CN105101994A - 用于口服脱敏的花生制剂的制备 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种用于管理治疗上有效的制剂的开发和制备工艺的方法。花生蛋白的特征在于花生粉，以及用所述花生粉制成的用于花生变态反应的口服免疫治疗的包囊制剂。

Description

用于口服脱敏的花生制剂的制备
交叉引用
本申请要求2013年3月14日提交的美国临时申请No.61/784,964的权益，通过引用将该申请整体并入本文。
本申请涉及2013年3月14日提交的名称为“花生制剂及其用途”的美国临时申请No.61/784,863(代理人案号No.43567-702.101)，其通过引用整体并入本文。
发明背景
变态反应影响人类和伴侣动物，并且一些变态反应(例如，那些对昆虫、食物、乳胶以及药物的变态反应)可能严重到危及生命。
变态反应发生在受试者的免疫系统对变应原做出应答时。通常受试者首次暴露于特定变应原时没有变态反应。然而，正是对变应原的初始应答，使系统对于后续的变态反应致敏。具体地，抗原呈递细胞(APC；例如，巨噬细胞和树突状细胞)摄取变应原，降解变应原，然后将变应原片段呈现给T细胞。T细胞，特别是CD4+“辅助性”T细胞，通过分泌一批对其它免疫系统细胞有影响的细胞因子做出应答。由应答的CD4+T细胞分泌的细胞因子的特性确定对变应原的后续暴露是否可诱发变态反应。两类CD4+T细胞(Th1和Th2；T淋巴细胞辅助型)影响对抗变应原的免疫应答的类型。
Th1型免疫应答涉及对变应原和感染剂细胞免疫的刺激，并且其特征为CD4+辅助性T细胞分泌IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ和TNF-β以及产生IgG抗体。CD4+T细胞暴露于变应原也可以激活细胞以发育成Th2细胞，其分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13。IL-4的产生刺激B细胞的成熟，其产生对变应原特异性的IgE抗体。这些变应原特异性的IgE抗体附着于肥大细胞和嗜碱性粒细胞受体，在其中它们引发对再次暴露于变应原的快速免疫应答。当受试者第二次遇到变应原时，变应原迅速被这些表面相关的IgE分子结合，导致组胺以及引发变态反应的其它物质的释放。已知具有高水平lgE抗体的受试者特别易于变态反应。
发明概述
本文提供一种制备用于在此提供的方法中的低剂量胶囊制剂的方法，其包括，(a)在第一次共混中将花生粉和稀释剂混合；(b)在第二次共混中加入约45％的稀释剂；(c)在第三次共混中加入剩余的稀释剂；(d)在最终共混中加入助流剂和/或润滑剂；和(e)将共混的粉末包囊于胶囊中。在一个实施方案中，步骤(a)的稀释剂包括淀粉或乳糖、微晶纤维素或磷酸二钙。在另一个实施方案中，步骤(b)和/或(c)的稀释剂包括淀粉、乳糖、微晶纤维素或磷酸二钙。在另一个实施方案中，步骤(d)的助流剂包括胶体二氧化硅(Cab-O-Sil)、滑石(例如，UltraTalc4000)或其组合。在另一个实施方案中，步骤(d)的润滑剂包括硬脂酸镁。在一个非限制性实施例中，助流剂包括Cab-O-Sil。在一个实施方案中，步骤(d)包括加入助流剂或润滑剂。在另一个实施方案中，步骤(d)包括加入助流剂和润滑剂。在另一个实施方案中，该方法还包括在包囊之前对共混的混合物进行一次或多次采样。在另一个实施方案中，剂量包含约0.5mg或约1.0mg花生蛋白。在所述方法的另一个实施方案中，步骤(d)还包括使共混的材料通过网筛。
本文提供一种制备用于在此提供的方法中的较高剂量胶囊制剂的方法，其包括，(a)在第一次共混中将花生粉和稀释剂混合；(b)排出共混的材料；(c)使共混的材料通过网筛并在第二次共混中共混经筛分的材料；(d)在第三次共混中加入助流剂和/或润滑剂；和(e)对共混的粉末进行包囊。在一个实施方案中，所述方法任选地包括在包囊之前对步骤(d)的共混的材料进行一次或多次取样。在又一个实施方案中，步骤(a)的稀释剂包括淀粉、乳糖或微晶纤维素或磷酸二钙。在另一个实施方案中，步骤(c)的网筛包括#20网筛。在另一个实施方案中，步骤(d)的助流剂包括胶体二氧化硅(Cab-O-Sil)、滑石(例如，UltraTalc4000)或其组合。在另一个实施方案中，步骤(d)的助流剂包括Cab-O-Sil。在另一个实施方案中，步骤(d)的润滑剂包括硬脂酸镁。在一个实施方案中，步骤(d)包括加入助流剂或润滑剂。在另一个实施方案中，步骤(d)包括加入助流剂和润滑剂。在另一个实施方案中，剂量包含约10mg、约100mg或约475mg花生蛋白。
本文提供一种制备用于在此提供的方法中的胶囊制剂的方法，其包括，将花生粉通过网筛；和包囊共混的粉末。在一个实施方案中，剂量包含约475mg花生蛋白。
在此类方法的任一种中，花生粉可以包含特征性花生蛋白。在一个实施方案中，花生蛋白包括Arah1、Arah2和Arah6。Arah1、Arah2和Arah6的浓度可通过RP-HPLC表征。在另一个实施方案中，Arah1、Arah2和Arah6的浓度至少是参考标准的量。
通过本文所述的任一方法生产的包囊制剂可以稳定至少约3、6、9、12、18、24、36或更多个月。
在一个实施方案中，包囊制剂在约2℃至约8℃，或约20℃至约30℃的温度下是稳定的。
在另一个实施方案中，所述包囊制剂在约20℃、约21℃、约22.5℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27.5℃、约28℃、约29℃或约30℃的温度下是稳定的。
可用于容纳通过本文所述的方法生产的制剂的胶囊大小可以是例如，大小3,00或000。在一个实施方案中，胶囊包含羟丙基甲基纤维素(HPMC)。
本文所述的方法可还包括将制剂贮存在容器装置中。任何合适的容器装置可用来贮存本文所述的包囊制剂。在一个实施方案中，容器装置可以是例如瓶子。瓶子可以是例如琥珀色瓶子，以使包囊制剂最小程度地暴露于紫外线。在另一个实施方案中，容器装置还包括用于控制该容器装置的水分含量的干燥剂包。
通过引用并入
在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同具体地和单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入本文中。
附图简述
本发明的新颖特征在所附的权利要求中具体阐述。通过参考下面给出其中运用了本发明的原理的说明性实施方案的详细描述和附图，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，其中：
图1：示出了利用反相HPLC在214nm处的花生粉提取物。还示出了USDAArah标准和1mg/mLBSA溶液。提取物如下：顶部图(panel)：花生粉，pH8.2提取物；第二张图：Arah1峰；第三张图：Arah2峰；第四张图：Arah6峰；底部图：1mg/mlBSA溶液。
图2：示出了来自112FA02411的RP-HPLC分析的色谱结果(GMP)。
图3：示出了来自112FA02411的RP-HPLC分析的色谱结果(非GMP)。
图4：示出了来自111FA36211的RP-HPLC分析的色谱结果(非GMP)。
图5：示出了经合并和RP-HPLC纯化的Arah蛋白的总蛋白染色。
图6：示出了经合并和RP-HPLC纯化的Arah蛋白的免疫印迹。
图7：示出了低剂量胶囊(0.5mg和1mg)的共混工艺流程图。
图8：示出了高剂量胶囊(至少10mg)的共混工艺。
图9：示出了来自112FA02411的RP-HLPC分析的色谱结果(GMP)。
发明详述
本文公开了从花生粉分离蛋白质的系统和方法，其可用来制备用于治疗花生变态反应的药物组合物。所述系统和方法利用高压(相)液相色谱(HPLC)从花生粉捕获Arah1、Arah2和Arah6。
在过去的十年中，已经对花生中的变应原有了很多了解。花生通常与严重的反应有关，包括危及生命的过敏反应。在食物变态反应的管理中现行的护理标准是避免饮食该食物以及在变态反应的急性管理中对受试者/家人进行教育。避免的负担以及对意外暴露的持续担忧负面地影响着受试者和他们的家人的健康相关的生活质量。生活质量调查表明，拥有患食物变态反应的孩子的家庭，在准备食物、社会活动、寻找适合的托管、上学和压力水平等方面有显著的影响。
目前，花生变态反应的唯一疗法是无花生饮食和容易获得可自我注射的肾上腺素。然而，由于难以解释标记以及在商业制备的食物中存在未声明的或隐藏的变应原，因而可使严格的饮食避免变得复杂。不幸的是，意外摄入是常见的，高达50％的食物变态反应受试者在两年时间内具有变态反应。对花生的变态反应可以是严重的且危及生命的；并且花生和/或树坚果变态反应占致命的食物诱导的过敏反应的绝大多数。严格的饮食避免、意外暴露的高发生率、以及意外暴露导致的严重或甚至致命反应的风险的这种结合，对受试者和他们的家庭增加了巨大的负担和压力。更复杂的问题是，事实上只有约20％的儿童会随着长大而不再患有花生变态反应，这意味着患有花生变态反应的大多数人会终生罹患它。如果我们将在西方国家的患病率上升和花生的消费量增加与以下事实相结合：只有大约五分之一的人会随着长大而不再患有变态反应，变态反应有可能是严重的或者甚至是致命的，而且意外暴露是常见的，则开发一种对花生变态反应的有效疗法变得更加迫切。
近年来，针对食物变态反应(尤其花生变态反应)的以口服免疫治疗(OIT)和舌下免疫治疗(SLIT)形式的特异性免疫治疗已经进行了研究，并在早期临床试验中已显示出鼓舞人心的安全性和功效结果，包括有益的免疫学变化。已有证据表明，OIT在大部分受试者中诱导脱敏，随时间发生免疫学变化，这表明了朝向临床耐受性的进展。
花生OIT：在Jones等中，花生变态反应的儿童经历了OIT治疗方案，该方案由初始剂量每天递增，每两周累积(至2g)和日常维护期随后OFC组成。在基线，在口服食物激发(oralfoodchallenge)(OFC)期间耐受小于50mg花生蛋白之后，在完成OIT治疗方案时，29个受试者中的27个摄取了3.9g的花生蛋白。
最近，WesleyBurks博士(美国变态反应、哮喘和免疫学学会全国性会议(AmericanAcademyofAllergy,Asthma,andImmunologyNationalConference).佛罗里达州(Orlando)，奥兰多市(Florida)，2012年3月6日)提出的工作表明，10名具有PA的儿童完成了OIT治疗方案，并在停止经口摄入花生后的4周经历了口服食物激发(OFC)，以评估临床“持续无应答性”的发展。十分之三的受试者通过了OFC；作者认为这些受试者是临床耐受性的。在治疗过程中，在进入OIT3个月的时间点时，花生IgE水平低于85kU/L可预测成为免疫耐受的受试者。
一项由Varshney等报道的多中心双盲随机化的安慰剂对照研究，检查了28个受试者。三个受试者在研究早期因为变态反应的副作用而退出。在完成剂量递增之后，进行双盲安慰剂对照的食物激发，其中所有其余的花生OIT受试者(n＝16)摄入了5000mg(大约20颗花生)的最大累积剂量，而安慰剂受试者(n＝9)仅能耐受280mg的中位累积剂量(范围，0-1900mg；P<.001)。与安慰剂组相比，花生OIT组表明在皮肤点刺试验中大小减小(P<0.001)，并且花生特异性IgG4增加(P<0.001)。花生OIT受试者具有花生特异性IgE的初始增加(P<0.01)，但到口服食物激发时并未表现出从基线起的显著变化。
定义
除非另有规定，本文中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本文所述的发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同。在此提到的所有专利和出版物均通过引用并入本文。
如本文所用，术语“动物”是指人类以及非人类动物，包括，例如，哺乳动物、鸟类、爬行类、两栖类和鱼类。优选地，非人类动物为哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、灵长类动物或猪)。动物可以是转基因动物。
如本文所用，术语“抗原”是指一种分子，该分子在动物中引发抗体应答(即，体液应答)和/或与T细胞的抗原特异性反应(即，细胞应答)的产生。
如本文所用，术语“变应原”是指抗原的子集，其引发除了抗体的其它同种型之外的IgE的产生。术语“变应原”、“天然变应原”和“野生型变应原”可以互换使用。用于本发明目的的优选变应原是蛋白变应原。
如本文所用，短语“变态反应”涉及IgE介导的免疫应答，其临床症状主要涉及皮肤系统(例如，荨麻疹、血管性水肿、瘙痒)、呼吸系统(例如，喘鸣、咳嗽、喉头水肿、流鼻涕、泪眼/眼痒)、胃肠道系统(例如，呕吐、腹痛、腹泻)以及心血管系统(即，如果发生全身性反应)。对于本发明的目的，哮喘反应被认为是变态反应的一种形式。
如本文所用，短语“过敏性变应原”是指在自然条件下，在其自然状态遇到时，被识别为在变态反应性个体中存在过敏性反应的危险的变应原的子集。例如，对于本发明的目的，花粉变应原、螨变应原、在动物皮屑或排泄物(例如，唾液、尿液)中的变应原、以及真菌变应原不被认为是过敏性变应原。另一方面，食物变应原、昆虫变应原和橡胶变应原(例如，来自乳胶)通常被认为是过敏性变应原。食物变应原为在本发明的实践中使用的特别优选的过敏性变应原。具体地，豆类(花生)、树坚果变应原(例如，来自核桃、杏仁、山核桃、腰果、榛子、开心果、松子、巴西坚果)、乳制品变应原(例如，来自鸡蛋、牛奶)、种子变应原(例如，来自芝麻、罂粟、芥末)、大豆、小麦和海鲜变应原(例如，来自鱼、虾、蟹、龙虾、蛤、贻贝、牡蛎、扇贝、小龙虾)是根据本发明的过敏性食物变应原。特别关注的过敏性变应原是对其反应通常很严重以致产生死亡风险的那些变应原。
如本文所用，短语“过敏性”或“过敏反应”是指变态反应的子集，其特征为由在过敏性变应原诱导的肥大细胞和嗜碱性粒细胞上高亲和力IgE受体的交联继发的肥大细胞脱粒，随后介质释放，以及在靶器官例如气道、皮肤消化道和心血管系统中产生严重的全身性病理学应答。如本领域已知的，对过敏性反应的严重性可以进行监测，例如，通过测定皮肤反应、眼睛和嘴周围的肿胀、呕吐和/或腹泻，随后测定呼吸道反应，诸如喘鸣和呼吸吃力。最严重的过敏性反应可导致意识丧失和/或死亡。
如本文所用，短语“抗原呈递细胞”或“APC”是指将抗原处理并呈递给T细胞以引发抗原特异性应答的细胞，例如，巨噬细胞和树突状细胞。
如本文所述，当两个实体彼此“缔合”时，它们是通过直接或间接的共价或非共价相互作用而连接。优选地，该缔合是共价键。期望的非共价相互作用包括，例如，氢键、范德华相互作用、疏水相互作用、磁相互作用等。
如本文所用，短语“减少过敏反应”涉及在治疗与暴露于过敏性变应原相关的症状后，临床症状减少，其可包括经由以下方式的暴露：皮肤、呼吸道、胃肠道和粘膜(例如，眼、鼻和耳)表面或皮下注射(例如，经由蜂螫伤)。
如本文所用，术语“表位”是指包含大约六个和十五个氨基酸之间的氨基酸基序的结合位点，其在由APC连同主要组织相容性复合体(MHC)呈递时，可由免疫球蛋白(例如，IgE、IgG等)结合或由T细胞受体识别。线性表位是一种表位，其中氨基酸在简单的线性序列的环境下被识别。构象表位是一种表位，其中氨基酸在特定的三维结构的环境下被识别。
根据本发明的变应原“片段”是变应原的比完整的天然变应原小的任何局部或部分。在本发明的优选的实施方案中，变应原是蛋白质，并且片段是肽。
如本文所用，短语“免疫显性表位”是指相对于存在于相同抗原中的其它表位的抗体反应的百分比或效价，以占致敏群的很大比例被抗体结合的表位，或其中抗体效价高的表位。在一个实施方案中，免疫显性表位以占致敏群的超过50％，更优选超过60％、70％、80％、90％、95％或99％被抗体结合。
如本文所用，短语“免疫刺激序列”或“ISS”是指细菌、病毒或无脊椎动物来源的寡聚脱氧核苷酸，其被APC摄取并激活它们以表达某些膜受体(例如，B7-1和B7-2)和分泌各种细胞因子(例如，IL-1、IL-6、IL-12、TNF)。这些寡聚脱氧核苷酸含有未甲基化的CpG基序，并且当连同抗原被注射到动物中时，似乎呈现出使免疫应答倾向于Th1-型应答。参见，例如，Yamamoto等，Microbiol.Immunol.36:983,1992；Krieg等,Nature374:546,1995；Pisetsky,Immunity5:303,1996；和Zimmerman等,J.Immunol.160:3627,1998。
如本文所用，术语“包含”、“包括”和“例如”是以它们的开放的、非限制性的含义使用。
术语“约”与术语“大约”同义地使用。如本领域的普通技术人员将理解的，“约”的确切边界将取决于组合物的组分。示例性地，使用术语“约”来表示略微超出引用值的值，即，加或减0.1％至10％，这也是有效的和安全的。在另一个实施方案中，使用术语“约”来表示略微超出引用值的值，即，加或减0.1％至5％，这也是有效的和安全的。在另一个实施方案中，使用术语“约”来表示略微超出引用值的值，即，加或减0.1％至2％，这也是有效的和安全的。
“分离的”(与“基本上纯的”互换使用)，当适用于多肽时是指多肽或其部分，其已经从与其一起天然存在的其它蛋白分离。通常，多肽也从例如用来纯化它的抗体或凝胶基质(聚丙烯酰胺)的物质中基本上(即，至少约70％至约99％)分离。
制剂
本文所述的制剂包含一种或多种活性成分。活性成分可以从花生粉分离，该花生粉可从任何来源获得，诸如例如，GoldenPeanut公司。花生粉可以是从轻度烘烤的花生研磨得到的约10％至约15％，或约12％的脱脂花生粉。在一些情况下，花生粉可以是由供应商在含量和微生物学的标准分析后提供的，并且可以在冷藏条件下保持稳定9-12个月。花生粉可以在施用于受试者之前进行配制、包囊和测试。
针对花生粉、块状物质(BS)和最终制剂的分析，已经开发了反相HPLC分析(RP-HPLC)，其分离出三种花生粉蛋白变应原：Arah1、Arah2和Arah6。该分析形成在释放时和稳定性期间鉴定和含量测定的基础。反相HPLC分析可以用作鉴定分析和用来监测批与批之间的一致性和对于生产特征性花生变应原制剂可接受的花生变应原的稳定性。
也可以使用酶联免疫吸附测定(ELISA)和凝胶分析来进行蛋白变应原的其它表征。
花生和花生粉是在许多食品配方中常见的食品和添加剂。本发明人确定的特征性花生变应原的预期临床用途以与食品中所含的量相比相对小的量(0.5至4000mg/剂)获得，并且可以通过与口服摄取含有花生的产品相同的途径进行递送。
本文所述的制剂可以在多中心安慰剂对照的研究中进行测试，以证明在对花生摄入具有中度至重度临床反应的约4岁至约26岁的受试者中特征性花生变应原的安全性和功效。可以排除具有显著的并发性健康状况、不受控制的哮喘、或之前由于过敏反应进过重症监护病房的受试者。在维持和增加特征性花生变应原(CPA)剂量期间，可以允许标准的抗变态反应药物(例如，抗组胺剂、口服皮质类固醇等)。
一种包含特征性花生变应原(CPNA)的制剂，其可以包含与一种或多种稀释剂、一种或多种助流剂、一种或多种润滑剂和任选的一种或多种填充剂以递增剂量一起配制的花生蛋白(包含花生变应原蛋白Arah1、Arah2和Arah6)，其包括含有约0.5mg、约1mg、约10mg、约100mg和约1000mg的每种花生蛋白的胶囊。可以在给药之前即刻将每个胶囊打开并将内容物混入掩味的食物中。
活性药物成分最初来源为生花生、落花生、豆科植物家族的成员。生花生可从多个农业源中获取，其中去壳的生花生被加工成12％的脱脂烤花生粉(PF)。所述PF可包括用于在cGMP条件下进一步处理的分析证书(CofA)。
CPNA胶囊的配制、填充和测试可在cGMP合约生产现场进行。在cGMP生产条件下，将由大约50％花生蛋白质(重量/重量)组成的蛋白粉(PF)与一种或多种稀释剂、一种或多种助流剂和一种或多种润滑剂混合。
在一个实施方案中，组合物包含一种或多种稀释剂。在制剂中使用的“稀释剂”包括但不限于，藻酸及其盐；纤维素衍生物诸如羧甲基纤维素、甲基纤维素(例如，)、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素(例如，)、乙基纤维素(例如，)、微晶纤维素(例如，)；硅化微晶纤维素；微晶右旋糖；直链淀粉；硅酸镁铝；多糖酸；膨润土；明胶；聚乙烯吡咯烷酮/醋酸乙烯酯共聚物；交联聚维酮；聚维酮；淀粉；预胶化淀粉；黄蓍胶、糊精、糖，诸如蔗糖(例如，)、葡萄糖、右旋糖、糖蜜、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇(例如，)、乳糖(例如，乳糖一水合物、无水乳糖等)；磷酸二钙；天然或合成的树胶，诸如阿拉伯胶、黄蓍胶、印度树胶，伊莎贝果壳(isapolhusk)粘液、聚乙烯吡咯烷酮(例如，CL、CL、XL-10)、落叶松阿拉伯半乳聚糖、聚乙二醇、蜡类、藻酸钠、淀粉，例如天然淀粉，诸如玉米淀粉或马铃薯淀粉，预胶化淀粉如Colorcon(淀粉1500)、National1551或或羟基乙酸淀粉钠，诸如或交联淀粉，诸如羟基乙酸淀粉钠；交联聚合物，诸如交联聚维酮；交联聚乙烯吡咯烷酮；藻酸盐，诸如藻酸或藻酸的盐，如藻酸钠；粘土诸如HV(硅酸铝镁)；树胶诸如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶、刺梧桐胶、果胶或黄蓍胶；羟基乙酸淀粉钠；膨润土；天然海绵；表面活性剂；树脂诸如阳离子交换树脂；柑橘果肉；月桂基硫酸钠；月桂基硫酸钠的组合淀粉；及其组合。在一个实施方案中，所述制剂包含微晶纤维素或淀粉1500。在另一个实施方案中，所述制剂包含微晶纤维素和淀粉1500。
用于本文所述的固体剂型中的合适的助流剂(抗结块剂)包括但不限于，胶体二氧化硅(Cab-O-Sil)、滑石(例如，UltraTalc4000)及其组合。在一个实施方案中，所述组合物包含Cab-O-Sil。
用于本文所述的固体剂型中的合适的润滑剂包括但不限于，硬脂酸、氢氧化钙、滑石、玉米淀粉、硬脂酰富马酸钠、碱金属和碱土金属盐，诸如铝、钙、镁、锌，硬脂酸、硬脂酸钠、硬脂酸镁、硬脂酸锌、蜡、硼酸、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇诸如CarbowaxTM、PEG4000、PEG5000、PEG6000、丙二醇、油酸钠、山嵛酸甘油酯、棕榈酰硬脂酸甘油酯、苯甲酸甘油酯、月桂基硫酸镁或月桂基硫酸钠，及其组合。在一个实施方案中，所述组合物包含硬脂酸镁。在另一个实施方案中，所述组合物包含硬脂酰富马酸钠。
在一些实施方案中，制剂可还包含一种或多种填充剂。“填充剂”包括以下化合物，诸如乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉末、右旋糖、葡聚糖结合剂、葡聚糖、淀粉、预凝胶淀粉、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、氯化钠、聚乙二醇，及其组合。
本文中所述的成分可以根据例如图7和8中所示的工艺而进行混合。混合的制剂随后可以以0.5、1、10、100mg、475mg和1000mg的花生蛋白包囊在大小3,00或000的羟丙基甲基纤维素(HPMC)胶囊中。相容性研究可以评估花生粉与一种或多种赋形剂的组合，其在某些情况下可具有GRAS认可。稀释剂提供了配制含有从打开的胶囊分散的足够量的低剂量和高剂量的机会。助流剂和润滑剂增加了PF的流动性，使得受试者或执业医生在给药时，使粉容易地从胶囊清空。为了临床试验，可以将所述胶囊块状包装到容器装置中，诸如例如，瓶子。在一些情况下，可以处理所述容器装置以(部分或完全)防止暴露于光。例如，容器装置可以是琥珀色的。在一些情况下，容器装置也可以包括干燥剂，以(部分或完全)防止在运输和贮存过程中暴露于水分。在使用时，可以在给药之前即刻打开含CPNA的胶囊并将其内容物混入掩味的食物中。
为了使花生蛋白变应原的递送标准化，已经开发出cGMP制备的特征性花生变应原(CPNA)制剂。所述制剂中的蛋白质含量从两个方面而言是至关重要的。首先，递送的总蛋白在批次之间应保持一致，其次，关键的单个变应原的比例应加以控制。
块状物质和最终制剂释放的总蛋白质含量可以使用本文描述的解决了工业中现有问题的蛋白质测定方法来定量：现有问题即，在本申请之前，确定花生粉中的单个花生蛋白变应原的绝对量或相对量更加成问题，并且还没有得到控制。
花生蛋白是由几种单个蛋白变应原组成的，其通常是利用来自变态反应人类或免疫的动物中的变应原特异性多克隆抗血清通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法可检测的。在这些蛋白质中，基于免疫印迹、对来自花生变态反应人类的人血清的粗花生提取物的反应性、以及从致敏嗜碱性粒细胞释放的体外组胺，Arah1、Arah2和Arah6已被鉴定为变态反应性花生蛋白变应原，其中Arah2和Arah6提供粗花生提取物的大部分致敏活性。
在本申请之前，花生变应原蛋白通常是通过大小排阻色谱(SEC)或聚丙烯酰胺凝胶电泳从粗花生提取物中分级分离而得到。这些技术可对Ara蛋白的光谱呈现相对视图，但没有提供为了比较在花生粉批次中单个花生变应原的表达所需的分辨率和灵敏度，也没有提供随着时间蛋白质结构的可能变化。为了解决这些限制，本发明人已开发了一种反相HPLC(RP-HPLC)方法来提高分辨率，并允许花生变应原Arah1、Arah2和Arah6的物理分离。
开发了一种用于确定和表征烤花生粉中的Arah1、Arah2和Arah6变应原蛋白的测定。使用pH8.2的Tris缓冲液，接着进行离心和过滤，对简单的单级提取工序进行改进。将样品制备成100mg/mL，并在60℃下提取3小时。最终干净的滤液适合直接通过HPLC进行分析。
HPLC分离利用反相分离，所述分离使用具有键合的丁基固定相的宽孔硅胶柱。可以基于0.1％三氟乙酸和乙腈而使用二元梯度。流动相可以是与质谱兼容的。因为在280nm处检测可降低灵敏度，所以可以使用UV检测器在214nm处完成检测。
所述方法的特异性可以通过比较全花生提取物与Arah蛋白的保留时间和峰图来确定。在一些情况下，主要的Arah蛋白峰可能无法解析为离散实体，而是可能会出现许多类似的蛋白质的集合。因此，Arah1、Arah2和Arah6变应原在保留时间区域内可能显示为峰簇。因此，然后将特定Arah蛋白的相对量确定为在限定的洗脱区域内的总面积的百分比。对不同区域的色谱分辨率进行评估，并且该方法可用于针对花生粉蛋白的不同批次和来源，比较这些区域图中的细微差别，以及所述制剂的稳定性。
图1中示出了在214nm处的色谱系列的代表性实例，比较了粗提取物(顶部图)与纯化的Arah1、Arah2和h6蛋白以及BSA的特征谱。
RP-HPLC方法预定性可以通过比较单花生粉批次的三种独立的制剂、通过比较在不同的两天由两个不同的分析员进行的重复测定的结果、或通过比较在同一天或不同天不同批次的花生粉的独立制剂的结果来进行评估。
精确度可通过进行一式三份的单个样品的提取，并根据所提出的方法对结果进行分析来估计(参见，例如，表1)。对单批次花生粉进行一式三份的提取和测定；报告值是每个Arah类别的面积百分比。峰的积分可以通过使用数据系统(例如，ChemStation)上的强制积分(forcedintegration)事件或手动积分来进行。单批次花生粉的这些一式三份独立制剂的精确度，可以从针对Arah6的约1.1％相对标准偏差(RSD)至针对Arah1的约18.3％相对标准偏差变化。针对Arah1的较高(％RSD)可能与积分来自后续较大簇的Arah1肩峰有关。
表1:RP-HPLC方法精确度
第二精确度方法比较由两个不同的分析员在不同的两天进行测定所获得的结果。呈现的每个值代表一式两份注射的平均值。表2提供了针对由两个不同的分析员在不同天得到的三个花生粉批次的可提取的蛋白质含量和面积百分比值进行比较的示例性结果。从这些测定中获得的定量结果比较得出Arah值符合86％至107％之间；总蛋白质含量可以符合在95％-102％内。还可以呈现这两个分析员之间匹配的百分比。
表2:RP-HPLC方法精确度
各种PF批次的分析可以用于证明对于多批次的花生粉，无论是单独地还是相对于彼此，Arah1、Arah2和Arah6的表达是一致的。该试验也可以形成在释放时和稳定性期间测定鉴定和含量测试的基础。
通过第二cGMP制造商进行该测定并分析。HPLC图谱(参见，例如，图2、图3和图4)、总蛋白和总蛋白中的每个变应原的百分比(参见，例如，表3)在由两个实验室使用相同的花生粉批次进行的测定之间是基本一致的(允许数据的桥接)。
表3Arah蛋白和总的可提取蛋白质含量的比较
RP-HPLC确认研究
为了确认该RP-HPLC峰轮廓实际上分开并鉴定Arah1、Arah2和Arah6，从各峰中分离的物质可利用例如4-20NovexTris-HCl预制凝胶通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步进行表征(参见，例如，图5)。可以将其它的凝胶转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，处理用于免疫印迹并且可与Arah1、Arah2或Arah6鸡抗血清反应，并利用例如由deJong等(EMBOJ.,1988；7(3):745-750)描述的测定方法用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗鸡IgG显影。应当指出，虽然提取物可以从烤花生粉中得到，但是该抗血清可以针对从生花生提取物中纯化的Arah蛋白而生成。所述抗血清与源自生花生的对照Arah蛋白和源自从烤花生提取物中得到的分离的Arah蛋白二者均发生反应(参见，例如，图6)。
所述免疫印迹显示，从三个主要的HPLC峰的每个峰分离的物质与适当的花生蛋白特异性抗血清发生反应，并且该免疫反应性蛋白质的分子量对应于文献中(Koppelman等，2010)报告的蛋白质分子量。经测定，从花生粉中提取的Arah蛋白对加热至60℃不敏感。可以进行其它的确认试验；这些测定可用于建立最适当的稳定性指示分析，其提供对在长期贮存期间发生的变化最大的灵敏度。然而，本文描述的早期免疫印迹数据表明，报告的RP-HPLC方法可跟踪花生粉批次中的单个花生蛋白。
花生粉的来源和测试
用在本文所述的制剂中的花生粉(PF)可源自任何可靠的生产者，包括但不限于GoldenPeanut公司(GPC)，其生产花生粉和花生油(使烤花生脱脂的副产品)。
GPC制备工厂可通过国际认可的对食品安全项目的认证机构来审计(例如天祥集团(IntertekLabtest)(UK)有限公司)。所述审计可重点关注符合针对食品安全的英国零售商协会食品标准(BRC)全球标准。BRC全球标准是全球领先的安全和质量认证项目，其在遍及全世界的90个国家中超过17,000个认证的供应商通过超过80个认可的网络和BRC认证的认证机构而使用。BRC全球标准被广泛用于供应商和全球零售商。它们促进质量、安全、操作标准和制造商履行法律义务的标准化。它们还帮助对消费者提供保护。有最新的审计过程中，无重大或严重的不合格的调查结果。
所述PF可以是从轻度烘烤的花生研磨得到的约12％脱脂花生粉。所述PF可以是由供应商在通过含量和微生物学的标准分析后的，并且被确定为在冷藏条件下保持稳定9个月。
针对PF的引入的原材料的释放测试
在释放用于cGMP生产之前可以对所述PF原材料测试外观、鉴定、总蛋白质含量和水分含量(参见，例如，表4)。所述PF可贮存于2-8℃的控制条件下。
表4:针对PF的原材料测试
制剂的赋形剂
表5提供了可以在本文所述的制剂中使用的示例性赋形剂。在本说明书中的其它地方提供了可在本文所述的制剂中使用的其它赋形剂。
示例性的预期剂型包括，例如，基于羟丙基甲基纤维素(HPMC)的胶囊；剂型的强度可为约0.5mg、约1mg、约10mg、约100mg、约475mg、或约1000mg的花生蛋白。在一些情况下，花生蛋白本身可能是不具有对常规药物制备工艺有利的固有流动性的黏性材料。因此，可以将非活性药物成分(赋形剂)加入到制剂中，以使花生花可被开发成具有流动特性的适当的药物剂型，以改善剂型的制备和递送。
可以进行相容性研究来评估花生粉与示例性赋形剂种类(稀释剂、助流剂和润滑剂)的组合。所述赋形剂可具有GRAS认可或可被证明在药物制剂中是安全的。所述稀释剂提供了配制含有从打开的胶囊分散的足够量的低剂量和高剂量的机会。所述助流剂和润滑剂增加了PF的流动性，使得受试者容易地将粉从胶囊清空。
按照表5所考虑的每种赋形剂被指定为USP、NF或USP-NF。
表5:所考虑的赋形剂
特征性花生变应原的配制
(含有花生变应原蛋白Arah1、Arah2和Arah6的)花生粉可以与膨胀剂(bulking)和流动剂以递增剂量一起配制，其包括含有0.5mg、1mg、10mg、100mg和1000mg的每种花生蛋白的胶囊。
低剂量胶囊(0.5mg和1mg)
图7和表6概述了所提出的针对低剂量胶囊的共混工艺，所述低剂量胶囊包括0.5mg花生蛋白胶囊和1mg花生蛋白胶囊。
本文提供一种制备用于在此提供的方法中的低剂量胶囊制剂的方法，其包括，(a)在第一次共混中将花生粉和稀释剂混合；(b)在第二次共混中加入约45％的稀释剂；(c)在第三次共混中加入剩余的稀释剂和/或润滑剂；(d)在最终共混中加入助流剂；和(e)将共混的粉末包囊于胶囊中。在一个实施方案中，步骤(a)的稀释剂包括淀粉、乳糖、或微晶纤维素或磷酸二钙。在另一个实施方案中，步骤(b)和/或(c)的稀释剂包括淀粉、乳糖或微晶纤维素或磷酸二钙。在另一个实施方案中，步骤(d)的助流剂包括胶体二氧化硅(Cab-O-Sil)、滑石(例如，UltraTalc4000)或其组合。在另一个实施方案中，步骤(d)的助流剂包括Cab-O-Sil。在另一个实施方案中，步骤(d)的润滑剂包括硬脂酸镁。在另一个实施方案中，所述方法还包括在包囊之前对共混的混合物进行一次或多次取样。在另一个实施方案中，所述剂量包含约0.5mg或约1.0mg的花生蛋白。在一个实施方案中，所述方法任选地包括对步骤(d)的共混的材料进行取样。在一个实施方案中，步骤(d)包括加入助流剂或润滑剂。在另一个实施方案中，步骤(d)包括加入助流剂和润滑剂。
表6:针对低剂量胶囊(0.5mg和1mg)的建议操作步骤
高剂量胶囊(10mg、100mg和475mg)
图8和表7概述了所提出的针对高剂量胶囊的共混工艺，所述高剂量胶囊包括10mg花生蛋白胶囊、100mg花生蛋白胶囊和475mg花生蛋白胶囊。
本文提供一种制备用于在此提供的方法中的高剂量胶囊制剂的方法，其包括，(a)在第一次共混中将花生粉和稀释剂混合；(b)排出共混的材料；(c)使所述共混的材料通过网筛并在第二次共混中共混经筛分的材料；(d)在第三次共混中加入助流剂和/或润滑剂；和(e)将共混的粉末包囊。在一个实施方案中，所述方法任选地包括在包囊之前对步骤(d)的共混的材料进行一次或多次取样。在又一个实施方案中，步骤(a)的稀释剂包括淀粉、乳糖或微晶纤维素或磷酸二钙。在另一个实施方案中，步骤(c)的网筛包括#20网筛。在另一个实施方案中，步骤(d)的助流剂包括胶体二氧化硅(Cab-O-Sil)、滑石(例如，UltraTalc4000)或其组合。在另一个实施方案中，步骤(d)的助流剂包括Cab-O-Sil。在另一个实施方案中，步骤(d)的润滑剂包括硬脂酸镁。在一个实施方案中，步骤(d)包括加入助流剂或润滑剂。在另一个实施方案中，步骤(d)包括加入助流剂和润滑剂。
表7:针对高剂量胶囊(10mg、100mg和475mg)的建议操作步骤
块状物质的控制
表8中汇总了用于配制块状物质的示例性建议规格。
表8:块状物质的建议规格
块状(bulk)稳定性测试
可以在24小时的共混时间内将制剂填充到胶囊中。
制剂
组合物的化学和制备概述
(含有花生变应原蛋白Arah1、Arah2和Arah6的)花生粉可以与膨胀剂和流动剂以递增剂量一起配制，其包括胶囊，胶囊包含约0.5mg、约1mg、约10mg、约100mg、约475mg、或约1000mg的每种花生蛋白与一种或多种稀释剂、一种或多种助流剂、一种或多种润滑剂。任选地可加入一种或多种填充剂。可以在给药之前即刻将每个胶囊打开并将其内容物混入掩味的食物中。
满足全球药物标准的非动物胶囊可用于本文所述的制剂。在一个非限制性实施方案中，可以使用来自Capsugel的HPMC胶囊。
在另一个非限制性实施方案中，胶囊可以是颜色编码的，以区分不同的剂量也可以生产匹配的颜色编码的安慰剂胶囊。
表9:示例性剂型
花生蛋白剂量 胶囊大小
1 0.5mg 3
2 1mg 3
3 10mg 00
4 100mg 00
5 475mg 000
制剂的最终赋形剂组成可在完成与不同的赋形剂(参见表5)进行的相容性研究之后来确定。
制备工艺
包囊方法/设备可基于对所开发的批次的填充重量变化评估来确定。过程控制可包括定期重量检查。
制剂的控制
在表10中列出所述制剂的示例性释放规格。
表10:制剂的建议规格
外观
可对块状物质(例如，在一步或多步制备步骤中的制剂和/或在包囊之前的最终混合物的制剂)和制剂进行外观评估。外观的评估可包括，例如，由在白色背景下目测检查由全光谱光线照射的容器组成。
含量均匀性
胶囊的含量均匀性(CU)可根据USP标准进行。含量均匀性可基于总蛋白氮含量燃烧试验。目的是利用灵敏度来确定燃烧仪，以便能够测定所有剂量下的各个胶囊。
递送质量
胶囊的递送质量可以通过称重胶囊，排空内容物，并称重该排空的胶囊来进行评估。然后可以计算出递送量％。
水分含量
水分含量可影响蛋白质的稳定性，并且了解水分含量随时间的变化对了解制剂的变化(在一些情况下，可导致较短的保质期)是有用的。对于花生粉填充的胶囊而言，水分含量可利用根据USP的干燥失重(LOD)测定法来测量。LOD的条件可基于赋形剂要求和对花生粉的要求来确定。
鉴定(RP-HPLC)
RP-HPLC可用于确认PF、BS和最终制剂的鉴定。可根据在与本申请同一日提交的、名称为“花生制剂及其用途”的相关申请(代理人案号43567-702.101)中的更详细描述的方法对样品进行分析，通过引用将该申请整体并入本文，并且可将所得的色谱与试验方法中所提供的示例性色谱进行比较(参见，例如，图9)。
如果样品的色谱与所述方法中提供的色谱相匹配，则花生粉的阳性鉴定可得到确认。如果没有确认阳性指示，则一批花生粉可作为不合格品而被丢弃。安慰剂中缺乏活性可通过证明在色谱中在12和35分钟之间没有峰洗脱而得到确认。
总提取蛋白
胶囊制剂中总提取蛋白的测定可采用与花生粉中总提取蛋白的测定类似的方法。所述方法可对所有强度进行评估。简言之，可将胶囊内容物排空，称重，并通过RP-HPLC进行分析。使用此工序提取的花生粉样品的色谱分析产生花生粉提取物特有的色谱“指纹”。可对在大约12分钟和35分钟之间洗脱的样品的区域进行积分。积分的总面积可以对照BSA标准进行定量。然后可利用以下等式计算出总提取蛋白质含量。
其中：
Ru＝在测定样品中总Arah蛋白的峰面积或Arah类别的峰面积；
Rs＝在所有测定标准中的平均BSA峰面积CSTD＝BSA测定标准浓度(mg/mL)；
V样品＝测定样品的总稀释体积(10.0mL)；且
Wt样品＝花生粉样品的重量(g)。
表观Arah1、Arah2和Arah6蛋白比
使用RP-HPLC法对提取的样品进行色谱分析可产生花生粉提取物特有的色谱“指纹”，以及对应于Arah1、Arah2和Arah6的区域的相对比率(参见，例如，图1)。这些区域的每一个的蛋白质含量(mg/g)可根据上面提供的等式来定量。然后根据以下等式计算出每个区域的总蛋白质的相对百分比含量。
蛋白质含量
填充胶囊中的蛋白质含量可按照与花生粉中的蛋白质含量相同的方式(AOCS官方方法Ba4e-93)来确定。由于准确的蛋白质含量确定可取决于样品中的氮含量，因此不可以在制剂中使用含氮的赋形剂。该方法是基于Dumas方法并基于粗蛋白在纯氧气中的燃烧，并测量放出的氮气。可采用的方法可以是AOCS官方方法Ba4e-93。AOCS方法的定义和范围如下。
简单地说，这种方法描述了一种用于测定粗蛋白的通用燃烧方法。在纯氧气中高温下的燃烧释放氮，对其通过热导率检测进行测量，然后通过适当的数值因子换算为等值的蛋白。这是汞催化剂Kjeldahl方法的一种替代方法，且具有以下两个优点：1)氮测定需要的时间更短，和2)没有使用危险和有毒化学品。
稳定性测试
可将制剂贮存于2-8℃。为了评估加速和长期稳定性，可根据表11和表12中描述的频率和规格对制剂进行测试。可在所有时间点对外观/颜色、水分、鉴别和强度进行测试，并可在12、24和36个月每年一次进行微生物负载测试。
表11A:制剂的稳定性方案测试方案
表11B-11F提供了在5℃下测试各种制剂的稳定性获得的数据。
表11B
表11C
表11D
表11E
表11F
表11G-11K提供了在25℃下测试各种制剂的稳定性获得的数据。
表11G
表11H
表11I
表11J
表11K
表12A：制剂的稳定性方案规格
*微生物含量可在释放时且每年进行测量。
表12B-12K提供了在5℃和25℃下、在不同的时间点对各种制剂的稳定性和特性进行评估所获得的数据。
表12B
表12C
表12D
表12E
表12F
表12G
表12H
表12I
表12J
表12K
安慰剂
安慰剂可由不含PF的赋形剂的限定混合物组成。可将安慰剂填充在与活性制剂相同的颜色编码的胶囊中。
表13：安慰剂释放规格
使用方法
使用本文所述的方法制备的药物组合物可用于对各批次的花生蛋白的产品一致性进行比较。
花生和花生粉是许多食物产品中常见的食品和添加剂。特征性花生变应原(CPA)预期的临床应用相比于食品中所含的量相对较少(0.5至4000mg/剂)，并且可以通过与口服摄取含有花生的产品相同的途径被递送。
目前，以食物变态反应动物模型探索治疗方式的临床前研究有限。在小鼠中诱导花生变态反应的主要模型是通过口服管饲法将小鼠暴露于呈花生酱、研磨的烤花生、或纯化的花生蛋白与霍乱毒素相结合的形式的花生蛋白。经过3至6周的暴露之后，对小鼠进行激发以证明变态反应应答。可通过腹膜内注射亚致死剂量的本文所述的制剂来激发小鼠，并对反应严重性进行评分。目的是为了表明，过敏反应的主要激发子是特定的Arah蛋白，而不是所有花生蛋白的组合。在免疫治疗方案中，用全花生提取物、耗尽Arah蛋白的提取物或单独用纯化的Arah蛋白处理小鼠。在经处理后激发时，可对小鼠在体温、症状评分和小鼠肥大细胞蛋白酶1释放方面的变化进行评估。对为了进一步激发而脱敏的小鼠可利用全提取物或Arah蛋白组合进行处理。
通过在被花生蛋白致敏的野生型C57BL/6、B细胞缺陷的、CD40L缺陷的、肥大细胞缺陷的或FcεRIε-链-缺陷的小鼠中探索，可以确定花生诱发的过敏反应潜在的细胞需求。在利用本文所述的制剂进行腹膜内激发之后，通过测量抗原特异性免疫球蛋白(Ig)、总体症状评分、体温、血管通透性、肥大细胞介质的释放和过敏性反应来评估过敏反应。IgE和Th2相关细胞因子的产生表明，B细胞缺陷的、肥大细胞缺陷的和CD40L缺陷的小鼠可被花生蛋白致敏。FcεRIε缺陷的小鼠可能遭受过敏反应，尽管严重性稍微逊于野生型动物。
在Mondoulet等，2012描述的通过对致敏小鼠长期饲喂花生而诱发食管胃肠病的模型中，利用本文所述的制剂的表皮免疫治疗可以减轻胃肠病变的严重性(Mondoulet等，2012)。
从这些模型得到的数据可表现出人食物变态反应的一个或多个标志，并且应该就人食物变态反应的变异性方面进行考虑。
本文提供了一种鉴定用于治疗以使花生变态反应的受试者脱敏的组合物的方法，其包括：(a)通过RP-HPLC测定花生粉的组合物中Arah1、Arah2和Arah6的浓度；(b)将所述浓度与参考标准的浓度相比较；和(c)鉴定用于使花生变态反应的受试者脱敏的组合物，其中所述样品至少包含参考标准的Arah1、Arah2和Arah6的浓度。
在一些情况下，所述方法可还包括向受试者施用本文所述的组合物，其中所述组合物至少包含参考标准的Arah1、Arah2和Arah6的浓度。
所述方法可用于比较各批次的花生粉，并且在一些情况下，将其中不包含至少Arah1、Arah2和Arah6的参考标准的量的花生粉样品从本文所述的组合物或方法的用途中排除。
尽管本文已示出和描述了优选的实施方案，但是对本领域技术人员显而易见的是，此类实施方案仅仅通过示例的方式提供。在不背离所述实施方案的情况下，本领域技术人员可进行多种变型、改变和替换。应当理解的是，在实施所述实施方案时，可采用本文描述的实施方案的各种替代方案。意欲使以下权利要求限定所述实施方案的范围，并且由此涵盖在这些权利要求及其等效物的范围内的方法和结构。

Claims (36)

1.一种制备包含特征性花生蛋白的花生粉的低剂量胶囊制剂的方法，其包括：
(a)在第一次共混中将花生粉和稀释剂混合；
(b)在第二次共混中加入约45％的稀释剂；
(c)在第三次共混中加入剩余的稀释剂；
(d)在最终共混中加入助流剂和/或润滑剂；和
(e)将共混的粉末包囊于胶囊中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)的所述稀释剂包括淀粉。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)和/或(c)的所述稀释剂包括淀粉、乳糖、微晶纤维素或磷酸二钙。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(d)的所述助流剂选自胶体二氧化硅(Cab-O-Sil)、滑石(例如，UltraTalc4000)及其组合。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述助流剂包括Cab-O-Sil。
6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(d)的所述润滑剂包括硬脂酸镁。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(d)包括加入助流剂或润滑剂。
8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(d)包括加入助流剂和润滑剂。
9.根据权利要求1所述的方法，其还包括在包囊之前对所述共混的混合物进行采样。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述剂量包含约0.5mg或约1.0mg花生蛋白。
11.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(d)还包括使所述共混的材料通过网筛。
12.一种制备胶囊制剂的方法，其包括，
(a)在第一次共混中将花生粉和稀释剂混合；
(b)排出所述共混的材料；
(c)使所述共混的材料通过网筛并在第二次共混中混合所述经筛分的材料；
(d)在第三次共混中加入助流剂和/或润滑剂；和
(e)对所述共混的粉末进行包囊。
13.根据权利要求12所述的方法，其还包括任选地在包囊之前对步骤(d)的所述共混的材料进行一次或多次取样。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述剂量包含约10mg、约100mg或约475mg花生蛋白。
15.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(a)的所述稀释剂包括淀粉、乳糖、微晶纤维素或磷酸二钙。
16.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(c)的所述网筛包括#20网筛。
17.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(d)的所述助流剂选自胶体二氧化硅(Cab-O-Sil)、滑石(例如，UltraTalc4000)及其组合。
18.根据权利要求12所述的方法，其中所述助流剂包括Cab-O-Sil。
19.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(d)的所述润滑剂包括硬脂酸镁。
20.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(d)包括加入助流剂或润滑剂。
21.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(d)包括加入助流剂和润滑剂。
22.一种制备用于本文提供的方法中的胶囊制剂的方法，其包括，
(a)将花生粉、稀释剂、助流剂和/或润滑剂混合；
(b)排出所述共混的材料；
(c)使所述共混的材料通过网筛；和
(d)对所述共混的粉末进行包囊。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述剂量包含约10mg或约100mg花生蛋白。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述花生粉包含特征性花生蛋白。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述花生蛋白包括Arah1、Arah2和Arah6。
26.根据权利要求25所述的方法，其中Arah1、Arah2和Arah6的浓度通过RP-HPLC进行表征。
27.根据权利要求26所述的方法，其中Arah1、Arah2和Arah6的浓度至少为参考标准的量。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述包囊制剂稳定至少约3、6、9、12、18、24、36或更多个月。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述包囊制剂在约2℃至约8℃，或约20℃至约30℃的温度下是稳定的。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述包囊制剂在约25℃的温度下是稳定的。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述胶囊大小为3,00或000。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述胶囊包含羟丙基甲基纤维素(HPMC)。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其还包括将所述制剂贮存在容器装置中。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述容器装置是瓶子。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述瓶子是琥珀色瓶子。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述容器装置还包括用于控制所述容器装置的水分含量的干燥剂包。
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