CN105087749B - 用于创伤弧菌临床检测的前增菌液体培养基及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及到一种用于创伤弧菌检测的前增菌液。根据创伤弧菌的生化特性和培养特点，该增菌液添加了氮源、碳源、无机盐、维生素和其他一些生长因子，而且该增菌液具有适宜创伤弧菌生长的氧化还原电位、pH值和渗透压。相比于目前临床和食品检测使用最广泛的碱性蛋白胨水，该增菌液更利于待检样本内微量创伤弧菌的生长和复苏，缩短了培养时间，提高了阳性检出率，且能有效抑制其他非目标菌(如大肠埃希菌、假单胞菌属及其他革兰阳性菌)的生长繁殖。本发明制备方便，成本低廉，增菌的能力强，适用于各级医院及检验机构的创伤弧菌检测应用。
Description
技术领域
本发明属于临床病原微生物检验技术领域，具体涉及一种用于创伤弧菌检测的前增菌液制备方法和应用。
背景技术
创伤弧菌(vibrio vulnificus，Vv)是一种重要的食源性致病菌，广泛存在于海洋、湖泊、河口水和海产品中，人类也可以通过生食海鲜或伤口接触带菌的海水感染创伤弧菌进而引发严重的全身性感染，临床症状主要表现为发热、寒颤、呕吐、低血压性休克以及特征性肢体远端血性大疱样皮损等，过程相当迅速且死亡率高。卢中秋等报告34例创伤弧菌脓毒症患者，(需要列出文献)男女比为4.7∶1，76.5％的患者并存肝病，多发病于4～11月，死亡率47.1％以上，且多数患者在48h内死于多功能脏器衰竭。在我国创伤弧菌感染多发于沿海地区，患有酒精性肝病、血色素沉着、糖尿病、铁超载及全身免疫功能不全的患者为重点易感对象。
目前检测创伤弧菌的方法主要有传统的生理生化鉴定法、聚合酶链式反应法、酶联免疫吸附分析法、免疫传感器法、显色培养法和基因芯片技术等，而绝大多数检测方法必须以增菌为前提，因此，对增菌液的研究意义重大。海产品和临床上创伤弧菌的检测主要依靠常规细菌学培养结合生化试验，经过采样、增菌、分离、纯化、鉴定等一系列步骤，必要时进行血清学试验，其中增菌是其中最为关键的一步，增菌效果的如何将直接影响到整个检测的时间以及检测的敏感性和特异性。目前最常用的增菌液为碱性蛋白胨水，其常用于嗜碱性细菌特别是弧菌的选择性增菌培养，该增菌液有一定的增菌效果，但是成分单一，特异性不强，并不能有效的抑制嗜碱性杂菌的生长，且缺少一些能促进创伤弧菌生长的碳源和生长因子，当菌量极少或细菌处于活的不可培养(VBNC)状态时，会出现假阴性的结果，从而导致创伤弧菌的漏检。因此，本发明在碱性蛋白胨水的基础上，结合创伤弧菌培养条件，优化培养基成分，建立一种高效特异的增菌方法，用于增殖样本中的创伤弧菌。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷和不足，提高临床样本的阳性检出率，缩短检测时间，本发明提供一种用于创伤弧茵检测的前增菌液。
本发明提供一种创伤弧菌检测的前增菌液组合物，该组合物包括碳源、氮源、增殖因子， 抗生素和无机盐等成分，1L所述组合物中各组分重量为：
蛋白胨：10g，
氯化钠：30g，
氯化钾：0.5～1.0g，
氯化镁2.0～3.0g，
硫代硫酸钠6～10g，
增殖因子0.1～0.3g，
多粘菌素B 400000IU，多粘菌素E100000IU，
余量为水；
其中，本发明中添加的增殖因子，是丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1016菌株经过菌体浓缩、高压破壁和冷冻负压干燥后获得的产物，主要由肽聚糖、脂磷壁酸和细胞壁蛋白质组成，其中肽聚糖作为细胞壁的主体，占细胞壁干重的50％，由N-乙酰葡萄糖胺(G)与N-乙酰胞壁酸(M)通过β-1，4糖苷糖连接而成的聚糖骨架和四肽链以及肽桥共同构成。其活性产物中所含的糖类、磷壁酸、蛋白质、氨基酸以及少量的脂类能作为创伤弧菌的增殖因子发挥增菌作用。
增殖因子即丁酸梭菌破壁产物的制法，其特征在于工艺步骤为：
(1)丁酸梭菌发酵：将丁酸梭菌WZMC016菌株种子液按重量1％接种量接入已灭菌后的含有重量蛋白胨1％、酵母提取物2％、葡萄糖2.5％、硫酸铵0.1％、碳酸氢钠0.1％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.02％、氯化钙0.002％液体培养基中，经36℃～38℃厌氧发酵后，3000rpm15-20min离心2-3次和洗脱，得丁酸梭菌菌泥；
(2)细胞破壁：将步骤(1)培养得到的丁酸梭菌菌泥按1∶5～1∶10加蒸馏水或生理盐水，使用高压细胞破碎机，在150MPa压力下破碎，得到细胞破壁产物。
(3)干燥：将步骤(2)高压后获得的细胞破壁产物于真空负压状态下冷冻干燥即得干燥的活性产物，并经过粉碎得到灰白色粉末。
增殖因子的检测及指标特征：称取步骤(3)灰白色粉末0.01g加15％正丁醇水溶液配置成10mg/L溶液，吸取0.5mL于试管中，滴加0.05％蒽酮硫酸试剂1.0mL，摇匀即成蓝绿色；表明该破壁产物含有较丰富的糖原。
本发明丁酸梭菌为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1016菌株，已于2014年10月 22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.9831。
本发明还提供一种用于创伤弧菌检测的前增菌液的制备方法，包括以下步骤：
A.称取蛋白胨10g、氯化钠30g、氯化镁2.0～3.0g、氯化钾0.5～1.0g、硫代硫酸钠6～10g、增殖因子0.2～0.4g、加蒸馏水至1L，充分溶解后过滤，115℃高压灭菌20min。
B.每100mL步骤A中获得的灭菌增菌液添加多粘菌素B40000IU，多粘菌素E10000IU，混匀后分装。
本发明根据创伤弧菌的生理生化特性，结合其培养条件，添加无机盐、增殖因子、抗生素，优化了增菌液成分，在促进创伤弧菌生长的同时，能有效的抑制其他非目标菌(如大肠埃希菌、假单胞菌属及其他革兰阳性菌)的生长繁殖。有效缩短了培养时间，提高了阳性检出率，使临床上出现漏诊的概率大为减少，为患者的及时对症治疗提供了可靠地保障。
本发明提供创伤弧菌检测的前增菌液组合物的优选组合：
蛋白胨10g
氯化钠30g
氯化镁3g
氯化钾0.8g
硫代硫酸钠10g
增殖因子0.2g
加蒸馏水至总体积为1L；
每100mL增菌液中添加多粘菌素B40000IU，多粘菌素E10000IU。
该增菌液的制备过程为：
A.称取上述重量的物质加蒸馏水至1L，充分溶解后过滤，115℃高压灭菌20min。
B.每100mL步骤A中获得的灭菌增菌液添加多粘菌素B40000IU，多粘菌素E10000IU，混匀后分装。
本发明具有如下的优点和效果：
1、本发明添加的MgCl2、KCl可以作为生长因子促进创伤弧菌的生长以及增加其对营养物质的代谢利用；Na2S2O3作为一种抑菌成分，在不影响创伤弧菌生长的同时能抑制革兰阳性细菌和大肠菌群的生长；
2、本发明添加的丁酸梭菌细胞破壁产物，可作为一种增殖因子，促进低剂量的创伤弧菌 大量增殖。
3、在含有混合菌的模拟血液样品中，36±1℃下培养8h，该增菌液在促进创伤弧菌生长的同时能更好地抑制样品中杂菌的生长，效果优于普通的碱性蛋白胨水。
4、本发明制备方便，成本低廉，增菌能力强，适用于各级医院及检验机构的创伤弧菌检测应用。
具体实施方式
实施例1丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1016菌株的分离与鉴定
本发明的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1016具有下述微生物学特征：
(1)菌落形态：呈乳白色，圆形稍凸，边缘不规则，直径1～3mm，表面略有光泽，液体培养基中有气泡产生。
(2)个体形态：为G+芽孢杆菌，菌体呈直或弯杆状，0.6～1.2×3.0～7.0μm，端圆，单个、成对、短链、偶见长丝状菌体。
(3)生理生化特征：麦芽糖(+)；甘露醇(+)；棉子糖(+)；乳糖(+)；核糖(+)；淀粉(+)。
培养最适条件：厌氧下生长良好，有氧环境中不生长。最适生长温度35～40℃；最低生长温度25～28℃；最高43～45℃；生长最适pH 6.5～7.0；pH 4.5～5.0或8.0～8.5不生长。
本发明的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1016，已于2014年10月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.9831。
实施例2
本发明增菌液由下列重量的物质组成：
蛋白胨10g
氯化钠30g
增殖因子0.2g
氯化钾：0.8g，
氯化镁2.5g，
硫代硫酸钠8g，
增殖因子0.2g，
多粘菌素B 400000IU，多粘菌素E100000IU，
加蒸馏水至总体积为1000mL；
增殖因子即丁酸梭菌破壁产物，其制法和特征在于工艺步骤为：
(1)丁酸梭菌发酵：将丁酸梭菌WZMC016菌株种子液按重量1％接种量接入已灭菌后的含有重量蛋白胨1％、酵母提取物2％、葡萄糖2.5％、硫酸铵0.1％、碳酸氢钠0.1％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.02％、氯化钙0.002％液体培养基中，经36℃～38℃厌氧发酵后，3000rpm 15-20min离心2-3次和洗脱，得丁酸梭菌菌泥；
(2)细胞破壁：将步骤(1)培养得到的丁酸梭菌菌泥按1∶5～1∶10加蒸馏水或生理盐水，使用高压细胞破碎机，在150MPa压力下破碎，得到细胞破壁产物。
(3)干燥：将步骤(2)高压后获得的细胞破壁产物于真空负压状态下冷冻干燥即得干燥的活性产物，并经过粉碎得到灰白色粉末，可在水中快速溶解，在常温常压下性质稳定。
增殖因子的检测及指标特征：称取步骤(3)灰白色粉末0.01g加15％正丁醇水溶液配置成10mg/L溶液，吸取0.5mL于试管中，滴加0.05％蒽酮硫酸试剂1.0mL，摇匀即成蓝绿色；表明该破壁产物含有较丰富的糖原。
该增菌液的制备过程为：
A.称取蛋白胨10g、氯化钠30g、氯化镁25g、氯化钾0.8g、硫代硫酸钠8g、增殖因子0.2g、加蒸馏水至1L，充分溶解后过滤，115℃高压灭菌20min。
B.每100ml步骤A中获得的灭菌增菌液添加多粘菌素B40000IU，多粘菌素E10000IU，混匀后分装。
实施例3
用于创伤弧菌快速检测的前增菌液由下列重量的物质组成：
蛋白胨10g
氯化钠30g
氯化镁3g
氯化钾0.8g
硫代硫酸钠10g
增殖因子0.2g
加蒸馏水至总体积为1L；
每100mL增菌液中添加多粘菌素B40000IU，多粘菌素E10000IU。
增殖因子的制法和特征同实施例2；
该增菌液的制备过程为：
A.称取上述重量的物质加蒸馏水至1L，充分溶解后过滤，115℃高压灭菌20min。
B.每100ml步骤A中获得的灭菌增菌液添加多粘菌素B40000IU，多粘菌素E10000IU，混匀后分装。
实施例4
用于创伤弧菌快速检测的前增菌液由下列重量的物质组成：
蛋白胨10g
氯化钠30g
氯化镁2.5g
氯化钾0.5g
硫代硫酸钠6g
增殖因子0.3g
加蒸馏水至总体积为1L
每100mL增菌液中添加多粘菌素B40000IU，多粘菌素E10000IU。
增殖因子的制法和特征同实施例2；
该增菌液的制备过程为：
A.称取上述重量的物质加蒸馏水至1L，充分溶解后过滤，115℃高压灭菌20min。
B.每100mL步骤A中获得的灭菌增菌液添加多粘菌素B40000IU，多粘菌素E10000IU，混匀后分装。
实施例5
在创伤弧菌感染的模拟血液样本中，用于创伤弧菌快速检测的前增菌液由下列重量的物质组成：
蛋白胨10g
氯化钠30g
氯化镁2.5g
氯化钾0.5g
硫代硫酸钠8g
增殖因子0.2g
加蒸馏水至总体积为1L
每100mL增菌液中添加多粘菌素B40000IU，多粘菌素E10000IU。
增殖因子的制法和特征同实施例2；
该增菌液的制备过程为：
A.称取上述重量的物质加蒸馏水至1L，充分溶解后过滤，115℃高压灭菌20min。
B.每100ml步骤A中获得的灭菌增菌液添加多粘菌素B40000IU，多粘菌素E10000IU，混匀后分装。
无菌操作下抽取大鼠的新鲜血液，直接添加至增菌液中，使血液与增菌液的比例为1∶5-1∶10，接种创伤弧菌和大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的菌悬液各1μL到改良后增菌液和碱性蛋白胨水中，37℃120rpm摇床培养8h，取出增菌液，将增菌液十倍稀释测定菌落总数，涂布于哥伦比亚血平板表面，37℃下恒温培养18h，结果显示经过改良增菌液增菌后涂布的血平板上有大量的创伤弧菌和及少量的金葡菌生长，而经过碱性蛋白胨水增菌后涂布的血平板有大量的金葡菌和少量的创伤弧菌生长，表明改良后的增菌液促进创伤弧菌增殖的同时对部分杂菌有较好的抑制效果。
实施例6
增菌液对创伤弧菌(vibrio vulnificus)S1株的应用
一、实验材料
1、增菌液：按照实施例1、2、3配制；
2、标准菌株：创伤弧菌(vibrio vulnificus)S1株；
二、将定量的创伤弧菌S1株加入到不同配方的增菌液和碱性蛋白胨水(3％APW)中，使创伤弧菌终浓度为101CFU/mL，37℃120rpm摇床培养，于不同时间点取200uL测600nm下的OD值，每组做两次平行。下表为上述实施例中组合物在增菌后不同时间段的OD值：
表1在增菌后不同时间段的OD值
在细菌增殖过程中，生长对数期的OD值与菌量呈正相关关系，由上述实验数据表明实施例2、3、4所配制的增菌液增菌的效果优于3％3％APW(碱性蛋白胨水)。
综上所述，本发明的增菌液不仅能促进创伤弧菌的大量生长，而且能有效抑制部分杂菌的生长，可适用于各级医院及检验机构的创伤弧菌检测应用。
Claims (4)
1.一种用于创伤弧菌检测的前增菌液，其特征在于，1L所述的前增菌液由下列的物质组成：蛋白胨10g、氯化钠30g、氯化镁2.0～3.0g、氯化钾0.5～1.0g、硫代硫酸钠6～10g、增殖因子0.1～0.3g、多粘菌素B 400000IU、多粘菌素E 100000IU，余量为水；
所述的增殖因子为酪酸梭菌破壁产物，其制法和特征如下：
(1)丁酸梭菌发酵：将丁酸梭菌的种子液按1％重量比的接种量接入已灭菌后的含有以重量百分比计的蛋白胨1％、酵母提取物2％、葡萄糖2.5％、硫酸铵0.1％、碳酸氢钠0.1％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.02％和氯化钙0.002％的液体培养基中，经36℃～38℃厌氧发酵后，3000rpm 15～20min离心2～3次和洗脱，得丁酸梭菌菌泥；
(2)细胞破壁：将步骤(1)培养得到的丁酸梭菌菌泥按1∶5～1∶10加蒸馏水或生理盐水，使用高压细胞破碎机，在150MPa压力下破碎，得到细胞破壁产物；
(3)干燥：将步骤(2)高压后获得的细胞破壁产物于真空负压状态下冷冻干燥即得干燥的活性产物，并经过粉碎得到灰白色粉末；
所述的丁酸梭菌为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1016菌株，保藏编号为CGMCC No.9831。
2.根据权利要求1所述的一种用于创伤弧菌检测的前增菌液，其特征在于，制备1L所述前增菌液包括如下步骤：
A.称取蛋白胨10g、氯化钠30g、氯化镁2.0～3.0g、氯化钾0.5～1.0g、硫代硫酸钠6～10g、增殖因子0.1～0.3g，加蒸馏水至1L，溶解过滤后115℃高压灭菌20min；
B.每100ml步骤A中获得的灭菌增菌液添加多粘菌素B 40000IU、多粘菌素E 10000IU，充分混匀后分装。
3.根据权利要求1所述的用于创伤弧菌检测的前增菌液，其特征在于，用于增殖标本中的创伤弧菌。
4.根据权利要求3所述的用于创伤弧菌检测的前增菌液，其特征在于，增殖因子的检测及指标特征：灰白色粉末0.01g加15％正丁醇水溶液配制成10mg/L溶液，吸取0.5mL于试管中，滴加0.05％蒽酮硫酸试剂1.0mL，摇匀即成蓝绿色，表明该破壁产物含有较丰富的糖原。
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