CN105112506A - 一种对样品中大肠埃希氏菌10种k抗原分型的基因液相芯片及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种对10种大肠杆菌（<i>Escherichia？coli</i><i>，</i><i>E.coli</i>）的K抗原进行分型的液相芯片及其制备方法。本发明还涉及利用所述的基因液相芯片进行K抗原分型的方法。本发明以大肠杆菌K抗原基因簇内的特异基因，包括Wzy，TarQ，Bcs3等为靶基因，建立了对10种大肠杆菌的K抗原分型液相芯片和分型方法，为肠道内大肠杆菌的K抗原分型提供一条可信的途径。利用本发明的基因芯片检测肠道中的大肠杆菌，并且对其进行K抗原分型，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等诸多优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种对样品中大肠埃希氏菌10种菌株K抗原分型的基因液相芯片及其制备方法。本发明还设计利用所述的基因液相芯片进行检测的方法。
背景技术
液相芯片，也称为微球体悬浮芯片（suspensionarray，liquidchip），是基于xMAP技术的新型生物芯片技术平台，它是在不同编码的微球上进行抗原-抗体、酶-底物、配体-受体的结合反应及核酸杂交反应，通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的，一个反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应，是继基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子检测技术平台。迄今为止十年时间，全球已有数百套基于xMAP技术的检测平台用于免疫性、蛋白质、核酸就爱南侧、基因研究等领域，该技术已经成为一种新的蛋白质组学和基因组学研究工具，也是最早通过美国食品与药物管理局（FDA）认证的可用于临床诊断的生物芯片技术。
利用液相芯片检测时，先后加入样品和报告分子与标记微球反应，样品中的目的分子能够与探针和报告分子特异性结合，使交联探针的微球携带上报告分子藻红蛋白，随后利用仪器（如Luminex100）对微球进行检测和结果分析。Luminex100采用微流技术使微球快速单列通过检测通道，并使用红色和绿色两种激光分别对单个微球上的分类荧光和报告分子上的报告荧光进行检测。红色激光可将微球分类，从而鉴定各个不同的反应类型（即定性）；绿色激光可确定微球上结合的报告荧光分子的数量，从而确定微球上结合的目的分子的数量（即定量）。因此，通过红绿双色激光的同时检测，完成对反应的实时、定性和定量分析。
大肠埃氏菌，俗称大肠杆菌，是一种革兰氏阴性菌，隶属于肠杆菌科埃希氏菌属。该属的菌通常生活在温血性生物的肠道内，生长吸热,该属多数菌都是共栖菌株，只有一些特别的血清型是人类致病菌,能引起尿路感染、严重腹泻、败血症、脑膜炎等，这些致病菌大多是特定血清型的大肠杆菌。
目前，对大肠杆菌的分型鉴定主要根据有：细菌的形态学特征、细菌的生理生化特征、细菌的生态学特征、血清学反应、噬菌体反应等方法。大肠杆菌的表面K抗原分型属于血清学反应的一种。K抗原在细菌与外界环境两者之间发挥着十分重要的作用，大肠杆菌能引起一系列的感染，因此要耐受从人体到动物到土壤水源的各种环境的变化，而K抗原作为荚膜处在最外层起到保护菌体免受外界环境和抗体影响的作用。由于环境和抗体的多样性，形成了K抗原的多样性，而根据K抗原的多样性可以对大肠杆菌的不同菌株进行分型鉴定。
发明内容
本发明的一个目的就是提供一种检测土壤中十种致病微生物的基因液相芯片，该芯片包括：荧光编码的微球、捕获探针、引物、PCR反应体系、链霉亲和素-藻红蛋白。其主要特征在于所述的捕获探针包含从以下序列中选取的一种或多种序列：
（1）从大肠埃希氏菌K96，K11，K2ab，K20，K24，K30，K38，K84，K92，K102十种菌的K抗原基因簇特异基因序列中所选取的核酸序列；
其中上述的基因液相芯片的从大肠埃希氏菌K96，K11，K2ab，K20，K24，K30，K38，K84，K92，K102十种菌的K抗原基因簇特异基因序列中所选取的核酸序列中所选取的核酸序列具有从SEQIDNO:21-SEQIDNO:30所示的DNA序列中的一种或多种DNA序列。多种DNA序列指的是多种探针共同使用。
另外，上述检测液相芯片还包括所述的引物序列：具有SEQIDNO:1-SEQIDNO:20所示的一条或多条引物顺序；多条引物指的是进行多重PCR时使用的多条引物；基因液相芯片的制备方法，包括核酸提取、微球偶联、PCR扩增及上机检测。
本发明的一个重要目的就是液相芯片的实际应用，其特征在于该液相芯片用于大肠埃希氏菌K96，K11，K2ab，K20，K24，K30，K38，K84，K92，K102十种菌中至少一种的大肠杆菌分型鉴定；
由上述的技术方案可见，本发明首次将液相芯片技术引入大肠杆菌K抗原分型领域，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的样品中10种大肠杆菌K血清型检测液相芯片及其检测方法，利用本发明的液相芯片可以达到鉴定样品中常见的大肠杆菌K血清型菌株的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，该发明对于各级医疗部门实时快速检测样品中大肠杆菌K抗原分型具有重要的应用价值。
附图说明
图1十种大肠杆菌K抗原探针特异性比较；
图2包括：2A大肠杆菌K30液相芯片灵敏度检测；2B大肠杆菌K92液相芯片灵敏度检测；
图3随机两种和随机三种大肠杆菌K抗原液相芯片灵敏度检测；
图注：图1-3中K96，K11，K2ab，K20，K24，K30，K38，K84，K92，K102代表大肠杆菌K血清型十种菌株。
具体实施方式
为让本发明的上述目的和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。
本发明所用到的大肠杆菌菌种来源如下：
实施例1
引物、探针的设计与制备
1、探针的筛选（每种菌选取一种探针）
特异性探针是整个液相芯片技术核心部分，一般采用先设计特异性探针，然后再根据探针位置来设计相应的引物。
由于后期多重PCR的要求，因此在前期设计探针时，应注重保证探针的长度控制在18bp左右，GC含量控制在30-60%。前期设计探针时，利用生物信息学脚本对K抗原基因簇中特异基因进行多重比对，对每一个靶基因设计了多条特异探针这样不仅保证可以筛选出既保守又特异的探针，还能更加确保检测结果的可靠性。要想得到既保守又特异的探针如果仅仅靠生物信息学分析是远远不够的，有时候很符合上述条件的探针在实际杂交过程中却得不到稳定的阳性信号。因此设计好的探针必须经过实际芯片上机检测进行反复的筛选，才能保证真正有效地探针。
本研究经过反复多次的实验筛选，最终获得了每种菌特异的一条探针序列，如表1所示：
表1本发明基因芯片上选用的寡核苷酸探针序列及可检测出的致病菌
2、特异基因的筛选
大肠杆菌K抗原通过两种途径合成K抗原，一种是wzy依赖型途径合成K抗原，另一种是通过ABC-transporter途径合成K抗原。在前者中，wzx/wzy基因是十分特异的，可以直接作为设计探针的候选基因，而在后者中，因为没有像wzx/wzy这么特异的基因，所以只能选择相对特异的基因，通常会是一些稀有的单糖基因或者是糖基转移酶。本发明通过对基因簇中所有的基因进行all_vs_all_blast的方法，进行比对，特异基因的匹配数必然会远小于保守基因。根据图1中十种大肠杆菌已破译的K抗原基因簇，配合上述方法找到特异基因并对其设计探针引物。
3、引物的设计
以挑选出来的十种大肠杆菌的特异基因为模板，每种特异探针设计一对液相芯片引物。利用PrimerPremier5.0设计引物，设定好引物的长度、引物类型、碱基数目等参数后运行软件，从输出结果中找出Tm值=50℃±3℃、碱基数在18-25bp之间、引物间无二聚体、引物内部无二级结构且扩增片段包含探针序列的引物。并且最终要保证所有引物PCR扩增出来的目的片段在100~300bp之间。利用设计好的引物
多重PCR，最终得到的引物如表2所示（选每条探针选取一对引物）：
表2本发明基因芯片上选用的寡核苷酸引物序列及可扩增出的致病菌
实施例2、基因液相芯片的制备
1、选取编码微球（bio-rad或Luminex公司），每一条探针对应一个微球编号，10种大肠杆菌的10条探针就需要10个不同的微球编号，如075号微球偶联大肠杆菌K75血清型的探针，取约1.25×106个置于离心管，12000rpm/min，离心3-5分钟，小心移去上清；
2、加入10uL0.1M的2-（n-吗啉代）乙磺酸溶液，充分震荡混匀，稍微离心；
3、用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针稀释至0.1mmol/L；加入4uL稀释大肠杆菌K75血清型的探针于075号微球悬浮液中，振荡混匀；
4、加入2.5uL新鲜配制的10mg/mL的EDC溶液至微球与探针混合液中，振荡，室温避光孵育30分钟；
5、重复步骤4；
6、用1mL0.02%Tween20洗涤一次，12000rpm/min离心3-5分钟；
7、小心弃上清，微球重悬于1mL0.1%SDS中，振荡混匀；
8、12000rpm/min离心3-5分钟，小心弃上清，微球重悬于30uLpH8.0TE中，振荡悬起混匀，即得到偶联好的检测微球；
9、用血球计数器计数微球的数量，换算出每种微球的单位浓度；
10、把偶联好的检测微球放在4℃避光保存，每种探针偶联的微球单独保存，使用时，根据检测项目选择要混合的微球种类。
实施例3、样本核酸的提取
1、取1.5mL菌液离心管中，8000rpm离心5分钟，弃上清，重复洗一次。
2、加入250μL50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)重悬，12000rpm离心5分钟，弃上清。
3、加入250μL50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)重悬，再加10μL0.45MEDTA(pH8.0)，充分悬浮，37℃温浴20分钟。
4、加入10μL20mg/mL溶菌酶，37℃温浴20分钟。
5、加入1.5μL20mg/mL蛋白酶K，轻柔混匀。
6、加入15μL10%SDS，50℃水浴2小时至溶液澄清，期间轻轻颠倒混匀若干次。
7、加2μL20mg/mLRNAse，65℃水浴30分钟。
8、用剪去尖头的枪头将上述溶液移到新的洁净离心管中。
9、在通风橱中加入250μL苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分混匀，12000rpm，4℃离心10分钟，上清液转移到新的离心管，重复一次。
10、在通风橱中加入250μL氯仿：异戊醇（24：1），充分混匀，12000rpm，4℃离心10分钟，上清液转移到新的离心管。
11、加入2.5倍体积的提前预冷的无水乙醇，轻摇，于-80℃沉淀DNA。12000rpm，4℃离心15min。
12、用1mL70%冰乙醇洗涤DNA沉淀，然后在65℃，10min烘干。
13、用30μLTE溶解，并于-20℃冰箱备用。
实施例3、样本PCR扩增
以提取的核酸溶液作为PCR反应的模板，PCR反应体系及反应条件：
PCR反应体系：表3十种大肠杆菌多重PCR反应体系
反应结束后以2%的琼脂糖凝胶电泳检查扩增情况。
实施例4、检测
1、悬摇、超声处理微球（已交联探针）20秒以重悬之；
2、配制混合微球工作液：用1.5хTMAC杂交液将各组微球稀释至150个/ul；（注：每个反应需要33ul混合微球工作液）
3、悬摇、超声处理微球20秒以混匀工作液；
4、向每个反应孔及空白对照孔中加入33ul工作液；
5、向每个空白孔中加入17ulTE（pH8.0）；而向每个样品孔中分别加入已生物素化的扩增产物17ul；
6、用枪上下吹吸数次以混匀各反应孔；
7、盖好反应板以防止挥发，将其置于95-100℃5分钟以使PCR产物双链变性；
8、之后再将反应板置于52℃15分钟；
9、配制新鲜的显色液：用1хTMAC杂交液将streptavidin-R-phycoerythrin（链霉亲和素-藻红蛋白）配成2-4ug/ml；（注：每孔需75ul显色液）
10、用1хTMAC杂交液将1.2um的Milliporefilterplate预湿一下，之后再负压抽空；之后将杂交好的反应液移入已预湿的孔中，用负压抽空以去除上清；之后再每孔加入75ul显色液，并用排枪上下吹吸数次以重悬反应液；迅速将反应液移回PCR板中；
11、将反应板再置于杂交温度120r/min孵育15分钟；
12、反应完成后，在52℃上，用Luminex100机器检测；
13、BIO-Plex检测系统，通过红、绿两束激光检测，红色激光激发微球基质的染料从而对微球编号进行识别，绿色激光对微球表面结合的荧光染料进行识别，实现捕获探针捕获的PCR产物的定量分析。
在检测时，同时以PCR阴性对照进行检测作为检测本底。对于每个检测体系和检测本底，仪器输出的数据是相应反应体系内一种编号微球群的荧光强度中位值（MedianFluorescenceIntensity，MFI）,也就是读取的这种编号的微球群（>100个）的每个微球信号强度的统计平均值。结果判读：当待检测样本的MFI值为其对应的检测背景信号强度的5倍以上时即判为阳性。
实施例5、灵敏度检测
为了探究该发明的检测灵敏度，我们对10种大肠杆菌中的K30，K92两种菌进行灵敏度检测实验，具体方法如下：
①用NanoDropOD仪对提取的基因组浓度进行测定，并分别稀释为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/ul、10pg/ul、1pg/ul、100fg/ul、10fg/ul、1fg/ul。
②对基因组进行PCR扩增，芯片杂交，上机检测。
③检测结果见图2。
结果表明：
（1）本发明对于大肠杆菌基因组样品的灵敏度在10pg/ul至100pg/ul之间。
（2）本发明可以在较低的DNA浓度下对大肠杆菌K抗原进行分型。
实施例6、随机样品检测
为了证明本发明对于混合的随机样品的检测效果，进行如下实验。盲抽随机两种菌3组，盲抽随机三种菌3组，共6组进行检测。抽样结果和检测结果如图3。
结果表明：
（1）本发明对于混合在一起的实际样品有较好的检测度，可以分辨混合在一起的实际样品。
SEQUENCELISTING
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Claims (8)
1.一种对样品中十种大肠杆菌K抗原分型的基因液相芯片，该芯片包括：荧光编码的微球、捕获探针、引物、PCR反应体系、链霉亲和素-藻红蛋白，其特征在于所述的捕获探针从以下序列中选取的一种序列：
从大肠埃希氏菌K96，K11，K2ab，K20，K24，K30，K38，K84，K92，K102十种菌的K抗原基因簇特异基因序列中所选取的核酸序列。
2.权利要求1所述的基因液相芯片，其特征在于所述的从大肠埃希氏菌K96，K11，K2ab，K20，K24，K30，K38，K84，K92，K102十种菌的K抗原基因簇特异基因序列具有从SEQIDNO:21-SEQIDNO:30所示的DNA序列中的DNA序列。
3.根据权利要求1所述的基因液相芯片，其特征在于所述的引物序列：具有SEQIDNO:1-SEQIDNO:20所示的引物顺序。
4.根据权利要求3所述的基因液相芯片，其特征在于所述的引物序列的DNA片段或其互补的DNA序列。
5.根据权利要求1所述的基因液相芯片，其特征在于所述的基因液相芯片的制备方法，包括核酸提取、微球偶联、PCR扩增及上机检测。
6.权利要求1所述的液相芯片在制备用于大肠埃希氏菌K96，K11，K2ab，K20，K24，K30，K38，K84，K92，K102十种菌的K抗原分型检测方面的应用。
7.根据权利要求6所述的液相芯片的应用，其特征在于所应用的检测探针包括SEQIDNO:21-SEQIDNO:30所示的DNA序列中的至少一种。
8.权利要求6-7所述的应用，其中所述的大肠埃希氏菌指的是分离于任何适合大肠杆菌生活的环境中所得到的，样品的纯培养物的粗提液。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105483266A (zh) * | 2016-01-15 | 2016-04-13 | 南开大学 | 检测大肠杆菌h血清型中3种血清型的基因液相芯片及检测方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101403000A (zh) * | 2008-11-27 | 2009-04-08 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种应用悬浮芯片技术检测致病性志贺氏菌方法 |
| CN101979664A (zh) * | 2010-12-06 | 2011-02-23 | 扬州大学 | K88大肠杆菌不同血清型的pcr特异性检测和分型鉴别方法 |
| CN103305627A (zh) * | 2013-07-16 | 2013-09-18 | 中国农业科学院上海兽医研究所 | 一种大肠杆菌o1、o2、o18、o78血清型检测试剂盒及其检测方法 |
-
2015
- 2015-07-30 CN CN201510454179.2A patent/CN105112506B/zh active Active
Patent Citations (3)
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105112506B (zh) | 2018-10-26 |
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