂制剂，量取60mL含猪圆环病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含Span60(1.0％)和稳定剂硬脂酸(0.5％)的白油作为油相(O)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/O预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在0.45MPa的氮气压力下，反复过膜3次，得到平均粒径为2.22μm、PDI值为0.059的均一W/O型油佐剂疫苗制剂。免疫后在7、14、35天的抗体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.6个滴度)。
实施例13
采用孔径为2.8μm的微孔膜制备含猪圆环病毒疫苗的油佐剂制剂，量取10mL含猪圆环病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含乳化剂Span83(0.8％)和稳定剂单硬脂酸甘油酯(1.0％)的白油作为油相(O)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/O预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在0.45MPa的氮气压力下，反复过膜3次，得到平均粒径为2.19μm、PDI值为0.052的均一W/O型油佐剂疫苗制剂。免疫后在7、14、35天的抗体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.4个滴度)。
实施例14
采用孔径为2.8μm的微孔膜制备含猪圆环的油佐剂制剂，量取6mL含猪圆环病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含乳化剂Span60和Span83及稳定剂硬脂酸和单硬脂酸甘油脂的白油作为油相(O)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/O预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在0.45MPa的氮气压力下，反复过膜3次，得到平均粒径为2.28μm、PDI值为0.053的均一W/O型油佐剂疫苗制剂。免疫后在7、14、35天的抗体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.2个滴度)。
实施例15
采用孔径为0.5μm的微孔膜制备含口蹄疫病毒疫苗的油佐剂制剂，量取20mL含灭活口蹄疫病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含乳化剂Span83(0.2％)和稳定剂单硬脂酸甘油酯(2.0％)的白油作为油相(O)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/O预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在1.00MPa的氮气压力下，反复过膜3次，得到平均粒径为0.59μm、PDI值为0.058的均一W/O型油佐剂疫苗制剂。免疫后在7、28、35天的抗体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.3个滴度)。
实施例16
采用孔径为9.2μm的微孔膜制备含口蹄疫病毒疫苗的油佐剂制剂，量取20mL含灭活口蹄疫病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含乳化剂(0.6％)Span83和稳定剂单硬脂酸甘油酯(2.0％)的白油作为油相(O)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/O预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在0.15MPa的氮气压力下，反复过膜3次，得到平均粒径为8.22μm、PDI值为0.072的均一W/O型油佐剂疫苗制剂。免疫后在7、28、35天的抗体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.15个滴度)。
实施例17
采用孔径为2.8μm的微孔膜制备含猪蓝耳病病毒疫苗的油佐剂制剂，量取30mL含灭活猪蓝耳病病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含乳化剂Span83和稳定剂单硬脂酸甘油酯的白油作为油相(O)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/O预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在0.45MPa的氮气压力下，反复过膜5次，得到平均粒径为2.32μm、PDI值为0.060的均一W/O型油佐剂疫苗制剂。免疫后在10、28、42天的抗体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.8个滴度)。
实施例18
采用孔径为2.8μm的微孔膜制备含猪蓝耳病病毒疫苗的油佐剂制剂，量取6mL含灭活猪蓝耳病病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含乳化剂Span83和稳定剂单硬脂酸甘油酯的白油作为油相(O)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/O预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在0.45MPa的氮气压力下，反复过膜3次，得到平均粒径为2.21μm、PDI值为0.050的均一W/O型油佐剂疫苗制剂。免疫后在10、28、42天的抗体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.3个滴度)。
实施例19
采用孔径为2.8μm的微孔膜制备含猪蓝耳病病毒疫苗的油佐剂制剂，量取20mL含灭活猪蓝耳病病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含乳化剂Span83和稳定剂单硬脂酸甘油酯的白油作为油相(O)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/O预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在0.45MPa的氮气压力下，反复过膜3次，得到平均粒径为2.26μm、PDI值为0.055的均一W/O型油佐剂疫苗制剂。免疫后在10、28、42天的抗体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.5个滴度)。
实施例20
采用孔径为0.5μm的微孔膜制备含鸡新城疫-禽流感二联疫苗的油佐剂制剂，量取20mL含灭活新城疫和禽流感病毒的溶液，作为水相(W)，量取60mL含Span80和稳定剂硬脂酸铝的白油作为油相(O)，将水相(W)在机械搅拌下倒入油相(O)中，低速搅拌制备W/O预乳液，随后，将此预乳液转至快速膜乳化的储料罐中，在2.5MPa的氮气压力下，反复过膜3次，得到的W/O型油佐剂疫苗制剂。所制备的乳液平均粒径为0.1234μm、PDI值为0.078，粒径均一性好。免疫后在10、28、42天的抗体水平均高于高速搅拌法制备的不均一乳液(平均高出0.6个滴度)。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (17)
1.一种W/O型疫苗油佐剂制剂，其特征在于，所述制剂为W/O型乳液，其中水相为含有抗原的溶液，油相包含白油、乳化剂和稳定剂；所述W/O型乳液的平均粒径在0.1-8.22μm之间，分散系数小于0.1。
2.根据权利要求1所述的W/O型疫苗油佐剂制剂，其特征在于，所述W/O型乳液的平均粒径在0.59-8.22μm之间。
3.根据权利要求2所述的W/O型疫苗油佐剂制剂，其特征在于，所述W/O型乳液的平均粒径在0.59-5.0μm之间。
4.根据权利要求1所述的W/O型疫苗油佐剂制剂，其特征在于，所述抗原选自禽流感灭活病毒、新城疫灭活病毒、猪圆环病毒和口蹄疫病毒中的1种或至少2种的组合。
5.根据权利要求1所述的W/O型疫苗油佐剂制剂，其特征在于，所述乳化剂为亲水亲油平衡值在3.5～6.0之间的表面活性剂。
6.根据权利要求5所述的W/O型疫苗油佐剂制剂，其特征在于，所述乳化剂选自Span60、Span80和Span83中的1种或至少2种的组合。
7.根据权利要求1所述的W/O型疫苗油佐剂制剂，其特征在于，所述稳定剂选自硬脂酸、硬酯酸铝和单硬酯酸甘油酯中的1种或至少2种的组合。
8.一种制备权利要求1-7任一项所述的W/O型疫苗油佐剂制剂的方法，包括以下步骤：
(1)将含有抗原的溶液作为水相分散于包含白油、乳化剂和稳定剂的油相中，获得W/O型预乳液；
(2)将所述W/O型预乳液转移至快速膜乳化的储料罐中，在0.1-2.5MPa压力下过微孔膜，得到所述W/O型疫苗油佐剂制剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中水相与油相的体积比为1:1～1:10。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗原选自禽流感灭活病毒、新城疫灭活病毒、猪圆环病毒和口蹄疫病毒中的1种或至少2种的组合。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述乳化剂为亲水亲油平衡值在3.5～6.0之间的表面活性剂。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述乳化剂选自Span60、Span80和Span83中的1种或至少2种的组合。
13.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述稳定剂选自硬脂酸、硬酯酸铝和单硬酯酸甘油酯中的1种或至少2种的组合。
14.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中采用均质乳化、超声乳化、机械搅拌或磁力搅拌将所述水相分散于所述油相中，获得W/O型预乳液。
15.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中微孔膜的孔径为0.5-50μm。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中微孔膜的孔径为0.8-9.2μm。
17.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中过微孔膜反复进行，次数为3-5次。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410239171.XA CN105148266B (zh) | 2014-05-30 | 2014-05-30 | 一种w/o型疫苗油佐剂制剂及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410239171.XA CN105148266B (zh) | 2014-05-30 | 2014-05-30 | 一种w/o型疫苗油佐剂制剂及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105148266A CN105148266A (zh) | 2015-12-16 |
| CN105148266B true CN105148266B (zh) | 2018-09-04 |
Family
ID=54789524
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410239171.XA Active CN105148266B (zh) | 2014-05-30 | 2014-05-30 | 一种w/o型疫苗油佐剂制剂及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105148266B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107050449A (zh) * | 2016-10-19 | 2017-08-18 | 天津佐沐生物科技有限公司 | 一种水包油型疫苗佐剂及其制备方法 |
| JP7588959B2 (ja) * | 2020-02-27 | 2024-11-25 | 日東電工株式会社 | エマルションの製造方法および製造装置 |
| CN113209287B (zh) * | 2021-02-04 | 2022-07-08 | 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所 | 油包水型纳米疫苗佐剂、制备方法及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101670104A (zh) * | 2009-09-24 | 2010-03-17 | 浙江大学 | 一种含人参皂甙的油佐剂及其制备方法 |
| CN102579339A (zh) * | 2012-03-12 | 2012-07-18 | 天津瑞普高科生物药业有限公司 | 一种肉鸡用油乳剂疫苗及其制备方法 |
-
2014
- 2014-05-30 CN CN201410239171.XA patent/CN105148266B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101670104A (zh) * | 2009-09-24 | 2010-03-17 | 浙江大学 | 一种含人参皂甙的油佐剂及其制备方法 |
| CN102579339A (zh) * | 2012-03-12 | 2012-07-18 | 天津瑞普高科生物药业有限公司 | 一种肉鸡用油乳剂疫苗及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Adjuvants in influenza vaccines;Kohhei Tetsutani et al.;《Vaccine》;20121231;第30卷;7658-7661 * |
| 尺寸均一乳液的制备技术;巩方玲等;《生物颗粒与粉体制备、应用技术研讨会论文集》;20101231;120-121 * |
| 油乳佐剂的研究进展;骆东等;《中国家禽》;20081231;第30卷(第12期);35-37 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105148266A (zh) | 2015-12-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104013955B (zh) | 一种不含表面活性剂的水包油乳液及其用途 | |
| AU2006268466B2 (en) | Thermoreversible immuno-adjuvant emulsion | |
| Binjawadagi et al. | Adjuvanted poly (lactic-co-glycolic) acid nanoparticle-entrapped inactivated porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccine elicits cross-protective immune response in pigs | |
| Soares et al. | Oral hepatitis B vaccine: chitosan or glucan based delivery systems for efficient HBsAg immunization following subcutaneous priming | |
| CN104338126B (zh) | 一种具有治疗或预防hpv病毒的疫苗组合物及其应用 | |
| US20180099044A1 (en) | Lymph node-targeting nanoparticles | |
| CN109364243A (zh) | 一种抗原热稳定乳液及其制备方法和应用 | |
| CN109939229A (zh) | 一种自组装的纳米佐剂及由该佐剂形成的纳米疫苗的制备方法与应用 | |
| EP1418939A2 (en) | Calcium phosphate particles as mucosal adjuvants | |
| CN105148266B (zh) | 一种w/o型疫苗油佐剂制剂及其制备方法 | |
| CN102580079B (zh) | 猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN107375922B (zh) | 一种水溶性复合免疫佐剂及猪圆环病毒病疫苗 | |
| Preston et al. | Single-vial filovirus glycoprotein vaccines: Biophysical characteristics and immunogenicity after co-lyophilization with adjuvant | |
| Choe et al. | Efficacy of orally administered porcine epidemic diarrhea vaccine-loaded hydroxypropyl methylcellulose phthalate microspheres and RANKL-secreting L. lactis | |
| DE69822542T2 (de) | Verkapslung einer Untereinheit des Bovinen Herpes Virus Typ-1 in wässrigen Lösungsmitteln als Impfstoff. | |
| CN105169386B (zh) | 一种新型通用型基质疫苗佐剂及其制备方法和用途 | |
| CN113181354B (zh) | 基于树突状细胞的口蹄疫仿生纳米疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN102485772A (zh) | 壳聚糖微球作为基因疫苗载体的制备方法及应用 | |
| CN106031794A (zh) | 一种胞内pH响应聚乳酸类纳微球及其制备方法 | |
| Macedo et al. | Evaluation of different adjuvants formulations for bluetongue vaccine | |
| CN113616786B (zh) | 一种pickering乳液及其制备方法和在制备疫苗免疫佐剂中的应用 | |
| CN105168133B (zh) | 一种油乳剂制备方法 | |
| CN113967252A (zh) | 一种禽用免疫增强剂、含有免疫增强剂的疫苗组合物及其应用 | |
| TWI756948B (zh) | 胜肽奈米管之製備方法、用途及其免疫組成物 | |
| CN103417963A (zh) | 一种微囊化大肠杆菌口服灭活疫苗的优化制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |