CN105102463A - 雷帕霉素衍生物的低温合成 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了获得包括Biolimus？A9在内的雷帕霉素衍生物的改进的方法。

Description

雷帕霉素衍生物的低温合成
相关申请的交叉参考
本申请要求于2013年1月22日提交的美国临时申请第61/755,388号的优先权，该申请整体并入本文作为参考。
在联邦赞助的研究和开发下做出的发明的权利声明
不适用。
有关在光盘上提交的“序列表”、表格或计算机程序表附录
不适用。
发明背景
Biolimus(也称为BA9)是开发作为冠状动脉支架的药物涂层以防止平滑肌细胞增殖和再狭窄的活性药物成分。BA9结构上与雷帕霉素(也称为西罗莫司，CAS[53123-88-9])相关，是市售的由吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)合成的大环内酯类天然产物。该“莫司”家族的其它成员包括依维莫司(CAS[159351-69-6])、佐他莫司(CAS[221877-54-9])和坦西莫司(CAS[162635-04-03])。该家族的成员已知在体内具有免疫抑制、抗真菌、抗肿瘤和/或抗炎活性，且用于治疗移植排斥、感染性疾病、自身免疫疾病以及特征为细胞过度增殖的病症。BA9的化学结构是由保持了核心的雷帕霉素环结构的31元三烯大环内酯构成，且仅在40位加上的侧链不同，其中雷帕霉素的羟基基团被乙氧基乙基基团烷基化。
与西罗莫司或其它西罗莫司衍生物相比的BA9的化学结构在图1中提供。该结构由在40位乙氧基乙基化的31元大环三烯内酯构成。BA9，与西罗莫司类似，与细胞内的亲免蛋白FKBP12结合。认为所得的大环内酯/FKBP12复合物随后以与西罗莫司类似的方式与mTOR(细胞周期进程的关键蛋白质)结合。mTOR失活导致几个特定的信号传导通路抑制，并使细胞周期停滞在G1至S期。
由于BA9及其他雷帕霉素衍生物的治疗价值，因此需要制备该活性药物家族的改进的方法。本发明满足了该需求以及其它需求。
发明简述
本发明提供了获得具有式I结构的化合物的方法：
该方法包括：
a)将有机溶剂、具有氮杂原子的有机碱化合物、具有式II结构的化合物以及具有式III结构的化合物混合在反应混合物中，
b)将反应混合物的温度保持在约25℃至约55℃；并且
c)从反应混合物中分离具有式I结构的化合物；
其中
R1选自Ra-(O)d-Rb的基团，其中Ra是C1-5亚烷基且Rb是C1-5烷基；C1-5亚烷基-OH；C6-10芳基C1-5烷基；C6-10芳基C1-5烷氧基；C1-5烷氧基C1-5烷基；酰基；酰基C1-5烷基；氨基C1-5烷基；C1-5烷基氨基C1-5烷基；酰基氨基C1-5烷基；C1-5烷氧基羰基氨基C1-5烷基；和C6-10芳基；
R2是氢；且
下标d是选自0-1的整数；
由此获得具有式I结构的化合物。
附图简述
图1显示西罗莫司、BiolimusA9及相关衍生物的化学结构。
图2显示按照本发明方法制备雷帕霉素衍生物的合成流程。
图3A显示在50-55℃合成的粗的BA9的HPLC分析。图3B显示在40℃合成的粗的BA9的HPLC分析。
发明详述
I.概述
本发明提供了获得包括BiolimusA9(BA9)在内的雷帕霉素衍生物的改进的方法。雷帕霉素衍生化以获得式I化合物的通用流程如图2所示。该方法包括雷帕霉素与适合的三氟甲磺酸酯在受控的温度下反应，然后后处理并分离产物。该方法的不同步骤如本文所述。
已经确定，以前所述的雷帕霉素的40-O-衍生物的合成方法产生了不期望的具有在反应性羟基上修饰的副产物。这些副产物具有与所需产物类似的非极性特性，显著降低产率且使纯化变得复杂。令人惊讶地，已经发现通过控制合成温度，可以实现副产物生成的显著减少。反应条件的细微改变令人惊讶地导致产物的产率及纯度的高增益。这些意想不到的优点在下文中详细描述。
II.定义
“混合在反应混合物中”是指将至少两种不同的物质接触的过程，从而使其混合在一起并可以反应，改变初始反应物中之一或者形成第三种不同种类的产物。然而，应当理解，所得的反应产物可以由所加入试剂之间反应直接生成，或者由来自所加入试剂中的一个或多个的中间体生成，所述中间体能够是在反应混合物中生成的。
“有机溶剂”是指在环境温度和压力下是液体且基本上不含水的含碳物质。有机溶剂的实例包括但不限于甲苯、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、四氢呋喃、苯、氯仿、乙醚、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和石油醚。
“有机碱化合物”是指能够接受质子(即氢阳离子)以形成该碱的共轭酸的基于碳的分子。一般而言，用于本发明方法中的有机碱化合物包含至少一个氮杂原子。有机碱化合物的实例包括但不限于Huenig碱(即N,N-二异丙基乙胺)、二甲基吡啶类包括2,6-二甲基吡啶(即2,6-二甲基吡啶)、三乙胺和吡啶。
“分离”是指从包含某化合物和至少一种其它物质的混合物中分离至少一部分该化合物的过程。该被分离的化合物基本上不含存在于混合物中的至少一种其它物质。
“烷基”是指直链或支链的、饱和的、具有标明的碳原子数的脂肪族基团。烷基可以包含任何数量的碳原子，例如C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C1-6、C1-7、C1-8、C1-9、C1-10、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C3-4、C3-5、C3-6、C4-5、C4-6和C5-6。例如，C1-6烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。烷基还可指具有至多20个碳原子的烷基基团，例如但不限于庚基、辛基、壬基、癸基等。
“亚烷基”是指直链或支链的、饱和的、具有标明数量的碳原子的脂肪族基团，且连接至少两个其它基团，即二价烃基。与该亚烷基连接的两个部分可以连接在亚烷基基团相同的原子或不同的原子上。例如，直链亚烷基可以是-(CH2)n-的二价基团，其中n是1、2、3、4、5或6。代表性的亚烷基基团包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、亚丁基、亚异丁基、亚仲丁基、亚戊基和亚己基。
“烯基”是指具有至少两个碳原子和至少一个双键的直链或支链烃。烯基可以包含任何数量的碳，例如C2、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C2-7、C2-8、C2-9、C2-10、C3、C3-4、C3-5、C3-6、C4、C4-5、C4-6、C5、C5-6和C6。烯基基团可以具有任何合适数量的双键，包括但不限于1、2、3、4、5个或者更多。烯基基团的实例包括但不限于乙烯基、丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、异戊烯基、1,3-戊二烯基、1,4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基、1,5-己二烯基、2,4-己二烯基和1,3,5-己三烯基。
“炔基”是指具有至少两个碳原子和至少一个叁键的直链或支链烃。炔基可以包含任何数量的碳，例如C2、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C2-7、C2-8、C2-9、C2-10、C3、C3-4、C3-5、C3-6、C4、C4-5、C4-6、C5、C5-6和C6。炔基基团的实例包括但不限于乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、异丁炔基、仲丁炔基、丁二炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、异戊炔基、1,3-戊二炔基、1,4-戊二炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、1,3-己二炔基、1,4-己二炔基、1,5-己二炔基、2,4-己二炔基和1,3,5-己三炔基。
“芳基”是指具有任何合适数量的环原子和任何合适数量的环的芳香环系统。芳基基团可以包含任何合适的环原子数，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个环原子，以及6-10、6-12或6-14个环原子。芳基基团可以是单环、稠和形成双环或三环，或者通过键连接形成联芳基基团。代表性的芳基基团包括苯基、萘基和联苯基。其它芳基基团包括具有亚甲基连接基团的苄基。某些芳基基团具有6-12个环原子，例如苯基、萘基和联苯基。
“烷氧基”是指具有将烷基基团与结合点连接的氧原子的烷基基团：烷基-O-。对于烷基基团，烷氧基基团可以具有任何合适数量的碳原子，例如C1-6。烷氧基基团包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、2-丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。
“羰基”是指含有碳-氧双键的部分(即-C(O)-)。
“酰基”是指包含如本文所述的羰基基团的部分，所述羰基与如本文所述的烷基基团、烯基基团或炔基基团结合。
“摩尔比”是指第一种物质的摩尔数与第二种物质或任何其它物质的摩尔数的比率。
“色谱”是指通过将混合物应用于固定相并使用流动相将化合物从固定相洗脱的方法，将化合物与混合物中的一种或多种其它化合物分离的过程。色谱的实例包括气相色谱、硅胶色谱、反相色谱和亲和色谱。可以实施色谱例如用以分析化学反应的进程，或者在化学合成后纯化物质。通常情况下，从微克至千克范围的物质的量可以用于色谱分离，但其它量也可以使用。
“固化”是指引起溶液中的化合物结合成该物质的固体形式的过程。溶液中的化合物全部或者其任何部分都可以被固化。该固体形式可以是无定形的或者是结晶物质。“沉淀”是指以无定形的形式固化物质。
“溶解”是指将物质的固体形式溶于溶剂中以形成溶液的过程。固体物质的全部或者其任何部分都可以被溶解。不溶解的物质可以以悬浮液的形式存在于溶剂中。
如本文所用的术语“约”是为了修正数值，表明接近明确值周围的范围。如果“X”是数值，“约X”是指0.9X至1.1X的值，且更加优选地，是0.95X至1.05X的值。任何涉及“约X”之处都具体地至少是指X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X和1.05X。因此，“约X”是期望为权利要求的限定(例如“0.98X”)而教导和提供书面描述支持。
III.本发明的实施方案
本发明的方法可以用于制备大量的大环内酯衍生物。大环内酯类，包括具有式I和II结构的那些，是聚酮化合物天然产物和特征为大环内酯环的合成类似物。本发明的方法特别是用于制备雷帕霉素衍生物BiolimusA9(BA9)、依维莫司、佐他莫司和坦西莫司。其它大环内酯衍生物也可以使用本发明的方法制备。
因此，本发明的某些实施方案提供了获得具有式I结构的化合物的方法：
该方法包括：
a)将有机溶剂、具有氮杂原子的有机碱化合物、具有式II结构的化合物以及具有式III结构的化合物混合在反应混合物中，
b)将反应混合物的温度保持在约25℃至约55℃；并
c)从反应混合物中分离具有式I结构的化合物；
其中
R1选自Ra-(O)d-Rb的基团，其中Ra是C1-5亚烷基且Rb是C1-5烷基；C1-5亚烷基-OH；C6-10芳基C1-5烷基；C6-10芳基C1-5烷氧基；C1-5烷氧基C1-5烷基；酰基；酰基C1-5烷基；氨基C1-5烷基；C1-5烷基氨基C1-5烷基；酰基氨基C1-5烷基；C1-5烷氧基羰基氨基C1-5烷基；和C6-10芳基；
R2是氢；且
下标d是选自0-1的整数；
由此获得具有式I结构的化合物。
在某些实施方案中，该反应混合物是无色的。在某些实施方案中，该反应的产物是无色的。在某些实施方案中，本发明提供了获得具有式I结构的化合物的方法，
其中该方法包括：
a)将有机溶剂、具有氮杂原子的有机碱化合物、具有式II结构的化合物以及具有式III结构的化合物混合在反应混合物中，
b)将反应混合物的温度保持在约25℃至约55℃，得到无色的反应混合物；并
c)从该无色的反应混合物中分离具有式I结构的化合物；
其中
R1选自Ra-(O)d-Rb的基团，其中Ra是C1-5亚烷基且Rb是C1-5烷基；C1-5亚烷基-OH；C6-10芳基C1-5烷基；C6-10芳基C1-5烷氧基；C1-5烷氧基C1-5烷基；酰基；酰基C1-5烷基；氨基C1-5烷基；C1-5烷基氨基C1-5烷基；酰基氨基C1-5烷基；C1-5烷氧基羰基氨基C1-5烷基；和C6-10芳基；
R2是氢；且
下标d是选自0-1的整数；
由此获得具有式I结构的化合物。
在某些实施方案中，具有式I结构的化合物是
在某些实施方案中，具有式II结构的化合物是雷帕霉素。在某些实施方案中，R1是CH2-CH2-OH。在某些实施方案中，R1是(CH2)e-O-(CH2)f-H，e是选自1-5的整数，且f是选自1-5的整数。在某些实施方案中，R1是CH2-CH2-O-CH2-CH3(即2-乙氧基乙基)。在某些实施方案中，e和f的总和不大于7。
在某些实施方案中，式I化合物是BiolimusA9，还称为：BA9；A9；40-O-(2-乙氧基乙基)-雷帕霉素；42-O-(2-乙氧基乙基)-雷帕霉素；Umirolimus；(3S,6R,7E,9R,10R,12R,14S,15E,17E,19E,21S,23S,26R,27R,34aS)-9,10,12,13,14,21,22,23,24,25,26,27,32,33,34,34a-十六氢-9,27-二羟基-3-[(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-乙氧基乙氧基)-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基]-10,21-二甲氧基-6,8,12,14,20,26-六甲基-23,27-环氧-3H吡啶并[2,1-c][1,4]氧杂氮杂环三十一碳十五烯(cyclohentriacontine)-1,5,11,28,29(4H,6H,31H)-五酮；和(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-12-[(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-乙氧基乙氧基)-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基]-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-五酮。BiolimusA9还已知为CAS号851536-75-9。
任何适合形成式I化合物的三氟甲磺酸酯化合物都可以用于本发明的方法。一般而言，用于本发明的方法的三氟甲磺酸酯具有式III的结构。具有结构R1OSO2CF3(即式III)的三氟甲磺酸酯可以通过将对应的醇(R1OH)与三氟甲磺酸、三氟甲磺酰氯、三氟甲磺酸酐等反应来制备。虽然三氟甲磺酸酯特别是用于制备式I化合物，但其它醇类R1OH的衍生物(包括甲苯磺酸酯、甲磺酸酯和对溴苯磺酸酯)也可以用于本发明的方法。
任何合适的有机碱都可以用于本发明的方法。一般而言，使用具有氮杂原子的碱。合适的碱的实例包括Huenig碱(即N,N-二异丙基乙胺)、二甲基吡啶类包括2,6-二甲基吡啶(即2,6-二甲基吡啶)、三乙胺、三丁基胺、吡啶、2,6-二叔丁基吡啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)、1,5,7-三氮杂二环(4.4.0)癸-5-烯(TBD)、7-甲基-1,5,7-三氮杂二环(4.4.0)癸-5-烯(MTBD)、1,5-二氮杂二环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、1,1,3,3-四甲基胍(TMG)、2,2,6,6-四甲基哌啶(TMP)、潘必啶(PMP)、1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(TED)、喹核碱和可力丁。可以使用两种或多种碱的组合。其它碱也可以适用于本发明的方法。
在某些实施方案中，含有氮杂原子的有机碱化合物具有式IV的结构，
其中Rc、Rd、Re、Rf和Rg各自独立的选自H、C1-5烷基、OH和NH2。在某些实施方案中，该含有氮杂原子的有机碱化合物是选自2,6-二甲基吡啶和Huenig碱。在某些实施方案中，该含有氮杂原子的有机碱化合物是2,6-二甲基吡啶。
包含式II化合物、式III化合物和有机碱的反应混合物可以保持在约25℃至约55℃的温度下足够形成式I化合物的任何时间长度。一般而言，将反应混合物保持在约25℃至约55℃的温度下从几分钟至24小时之间的任何时间。可以保持反应混合物例如约1分钟至约24小时，或者从约30分钟至约18小时，或者从约1小时至约12小时，或者从约2小时至约10小时，或者从约4小时至约6小时。反应混合物可以保持约2、3、4、5、6、7、8、9或10小时。在某些实施方案中，本发明提供了获得具有如上文所述式I结构的化合物的方法，其中在(b)部分保持约2-10小时。
包含式II化合物、式III化合物和有机碱的反应混合物可以保持在任何足够形成式I化合物的温度。一般而言，反应混合物是保持在约25℃至约55℃的温度。反应混合物可以保持在约25℃至约55℃，或约30℃至约55℃、约35℃至约55℃、或约40℃至约55℃、或约45℃至约55℃、或约50℃至约55℃、或约30℃至约50℃、或约35℃至约45℃的温度。反应混合物可以保持在约25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55℃。在某些实施方案中，本发明提供了获得具有如上文所述式I结构的化合物的方法，其中在(b)部分中温度保持在约25℃至约40℃。发现反应温度的细微改变将导致不期望的副产物形成的令人惊讶的减少，如下文所详细讨论。
在某些实施方案中，本发明的反应混合物是无色的。在某些实施方案中，所述反应的产物是无色的。“无色的反应混合物”的含义是该反应混合物在560-600nm之间的波长下光密度低于0.5。该光密度可以是例如低于0.5，或低于0.4，或低于0.3，或低于0.2，或低于0.1，或低于0.05。光密度由下式定义：
Aλ＝log10(I0/I1),
其中Aλ是在某个光波长(λ)下的吸光度，I1是通过所述材料的辐射(光)的强度(穿透辐射)，且I0是通过所述材料前的辐射强度(入射辐射)。光密度可以使用未稀释的反应混合物检测，或者使用用适合的溶剂(例如甲苯等)稀释过的反应混合物的样品检测。“无色的产物”是指在适合的溶剂(例如甲苯等)中的产品溶液在560-600nm之间波长下具有低于0.5的光密度。
任何合适的有机溶剂都可以用于本发明的方法。适合的溶剂包括但不限于甲苯、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、四氢呋喃、苯、氯仿、乙醚、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、石油醚及其混合物。在某些实施方案中，该有机溶剂是甲苯或二氯甲烷。溶剂的量不是关键性的，条件是足以将式II化合物转化为式I化合物。一般而言，该溶剂与式II化合物的比率是从约1:1至约1000:1重量。该溶剂与式II化合物的比率可以是例如约100:1或约10:1重量。
任何足以形成式I化合物的式III化合物的量都可以用于本发明的方法。一般而言，在本发明的方法中形成的反应混合物中相对于每当量的式II化合物包含最多约60摩尔当量的式III化合物。具有式III结构的化合物与具有式II结构的化合物的摩尔比可以是例如从约30比1至约60比1。具有式III结构的化合物与具有式II结构的化合物的摩尔比可以是约30比1、或约35比1，或约40比1、或约45比1、或约50比1、或约55比1、或约60比1。在某些实施方案中，具有式III结构的化合物与具有式II结构的化合物的摩尔比是约30比1至约60比1。其它摩尔比也可以适用于本发明的方法。
足以形成式I化合物的任何有机碱的量都可以用于本发明的方法。一般而言，本发明的方法中形成的反应混合物包含相对于每当量的式II化合物最多约120摩尔当量的有机碱。含有氮杂原子的有机碱化合物与具有式II结构的化合物的摩尔比可以是例如从约80比1至约120比1。含有氮杂原子的有机碱化合物与具有式II结构的化合物的摩尔比可以是约80比1、或约85比1，或约90比1、或约95比1、或约100比1、或约105比1、或约110比1、或约115比1、或约120比1。在某些实施方案中，含有氮杂原子的有机碱化合物与具有式II结构的化合物的摩尔比可以是约80-120比1。在某些实施方案中，该比率是104比1。其它摩尔比也可以适用于本发明的方法。含有氮杂原子的有机碱化合物可以一次性加入，或者以两次或多次分批加入。在某些实施方案中，含有氮杂原子的有机碱化合物是分两批加入。
一般而言，本发明的方法包括将式I化合物从反应混合物中分离。式I化合物可以从一种或多种化合物例如溶剂、有机碱化合物、式II化合物或式III化合物中分离。任何适合的分离技术都可以用于分离式I化合物。适合的分离技术包括但不限于过滤固化的式I化合物、离心固化的式I化合物、蒸馏、液体萃取、升华和色谱技术。色谱技术的实例包括但不限于正相柱色谱、反相柱色谱和薄层色谱。两种或多种分离技术可以组合使用来分离式I化合物。在某些实施方案中，分离具有式I结构的化合物包括使用色谱法来分离具有式I结构的化合物。在某些实施方案中，该色谱法是选自柱色谱、硅胶柱色谱、高压液相色谱和薄层色谱。在某些实施方案中，该色谱法是硅胶柱色谱，且该色谱法是通过使用包含一种或多种选自乙酸乙酯、己烷和庚烷的溶剂的流动相来进行。在某些实施方案中，该色谱法是使用己烷和乙酸乙酯的硅胶色谱。
在某些实施方案中，该方法包括任选地固化具有式I结构的化合物。在某些实施方案中，固化具有式I结构的化合物包括：a)将具有式I结构的化合物溶于甲醇中，并且b)从水中沉淀具有式I结构的化合物，从而固化具有式I结构的化合物。在从水中沉淀以前，其它溶剂也可以用于溶解具有式I结构的化合物。
实施例
实施例1：三氟甲磺酸2-乙氧基乙基酯的制备
按照美国专利号7,812,155中所述的方法合成三氟甲磺酸2-乙氧基乙基酯。将二氯甲烷(558g)转移至用氮气预先冲扫过的圆底烧瓶中。然后加入2-乙氧基乙醇(75.0g)和2,6-二甲基吡啶(89.9g)。将反应混合物搅拌20分钟，期间将该混合冷却至0至-10℃之间。经加液漏斗逐滴向反应混合物中加入三氟甲磺酸酐(282.4g)。然后将水加入该搅拌过的反应混合物中，并将所得的二相混合物再另外搅拌5分钟。将二氯甲烷层洗涤，分离，并收集。将该二氯甲烷溶液用硫酸钠干燥，经过滤除去硫酸钠，并在30℃下减压除去溶剂。
该合成还可以以505g规模的起始2-乙氧基乙醇进行。合成后，将该批次经真空蒸馏纯化，产生1060g(86％产率)的三氟甲磺酸2-乙氧基乙基酯。该三氟甲磺酸酯还可以通过美国专利号7,220,755和美国专利号7,193,078中所述的方法制备。
实施例2：在55℃下制备BiolimusA9。
在55℃下(外部水浴温度)将三氟甲磺酸2-乙氧基乙基酯(44.3当量)和雷帕霉素(1.0当量)在甲苯中与2,6-二甲基吡啶(49.1当量)进行偶联90分钟。在此方法(2.0g雷帕霉素的规模)中，将三氟甲磺酸2-乙氧基乙基酯一次性加入预加温(55℃)过的反应混合物中。加热90分钟后，停止外部加热，然后加入第二批2,6-二甲基吡啶(54.9当量)。加完第二批二甲基吡啶后，将反应混合物在环境温度下另外搅拌90分钟，随后后处理分离粗的BA9。后处理包括：1.将反应混合物用乙酸乙酯稀释；2.将反应混合物用冷却的1NHCl猝灭；和3.将有机层用三批20％氯化钠水溶液洗涤。最后一次用氯化钠溶液洗涤后水的pH是约6。随后将该粗物质经使用仅一种溶剂混合物(正己烷/乙酸乙酯，4:6比例(体积/体积))的等度洗脱硅胶柱色谱纯化。
该方法是在2.0g的规模进行。在反应混合物的外部温度达到50℃(t水 浴＝51-52℃)时，将三氟甲磺酸2-乙氧基乙基酯分批加入反应混合物中。加完后观察到内部温度升至58℃。通过HPLC来监测反应进程。通过HPLC分析获得的雷帕霉素、BA9和RRT＝1.2的主要副产物的相对量，在表1中总结。表中的相对量用AUC％(曲线下面积)表示，即在给出的色谱图中对应于单峰(依次对应单个物质种类或者具有相似/相同保留时间的两种或多种物质种类)的总信号比例。RRT是指所给出物质种类的保留时间与BA9的保留时间的比率(例如对于物质种类X而言，RRT＝RTX/RTBA9)。由于该反应混合物中包含甲苯和二甲基吡啶，因此AUC％值是近似值。
表1.在反应进程的不同时间由水浴(t 水浴 ＝51-55℃)加热的反应混合 物中三种主要组分的相对量(HPLC/AUC％)。
*加入第二批2,6-二甲基吡啶后搅拌90分钟
如表1中的数据所示，在加热45分钟后BA9的AUC％达到其最大值。在这个时间以后，雷帕霉素仍然消耗，但是还伴随着RRT为1.2的副产物的增加。加入第二批2,6-二甲基吡啶，随后在环境温度搅拌90分钟，对于该反应混合物的组成不具有显著影响。
HPLC分析显示，该方法获得粗的BA9(58.6％AUC含量)。除了未反应的雷帕霉素(RRT约0.52-0.58)以外，该粗产物还包含9.6％AUC的HPLC保留时间＝11.0分钟(RRT＝1.2)的主要杂质/副产物以及一系列至多1.8％AUC的在13.2(RRT＝1.42)到13.6分钟(RRT＝1.47)之间的杂质。
实施例3：低温下制备BiolimusA9。
按照如下操作在接近室温的温度下实施该方法。加入三氟甲磺酸2-乙氧基乙基酯(在1小时内分批完成)使最初反应混合物的内部温度从22.6℃升至26.3℃。加完三氟甲磺酸酯后，将反应混合物在约26℃搅拌40分钟，随后用HPLC分析(参见表2中0小时的条目)。然后在几分钟内将反应混合物的内部温度升至30℃，并随后将该混合物在此温度下搅拌多达19.5小时。搅拌19.5小时后，该反应达到平衡点。
表2.在反应进程的不同时间和内部温度下的反应混合物中三种主要 组分的相对量(HPLC/AUC％)。
对于表2中的数据，“BA9AUC％”是指相对于BA9、雷帕霉素和RRT＝1.2的峰总和的积分的BA9峰。“绝对AUC％”是指在HPLC色谱图中相对于全部积分峰的积分的BA9峰。在表2中的数据表明以下：a)在加入三氟甲磺酸2-乙氧基乙基酯期间将该批次的温度控制在≤30℃显著地有利于减少RRT＝1.2的副产物的形成；b)在30℃下即使5小时后反应混合物中仍有32％的未反应的雷帕霉素；c)其需要总共加热多达20小时以将雷帕霉素的量降到27AUC％；且d)延长的加热过程使RRT＝1.2的副产物增加至3.2％AUC。
在40℃的最高温度下实施该方法。在该试验中，加入三氟甲磺酸2-乙氧基乙基酯(在1小时内分批完成)使内部温度从24.2℃升至27.6℃。加完三氟甲磺酸酯后，将反应混合物在约27℃搅拌30分钟，随后用HPLC分析(参见表3中0小时的条目)。然后将反应混合物的内部温度升至40℃，并在此温度下搅拌直至4小时。从表3可以明显看到，在40℃下搅拌3-4小时后反应混合物中BA9达到最大产率。
不同反应温度的数据比较显示，HPLC/RRT＝1.2的副产物形成在40℃(7-10％AUC)下比在30℃(1-2％AUC)类似条目下的水平更高。并且，验证了在加入三氟甲磺酸2-乙氧基乙基酯过程中将该批次的温度控制在≤30℃显著地有利于减少RRT＝1.2的副产物的形成(约1AUC％含量)。
以2.0g规模的雷帕霉素检测具有反应混合物全部后处理以生成粗的BA9的在≤40℃温度下粗的BA9的合成。在30分钟内分批加入三氟甲磺酸2-乙氧基乙基酯后，内部温度从20.0℃升至24.0℃，并进一步搅拌(仍无内部加热)后升至25.5℃(从开始加入三氟甲磺酸酯1小时后)。随后，将该反应混合物外部加热至40℃(25分钟内)，并在此温度下搅拌3小时。初始反应后，将12.9g的2,6-二甲基吡啶加入反应混合物中。将该新的反应混合物在30℃搅拌90分钟。
表3.在反应进程的不同时间和内部温度下的反应混合物中三种主要 组分的相对量(HPLC/AUC％)。
产物的后处理包括：1.将反应混合物用160mL乙酸乙酯稀释；2.将反应混合物用160mL冷却的1NHCl在3℃至9℃的温度下猝灭；3.将有机层用三批20％氯化钠水溶液洗涤(分别320mL、200mL和200mL)。最后一次用氯化钠溶液洗涤后水层的pH是6。该粗产物的油状产物的HPLC跟踪显示高含量的BA9(66.3AUC％)。HPLC分析显示在50-55℃产生的类似的粗产物中BA9的含量仅58.6％。此外，两批粗的BA9(在40℃和在50-55℃生成)的比较显示在较低温度下生成的批次中副产物的量更少。最引人注意地是HPLC/RRT＝1.2的副产物在两个批次中含量的不同。在较高温度下合成的批次中该杂质的含量是9.6AUC％(见图3A)，而在40℃下生成的粗产物中的含量仅为3.6AUC％(见图3B)。
实施例4:反应规模放大。
因为发现产物和副产物的分布取决于反应混合物的温度，因此在不同规模下研究了雷帕霉素衍生化过程的温度特性。按照起始的雷帕霉素为30.0g的规模来实施该过程。在30分钟内分批加入三氟甲磺酸2-乙氧基乙基酯后，内部温度从20℃升至27℃，并进一步搅拌(仍无内部加热)后升至32℃(从开始加入三氟甲磺酸酯1小时后)。随后，将该反应混合物外部加热至40℃，并在此温度下搅拌3小时。初始反应后，将2,6-二甲基吡啶加入反应混合物中，并在30℃搅拌90分钟。将该反应混合物后处理，得到油状产物。基于HPLC分析，首次大规模合成产生的粗产物包含64.2AUC％的BA9和4.9％的RRT＝1.2的副产物。
将按照如上文所述方法进行的大规模合成再重复两次，两次都以起始的雷帕霉素52.0g的规模。合成规模的进一步增加导致在加入三氟甲磺酸2-乙氧基乙基酯后该批次甚至更大的放热作用(第一次从20升至36℃，第二次从18升至33℃)。从以52g规模合成的粗的BiolimusA9的HPLC可以明显看出，该粗产物包含62.9和65.0AUC％的BiolimusA9以及10.2和8.5AUC％的RRT为1.20的副产物。
在以不同的合成规模将三氟甲磺酸2-乙氧基乙基酯加入到反应混合物期间观察到的起始放热的比较显示，该放热效果的程度与合成的规模成比例(参见表4中对上述合成的由于放热过程引起的温度升高的比较)。
在第一种情况中以2g规模的粗BiolimusA9和以30-52g合成的粗BiolimusA9批次的杂质谱的比较表明，一旦加大合成操作的规模，就会形成更大量的具有RRT＝1.2的副产物。对于2g合成的产品，该杂质的量仅为3.6％，然而对于大规模合成的产物，发现该杂质的量为4.9-10.2AUC％。在不受任何特定理论束缚的情况下，认为该差异是由较低批次温度在热量不受控制地加入三氟甲磺酸2-乙氧基乙基酯期间升高引起的(小规模时温度升至25.5℃，而大规模合成时升至36℃，参见表4)。因此，应当根据反应规模调整控制反应温度的措施。
表4.粗BA9的合成规模和由于与向反应混合物中加入三氟磺酸酯有 关的放热引起的温度升高程度之间的关系
实施例5：BiolimusA9的后处理。
以2.0g规模的雷帕霉素重复所述合成，最高反应温度仅35℃。唯一的差异是反应混合物的温度缓慢上升，从25℃到35℃(在30分钟内，而不是约5分钟，以便进一步最小化副产物的量)。该合成再次生成粗的BiolimusA9，其具有API的高HPLC/AUC含量(66.8％)和低含量的具有RRT＝1.2(RT＝10.7min,2.7％)的副产物。
使用硅胶色谱纯化粗产物，采用正己烷和乙酸乙酯的梯度溶剂混合物。用HPLC分析色谱流分。将具有BA9的HPLC/AUC％≥95.0％并同时符合存在已知和未知杂质的规范的流分合并。这提供了具有HPLC/AUC纯度＝96.2％的纯化BA9的40％产量。
除了纯化的BA9的主要部分外，还从硅胶色谱纯化中获得两个其他显著部分的纯化BA9：a)12％产量的具有HPLC/AUC纯度为91.8％的部分和b)8％产量的具有HPLC/AUC纯度为91.8％的部分。
在较大规模(52g规模的雷帕霉素)上使用浅梯度和延长的己烷/乙酸乙酯洗脱导致了在柱色谱分离期间杂质的差的分辨率。使用正己烷/乙酸乙酯的混合物的浸渍器梯度。从52g雷帕霉素开始，粗BiolimusA9通过浸渍器梯度硅胶柱色谱的纯化得到了23.5g的纯化产物(HPLC/AUC％纯度为96.0％)。获得了额外的10.0g产物(HPLC/AUC纯度为94.9％)。
实施例6：反应温度的小改变导致了产物分配的令人惊讶的增加
发现小的温度改变导致了产物/副产物分配的令人惊奇的改变。对于在60℃和55℃的合成进行反应混合物取样的比较，如表5和表6所示，表明反应温度的小的降低显著减少了副产物的形成。这对于保留时间11.5分钟时洗脱的化合物(一种二取代的杂质)而言最为明显(60℃反应时RT11.5为12.5％，而在55℃反应时为5.9％)。
表5.包含雷帕霉素、二氯甲烷、Huenig碱和三氟甲磺酸2-乙氧基乙 基酯的反应混合物在60℃进行80分钟的取样结果
因此，通过将反应在仅低5℃的温度下进行相同的持续时间，出现了雷帕霉素原料向BA9的改善的转化(在60℃反应的BA9为39.8％，而在55℃反应的BA9为70.2％)。抑制副产物的形成是特别有利的，因为这些副产物尤其难以从产物混合物中除去。相反，未反应的原料容易除去。因此，本文所述的方法显著增加了纯化产物的产率，降低成本并减少与目前已知的方法有关的困难。
表6.包含雷帕霉素、二氯甲烷、Huenig碱和三氟甲磺酸2-乙氧基乙 基酯的反应混合物在55℃进行80分钟的取样结果。
尽管为了清楚和理解的目的，上文已经通过举例说明和实施例进行了一定程度的详细描述，但是本领域技术人员应当理解，在所附权利要求的范围内能够进行某些改变和修饰。此外，本文提供的各篇文献整体引入本文作为参考，其程度就如同将各篇文献各自单独引入本文一样。

Claims (22)

1.获得具有式I结构的化合物的方法：
该方法包括：
a)将有机溶剂、具有氮杂原子的有机碱化合物、具有式II结构的化合物以及具有式III结构的化合物混合在反应混合物中，
b)将反应混合物的温度保持在约25℃至约55℃；并且
c)从反应混合物中分离具有式I结构的化合物；
其中
R1选自Ra-(O)d-Rb的基团，其中Ra是C1-5亚烷基且Rb是C1-5烷基；C1-5亚烷基-OH；C6-10芳基C1-5烷基；C6-10芳基C1-5烷氧基；C1-5烷氧基C1-5烷基；酰基；酰基C1-5烷基；氨基C1-5烷基；C1-5烷基氨基C1-5烷基；酰基氨基C1-5烷基；C1-5烷氧基羰基氨基C1-5烷基；和C6-10芳基；
R2是氢；且
下标d是选自0-1的整数；
由此获得具有式I结构的化合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中具有式I结构的化合物是
3.如权利要求1所述的方法，其中具有式II结构的化合物是雷帕霉素。
4.如权利要求1所述的方法，其中R1是CH2-CH2-OH。
5.如权利要求1所述的方法，其中R1是(CH2)e-O-(CH2)f-H，e是选自1-5的整数，且f是选自1-5的整数。
6.如权利要求5所述的方法，其中R1是CH2-CH2-O-CH2-CH3。
7.如权利要求5所述的方法，其中e和f的总和不大于7。
8.如权利要求1所述的方法，其中具有氮杂原子的有机碱化合物具有式IV的结构，
其中Rc、Rd、Re、Rf和Rg各自独立的选自H、C1-5烷基、OH和NH2。
9.如权利要求1所述的方法，其中具有氮杂原子的有机碱化合物是选自2,6-二甲基吡啶和N,N-二异丙基乙胺。
10.如权利要求1所述的方法，其中具有氮杂原子的有机碱化合物是2,6-二甲基吡啶。
11.如权利要求1所述的方法，其中在(b)部分保持约2-10小时。
12.如权利要求11所述的方法，其中在(b)部分中温度保持在约25℃至约40℃。
13.如权利要求1所述的方法，其中有机溶剂是甲苯或二氯甲烷。
14.如权利要求1所述的方法，其中具有式III结构的化合物与具有式II结构的化合物的摩尔比是从约30比1至约60比1。
15.如权利要求1所述的方法，其中具有氮杂原子的有机碱化合物与具有式II结构的化合物的摩尔比是从约80比1至约120比1。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述比例是104比1。
17.如权利要求1所述的方法，其中具有氮杂原子的有机碱化合物是分两批加入。
18.如权利要求1所述的方法，其中分离具有式I结构的化合物包括使用色谱法。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述色谱法是选自硅胶柱色谱、高压液相色谱和薄层色谱。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述色谱法是硅胶柱色谱，且其中该色谱法是通过使用包含一种或多种选自乙酸乙酯、己烷和庚烷的溶剂的流动相来进行。
21.如权利要求1所述的方法，其进一步包括固化具有式I结构的化合物。
22.如权利要求21所述的方法，其中固化具有式I结构的化合物包括：
a)将具有式I结构的化合物溶于甲醇中，并且
b)从水中沉淀具有式I结构的化合物；
从而固化具有式I结构的化合物。
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