CN105116147A - 检测dhav-1抗体的胶体金免疫层析试纸及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测DHAV-1抗体的胶体金免疫层析试纸及其制备方法，所述试纸由底板、硝酸纤维素膜、样品垫、金标垫和吸收垫组成，所述硝酸纤维素膜上的测试线由浓度≥0.75mg/ml的1型鸭甲肝病毒的病毒液包被而成，质控线由浓度≥0.4mg/ml的A抗B？IgG包被而成；所述金标垫由胶体金标记的浓度≥0.25mg/ml的金标葡萄球菌A蛋白包被而成；所述A抗B？IgG为免疫学研究中常规实验动物中除鸭外的任一种动物抗另一动物IgG。本发明所述试纸灵敏度高，特异性好，具有良好的批内和批间重复性，而且使用时耗时短，10min左右就能出检测结果，无需特殊仪器设备和专业技术人员，特别适合于基层使用。

Description

检测DHAV-1抗体的胶体金免疫层析试纸及其制备方法

技术领域

本发明涉及动物医学领域，具体涉及一种检测DHAV-1抗体的胶体金免疫层析试纸及其制备方法。

背景技术

鸭病毒性肝炎(DuckViralHepatitis)为主要由1型鸭甲肝病毒(DuckhepatitisAvirustypeI，DHAV-1)引起的雏鸭的一种急性、高度致病性传染病，发病急，传播迅速，病程短，死亡率高。临床表现角弓反张，剖检见肝脏肿大和大量的出血性斑点，是危害养鸭业的主要疾病之一。虽然我国研制的鸭肝炎鸡胚化弱毒疫苗和灭活苗，在全国应用推广，对种鸭、雏鸭进行免疫预防，取得很好的效果，然而，对DHAV-1特异性抗体的监测是评价DHAV-1弱毒疫苗和灭活苗免疫效果及制定合理免疫程序的关键，也是确认DHAV-1感染的手段之一。目前，用于DHAV-1抗体检测的方法主要有中和试验(neutralizationtest，NT)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)、琼脂凝胶扩散试验、Dot-ELISA测定法、间接血凝及血凝抑制试验等。其中经典的方法是血清中和试验，但其敏感性不够理想，且耗时费力，不适于大批量血清样品的检测。ELISA具有特异性强、敏感度高、快速准确、易于操作等特点，是DHAV-1感染早期快速诊断和免疫抗体监测的有效手段，但检测过程耗时费力。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测DHAV-1抗体的胶体金免疫层析试纸，该试纸检测鸭甲型肝炎病毒抗体的特异性和灵敏性较高，且操作简单，耗时少，只需10min左右即可完成检测，另，本发明还提供了上述胶体金免疫层析试纸的制备方法。

本发明采取的技术方案如下：

1、检测1型鸭甲肝病毒抗体的胶体金免疫层析试纸，由底板、硝酸纤维素膜、样品垫、金标垫和吸收垫组成，所述硝酸纤维素膜上的测试线由浓度≥0.75mg/ml的I型鸭甲肝病毒的病毒液包被而成，质控线由浓度≥0.4mg/ml的A抗BIgG包被而成；所述金标垫由胶体金标记的浓度≥0.25mg/ml的金标葡萄球菌A蛋白包被而成；所述A抗BIgG为免疫学研究中常规实验动物中除鸭外的任一种动物抗另一动物IgG。

优选的，所述硝酸纤维素膜上的测试线由浓度为0.75mg/ml的DHAV-1病毒液包被而成，质控线由浓度为0.4mg/ml的A抗BIgG包被而成；所述金标垫由胶体金标记的浓度为0.25mg/ml的金标葡萄球菌A蛋白包被而成。

优选的，所述A抗BIgG为羊抗兔IgG。

2、检测1型鸭甲肝病毒抗体的胶体金免疫层析试纸的制备方法，包括如下步骤：

(1)硝酸纤维素膜上质控线和测试线的喷制：将I型鸭甲肝病毒的病毒液点于硝酸纤维素膜上形成测试线，将A抗BIgG包被于硝酸纤维素膜上形成质控线，37℃干燥10～12h后密封保存；

(2)金标垫的制备：将胶体金标记的浓度为0.25mg/ml的金标葡萄球菌A蛋白均匀地喷涂于玻璃纤维素膜上，4℃冻干后密封保存；

(3)试纸的组装：分别将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘在底板上，硝酸纤维素膜上所述质控线一端靠近吸收垫，所述测试线一端靠近金标垫，切割成试纸条后，干燥密封低温保存。

优选的，所述步骤(1)中所述测试线和质控线之间的距离为0.6cm，测试线和质控线距硝酸纤维素膜边缘0.2cm。

优选的，所述步骤(2)中所述金标葡萄球菌A蛋白在进行胶体金标记时，最佳标记pH为每毫升金溶液加入6μl0.025mmol/LK₂CO₃溶液，最佳标记量为每毫升金溶液标记30μg金标葡萄球菌A蛋白。

本发明的有益效果在于：本发明通过将含有DHAV-1的尿囊液接种9～11日龄鸭胚，收集24h后死亡鸭胚尿囊液，并采用氯仿去脂、超速离心进行纯化并测定纯化后的DHAV-1浓度，进一步确定金标SPA工作浓度、优化羊抗兔IgG包被浓度、DHAV-1包被浓度等参数后，组装制备了胶体金免疫层析试纸。本试纸条具有以下优点：(1)敏感性高，将DHAV-1弱毒疫苗免疫鸭的阳性血清按体积稀释到32倍，也可以被本发明所述胶体金免疫层析试纸所检测；(2)运用该试纸检测非免疫鸭阴性血清、鸭瘟病毒阳性血清、鸭疫里默氏菌阳性血清、鸭沙门氏菌阳性血清、鸭甲型肝炎病毒阳性血清及鸭大肠杆菌阳性血清，结果显示只有I型鸭甲肝病毒阳性血清可见两条清晰的红色条带，呈阳性结果，而其他血清只在C线处可见一条红色条带，呈阴性结果，表明本试纸条具有很好的特异性；(3)应用本试纸检测DHAV-1抗体具有良好的批内和批间重复性；(4)本方法制备的试纸可在4℃或室温(25℃)保存数月；(5)应用该试纸检测鸭甲型肝炎病毒抗体的操作简单，耗时少，只需10min左右。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为胶体金免疫层析试纸条的组装示意图。

图2为胶体金免疫层析试纸条的结果判定示意图。

图3为试纸条的条件优化结果，其中，A图为纯化的DHAV-1在NC膜上包被浓度优化结果；B图为羊抗兔IgG在NC膜上包被浓度优化结果；C图为胶体金标记的SPA稀释度优化结果。

图4为所述胶体金免疫层析试纸条的灵敏度试验结果。

图5为所述胶体金免疫层析试纸条的特异性试验结果。

具体实施方式

下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。

材料及试剂：DHAV-1H株尿囊液(GeneBank登录号：JQ301467)，四川农业大学禽病防治中心提供；11日龄鸭胚，兔抗DHAV-1血清，四川农业大学禽病防治研究中心提供；氯仿，购自万科试剂公司；双抗，常规配制；PBS(pH7.4)缓冲液，常规配制并121℃高压灭菌；非免疫鸭阴性血清、鸭瘟病毒阳性血清、鸭传染性浆膜炎阳性血清、鸭沙门氏菌阳性血清、I型鸭甲肝病毒阳性血清及鸭大肠杆菌阳性血清，均由四川农业大学禽病防治研究中心保存；标记BSA及流动封闭BSA，购买于上海艾信生物科技有限公司；基于金标葡萄球菌A蛋白(StaphylococcusproteinA，SPA)，羊抗兔IgG,购买于杭州纽龙生物科技有限公司；硝酸纤维素膜(NC膜)、玻璃纤维素膜、吸水纸、PVC底板、20nm胶体金溶液，购买于上海金标生物科技有限公司；金标复溶液：含3％蔗糖和5％海藻糖及1％BSA的0.2MTris-HCl；样品垫处理液：含3％蔗糖和1％BSA及0.5％Tween-20的0.2MTris-HCl。

一、DHAV-1的增殖及纯化

1、DHAV-1的增殖

将实验室保存的含DHAV-1的尿囊液用无菌PBS做适当稀释后，添加双抗至终浓度为1％，37℃孵育30min，经尿囊腔接种于40枚9～11日龄鸭胚，0.2mL/枚，同时对另外五枚鸭胚，每枚注射0.2ml无菌PBS作为对照组。将上述鸭胚置于37℃孵化箱中孵化，每天观察胚胎生长状况，弃去24h内死亡的鸭胚，收集48～96h死亡的鸭胚，4℃保存过夜后收集尿囊液，-20℃保存备用。

2、病毒的纯化

将收集到的死亡鸭胚的尿囊液反复冻融3次后于4℃、5000r/min离心30min，弃沉淀；将上清与等体积氯仿混合，反复震荡均匀，分装于离心管并4℃静置1h，然后4℃、5000r/min离心30min，取上清，如此反复作用2次；收集的上清在高速离心机中40000r/min离心3h，收集的沉淀加少量灭菌PBS溶解并小管分装，测浓度后于-70℃保存备用。Westernblot结果表明纯化的DHAV-1可识别兔抗DHAV-1血清，表明其反应原性好。

二、DHAV-1抗体SPA胶体金免疫层析试纸条的制备方法及应用

1、检测DHAV-1抗体的胶体金免疫层析试纸条的制备

NC膜C线(质控线)、T线(测试线)的喷制：将纯化的DHAV-1和羊抗兔IgG用PB缓冲液(pH7.4)稀释后，分别划膜于NC膜上，2μl/cm，分别形成T、C线，T、C线相距0.6cm，距NC膜的边缘0.2cm，37℃干燥过夜后密封保存。

胶体金标记SPA及金标垫的制备：取50ml的20nm胶体金溶液于清洗干净的250ml烧杯中，调pH，按每毫升金溶液逐滴加入35μgSPA，混合均匀后，加入10％BSA至终浓度为1％，静置30min，4℃，8000r/min离心15min，加入1/10体积的金标复溶液，将其均匀地喷涂于玻璃纤维素膜上，4℃过夜冻干后密封保存。

试纸条的组装：分别将样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫依次粘在PVC塑料底板上，组装成型(如图1)，并切割成0.5cm宽的的试纸条，装于样品袋中，内置干燥剂密封保存于4℃。

将纯化的DHAV-1包被于T线，羊抗兔IgG包被于C线，胶体金标记的SPA固化于金标垫上，当鸭血清中的鸭抗DHAV-1抗体流经金标垫时，与金垫上固化的胶体金标记的SPA结合形成“鸭抗DHAV-1抗体-胶体金标记的SPA”复合物，该复合物继续流动，与T线上的DHAV-1抗原结合形成“DHAV-1-鸭抗DHAV-1抗体-胶体金标记的SPA”复合物，胶体金颗粒在T线上富集而呈现红色，且T线红色深浅与待检血清中抗体的含量成正比；而金垫上未与鸭抗DHAV-1抗体结合的金标SPA继续向前流动，与固化在C线上的羊抗兔IgG结合形成“胶体金标记的SPA-羊抗兔IgG”复合物，胶体金颗粒在C线富集而呈现出红色。因此，当向水平放置的试纸条上滴加约100μl待检血清时，在15min内观察反应结果，结果如图2所示，若出现C、T两条红线，则呈阳性，若只有C线呈红色，则为阴性结果，若C、T线均没有出现红色或只有T线出现红色，则表示试验失败。

2、胶体金免疫层析试纸条各条件优化

以下条件逐一组合，以确定试纸条检测DHAV-1抗体的最佳试验条件。

纯化的DHAV-1在NC膜上包被浓度的确定：将纯化的DHAV-1用0.01mol/LPB缓冲液(pH7.4)稀释成以下浓度：A：不稀释(2.0mg/ml)、B：1.5mg/ml、C：1.0mg/ml、D：0.75mg/ml、E：0.5mg/ml，然后分别将其划膜于NC膜上形成T线，其他条件不变，组装成胶体金试纸条并检测阳性血清，根据检测结果确定最佳稀释度作为工作浓度(如图3中A图所示)。

羊抗兔IgG在NC膜上包被浓度的确定：将羊抗兔IgG用0.01MPB缓冲液(pH7.4)稀释成以下浓度：A：1mg/ml、B：0.8mg/ml、C：0.6mg/ml、D：0.4mg/ml、E：0.2mg/ml，然后分别将其划膜于NC膜上形成C线，其他条件不变，组装成试纸条并检测阳性血清，根据检测结果确定最佳稀释度作为工作浓度(如图3中B图所示)。

胶体金标记的SPA稀释度的确定：取4个1.5mlEP管，分别加入1ml金标SPA溶液(未纯化)，离心后分别加入100μl、150μl、200μl和250μl金标复溶液，在其他条件不变的情况下，组装成试纸条并检测阳性血清，根据反应结果确定最佳稀释度作为工作浓度(如图3中C图所示)。

经过优化和筛选，获得胶体金免疫层析试纸条最佳条件为：(1)NC膜上T线上包被的DHAV-1病毒液浓度≧0.75mg/ml，C线上包被的羊抗兔IgG≧0.4mg/ml，分别将其喷点于NC膜上形成T、C线之后，37℃干燥过夜后，4℃密封保存备用。(2)1ml金标SPA溶液离心后加入150μl金标复溶液，均匀喷涂于玻璃纤维素膜上，4℃冻干过夜后，4℃密封保存备用。(3)将NC膜、金标垫、样品垫及吸收垫依次粘在PVC底板上，组装后剪切成0.5cm宽的试纸条，装于样品袋中，4℃密封保存。

3、检测DHAV-1抗体的胶体金免疫层析试纸条的应用

敏感性试验：将DHAV-1阳性血清按1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256和1:512进行倍比稀释，用上述方法制备的胶体金试免疫层析试纸条进行检测。检测结果如图4所示，当阳性血清稀释到1:16时，仍可见两条清晰的红色条带；当血清稀释到1:32时，T线隐约可见红色条带，C线有清晰可见红色条带；当血清稀释度在1:32以上时，只有C线出现清晰的红色条带，表明此方法能够检出1:32稀释的DHAV-1阳性血清。

特异性试验：用上述建立的胶体金免疫层析试纸条分别检测非免疫鸭阴性血清、DHAV-1阳性血清、鸭瘟病毒(DPV)阳性血清、鸭疫里默氏杆菌(RA)阳性血清、大肠杆菌(E.coli)及沙门氏菌阳性血清，观察该方法的特异性。检测结果如图5所示，只有DHAV-1阳性血清可见两条清晰可见的红色条带，其他血清检测结果只在C线有一条红色条带，表明该方法具有很好的特异性。

重复性试验：

批内重复性试验：用同一批次制备的胶体金试纸条分别检测非免疫鸭阴性血清1份和DHAV-1阳性血清1份，作3次重复，观察结果。

批间重复性试验：用3个不同批次制备的胶体金试纸条分别检测非免疫鸭阴性血清(1份)和DHAV-1阳性血清(1份)，作3次重复，观察结果。

批内可重复性试验结果显示，非免疫阴性血清及DHAV-1阳性血清的3次重复检测结果一致；批间可重复性试验结果显示，3个不同批次制备的试纸条分别非免疫阴性血清及DHAV-1阳性血清，3次重复检测结果均一致。表明建立的胶体金免疫层析试纸条具有良好的批内重复性及批间重复性。

稳定性试验：将试纸条干燥密封后分别置于4℃、室温(25℃)和37℃，室温(25℃)和37℃保存的试纸条每隔一周、4℃保存的试纸条每隔15天各取出6张分别检测非免疫阴性血清(3份)DHAV-1阳性血清(3份)，观察检测结果。结果显示，4℃存放时间最久，至少可保存3个月；室温(25℃)次之，至少可保存2个月以上；37℃再次之，可保存2个月。

4、讨论

标记物工作浓度的确定是保证试纸条灵敏度和特异性的关键因素，为保证定性诊断的准确性，需要严格控制NC膜上DHAV-1和羊抗兔IgG的包被浓度以及金垫上金标SPA的工作浓度。这是因为，浓度过高，一方面会使NC膜背景加深，另一方面也会增加非特异性反应，从而影响检测结果的判断；浓度过低，虽然可降低非特异性反应，避免假阳性结果，但同时也会降低灵敏度。在本发明中，经过优化和筛选，确定了胶体金免疫层析试纸条中的DHAV-1、羊抗兔IgG及金标SPA的最佳工作浓度分别为0.75mg/ml、0.4mg/ml、0.25mg/ml，当然，在高于上述最佳工作浓度时也同样可以检测到DHAV-1抗体。

胶体金免疫层析试纸条方法的检测下限为1纳克左右，与ELISA法相当，相对于原理相近的斑点免疫渗滤法更为灵敏。本发明将DHAV-1阳性血清作1:32稀释，仍呈阳性，说明本发明建立的胶体金免疫层析试纸条运用于DHAV-1抗体的检测，其灵敏度较好。大致原因如下：一是NC膜具有很好的吸附作用和滤过水分以及浓缩作用，因此，尽管抗原的包被量很少，但在NC膜T线上的抗原浓度实际上是很高的；二是本研究中的试纸条具有免疫反应和层析的特点，待测样品中的鸭抗DHAV-1抗体与金垫上胶体金标记的SPA不断结合，形成“鸭抗DHAV-1抗体-金标SPA”复合物，再经层析作用到达NC膜T线，与T线上的固相抗原DHAV-1结合形成“DHAV-1-鸭抗DHAV-1抗体-金标SPA”复合物，由于所有样品均经过NC膜持续反应，金颗粒持续聚集而使得颜色逐渐加深，实际上是对待测抗体起到浓缩作用，从而提高了灵敏度。三是在其他免疫性方法中，由于血清中抗体水平过高常常会导致带现象产生，即个别强阳性样品检测结果呈阴性的假阴性现象，而金标层析试纸法的抗原抗体反应是持续性的，从而避免了这一现象，提高了敏感性。本研究中发明的金标SPA试纸条在运用过程中，同时检测DHAV-1阳性血清、RA阳性血清、DPV阳性血清及鸭沙门氏菌阳性血清，结果只能检测出DHAV-1阳性血清，说明该方法特异性好。批内和批间重复性试验证实了该方法具有良好的可重复性。此外，对制备的试纸条的稳定性做了评估，结果表明，该试纸条在4℃条件下保存时间最久，可达数月，在25℃条件下保存时间次之，而在37℃条件下保存时间最短，只有2个月。这可能与T线上病毒蛋白的失活有关。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.检测1型鸭甲肝病毒抗体的胶体金免疫层析试纸，由底板、硝酸纤维素膜、样品垫、金标垫和吸收垫组成，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上的测试线由浓度≥0.75mg/ml的I型鸭甲肝病毒的病毒液包被而成，质控线由浓度≥0.4mg/ml的A抗BIgG包被而成；所述金标垫由胶体金标记的浓度≥0.25mg/ml的金标葡萄球菌A蛋白包被而成；所述A抗BIgG为免疫学研究中常规实验动物中除鸭外的任一种动物抗另一动物IgG。

2.根据权利要求1所述的检测1型鸭甲肝病毒抗体的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上的测试线由浓度为0.75mg/ml的DHAV-1病毒液包被而成，质控线由浓度为0.4mg/ml的A抗BIgG包被而成；所述金标垫由胶体金标记的浓度为0.25mg/ml的金标葡萄球菌A蛋白包被而成。

3.根据权利要求1或2所述的检测1型鸭甲肝病毒抗体的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述A抗BIgG为羊抗兔IgG。

4.权利要求1～3所述的检测1型鸭甲肝病毒抗体的胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)硝酸纤维素膜上质控线和测试线的喷制：将1型鸭甲肝病毒的病毒液点于硝酸纤维素膜上形成测试线，将A抗BIgG包被于硝酸纤维素膜上形成质控线，37℃干燥10～12h后密封保存；

(2)金标垫的制备：将胶体金标记的浓度为0.25mg/ml的金标葡萄球菌A蛋白均匀地喷涂于玻璃纤维素膜上，4℃冻干后密封保存；

(3)试纸的组装：分别将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘在底板上，硝酸纤维素膜上所述质控线一端靠近吸收垫，所述测试线一端靠近金标垫，切割成试纸条后，干燥密封低温保存。

5.根据权利要求4所述的检测1型鸭甲肝病毒抗体的胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述测试线和质控线之间的距离为0.6cm，测试线和质控线距硝酸纤维素膜边缘0.2cm。

6.根据权利要求4所述的检测1型鸭甲肝病毒抗体的胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述金标葡萄球菌A蛋白在进行胶体金标记时，最佳标记pH为每毫升金溶液加入6μl0.025mmol/LK₂CO₃溶液，最佳标记量为每毫升金溶液标记30μg金标葡萄球菌A蛋白。