CN105079182A - 一种栀子提取物及其增强免疫的医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种栀子提取物及其增强免疫的医药用途，提取物制备方法包括：(a)以重量计，每100份药材包含干燥的栀子成熟果实75～85份和干燥的肉豆蔻成熟果实15～25份，混合粉碎，用95％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味；(b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(c)正丁醇萃取物用大孔树脂富集，先用10％乙醇冲洗10个柱体积除去多糖，再用70％乙醇洗脱8个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥。栀子提取物具有提高小鼠免疫功能的作用，可以开发成增强免疫的药物。

Description

一种栀子提取物及其增强免疫的医药用途

技术领域

本发明涉及中药提取物领域，具体涉及一种栀子提取物及含有该提取物的药物制剂，该提取物可以应用于制备增强免疫的药物。

背景技术

栀子(GardeniajasminoidesEllis.)是茜草科(Rubiaceae)栀子属常绿灌木，又名山栀子、黄栀子、黄枝子等，主产于浙江、福建、江西、湖南、广东。栀子的干燥成熟果实入药称栀子，中国历版药典和本草均有记载，为常用中药。其性寒味苦，无毒，主归心、肺、三焦经，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒等功效。临床广泛用于热病心烦、黄疸尿赤、血淋涩痛、血热吐衄、目赤肿痛、火毒疮疡等证；其根功能清热、凉血、解毒，民间主要用于黄疸性肝炎、肾炎水肿、感冒高热、出血吐血、跌打损伤、疮疡肿毒等病症的治疗；叶可消肿止痛，治疗跌打损伤；花可清肺热凉血降脂，治疗肺热咳嗽、鼻衄。

栀子属植物化学成分的研究始于20世纪20年代，具有特征性的化合物主要包括环烯醚萜类、有机酸类和黄酮类。栀子中含有大量的环烯醚萜类化合物，有4种主要类型：环烯醚萜烷类、环烯醚萜苷类、环烯醚萜二缩醛酯类和裂环烯醚萜苷类。环烯醚萜基本骨架经环氧化、羟基化及由莽草酸途径得到的芳香酸酯化，导致了该类化合物的多样性，同时也导致其药理活性的多样性。

桅子是常用中药，备受国内外学者的重视，研究工作较多。现代药理实验表明，栀子中的环烯醚萜类成分有明显的抗炎镇痛、保肝利胆、抗血栓等活性；有机酸类中的藏红花苷类成分具抗炎、抗血栓、调血脂、抗心肌缺血等活性。随着科学技术的不断进步，对其研究也有了许多创新和突破，尤其对其中的环烯醚萜类成分的研究，新的化合物和药理作用不断被发现，药理作用机制也得到了深入的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种栀子提取物，其制备方法和液相分析方法，含有该提取物的药物制剂及利用该提取物制备增强免疫的药物的用途。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

一种栀子提取物，该提取物由以下方法制备：(a)以重量计，每100份药材包含干燥的栀子成熟果实75～85份和干燥的肉豆蔻成熟果实15～25份，混合粉碎，用乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味；(b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(c)正丁醇萃取物用大孔树脂富集，先用5～15％乙醇冲洗8～12个柱体积除去多糖，再用65～75％乙醇洗脱7～9个柱体积，收集65～75％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥。

进一步地，步骤(a)中所述用乙醇热回流提取所采用的乙醇浓度为90～95％。

进一步地，步骤(a)中所述用乙醇热回流提取所采用的乙醇浓度为95％。

进一步地，步骤(c)中所述大孔树脂为AB-8型大孔树脂。

进一步地，步骤(c)为：正丁醇萃取物用AB-8型大孔树脂富集，先用10％乙醇冲洗10个柱体积除去多糖，再用70％乙醇洗脱8个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥。

为了能够通过建立HPLC指纹图谱的方法控制不同批次制备的提取物的批间差异，所述提取物的液相分析方法为：

色谱柱：AgilentTCC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：A为乙腈，B为0.1％甲酸溶液(三乙胺调节pH值至6.0)；

梯度洗脱程序：

0～5min，A35％；5～40min，A35％→70％；40～57min，A70％→95％；57～65min，A95％；

流动相流速：1.0mL·min^-1；检测波长：240nm；柱温：30℃；进样量10μL。

药物制剂，含有治疗有效量的所述提取物和药学上可接受的载体。

所述的提取物在制备增强免疫的药物中的应用。

所述的药物制剂在制备增强免疫的药物中的应用。

本发明提取物用作药物时，可以直接使用，或者以药物制剂的形式使用。

所述药物制剂含有治疗有效量的本发明栀子提取物，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物制剂以单位体重服用量的形式使用。本发明提取物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。

本发明的优点：本发明通过对干燥的栀子成熟果实和肉豆蔻成熟果实进行提取、除杂、富集处理，能得到具有增强免疫的提取物；本发明提供的液相分析方法可以用于建立该提取物的指纹图谱，用于控制不同批次制备的提取物的批间差异。

附图说明

图1为栀子提取物HPLC液相图谱。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

实施例1：栀子提取物①制备(80份栀子，20份肉豆蔻)

药材来源：栀子和肉豆蔻购自安徽亳州中药材市场。

主要试剂：食品级乙醇购自上海凌峰化学试剂有限公司；AB-8型大孔树脂购自天津波鸿树脂有限公司；乙腈为HPLC级，购于TEDIA；甲酸为HPLC级，购于TEDIA；色谱用纯净水为哇哈哈纯净水。

制备方法：将8.0kg干燥栀子成熟果实和2.0kg干燥肉豆蔻成熟果实混合粉碎，用95％乙醇热回流提取3次，每次提取2小时，每次用95％乙醇25L，合并提取液，浓缩至无醇味(4L)；浓缩液依次用石油醚(4L×3次)、乙酸乙酯(4L×3次)和水饱和的正丁醇(4L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；正丁醇萃取物用AB-8大孔树脂富集，先用10％乙醇冲洗10个柱体积除去多糖，再用70％乙醇洗脱8个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥(约225g)。

实施例2：栀子提取物②制备(75份栀子，25份肉豆蔻)

制备方法：将7.5kg干燥栀子成熟果实和2.5kg干燥肉豆蔻成熟果实混合粉碎，用95％乙醇热回流提取3次，每次提取2小时，每次用95％乙醇25L，合并提取液，浓缩至无醇味(4L)；浓缩液依次用石油醚(4L×3次)、乙酸乙酯(4L×3次)和水饱和的正丁醇(4L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；正丁醇萃取物用AB-8大孔树脂富集，先用10％乙醇冲洗10个柱体积除去多糖，再用70％乙醇洗脱8个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥(约225g)。

实施例3：栀子提取物③制备(85份栀子，15份肉豆蔻)

制备方法：将8.5kg干燥栀子成熟果实和1.5kg干燥肉豆蔻成熟果实混合粉碎，用95％乙醇热回流提取3次，每次提取2小时，每次用95％乙醇25L，合并提取液，浓缩至无醇味(4L)；浓缩液依次用石油醚(4L×3次)、乙酸乙酯(4L×3次)和水饱和的正丁醇(4L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；正丁醇萃取物用AB-8大孔树脂富集，先用10％乙醇冲洗10个柱体积除去多糖，再用70％乙醇洗脱8个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥(约225g)。

实施例4：栀子提取物④制备(90份栀子，10份肉豆蔻)

制备方法：将9.0kg干燥栀子成熟果实和1.0kg干燥肉豆蔻成熟果实混合粉碎，用95％乙醇热回流提取3次，每次提取2小时，每次用95％乙醇25L，合并提取液，浓缩至无醇味(4L)；浓缩液依次用石油醚(4L×3次)、乙酸乙酯(4L×3次)和水饱和的正丁醇(4L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；正丁醇萃取物用AB-8大孔树脂富集，先用10％乙醇冲洗10个柱体积除去多糖，再用70％乙醇洗脱8个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥(约225g)。

实施例5：栀子提取物⑤制备(70份栀子，30份肉豆蔻)

制备方法：将7.0kg干燥栀子成熟果实和3.0kg干燥肉豆蔻成熟果实混合粉碎，用95％乙醇热回流提取3次，每次提取2小时，每次用95％乙醇25L，合并提取液，浓缩至无醇味(4L)；浓缩液依次用石油醚(4L×3次)、乙酸乙酯(4L×3次)和水饱和的正丁醇(4L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；正丁醇萃取物用AB-8大孔树脂富集，先用10％乙醇冲洗10个柱体积除去多糖，再用70％乙醇洗脱8个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥(约225g)。

实施例6：液相色谱分析

供试品溶液配制：取实施例1方法制得的提取物5mg至50mL棕色容量瓶中，加30mL10％乙腈水溶液超声溶解，冷却至室温后，继续加10％乙腈水溶液定容。分析方法如下：

高效液相色谱仪：Agilent1260，二元泵；

色谱柱：AgilentTCC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：A为乙腈，B为0.1％甲酸溶液(三乙胺调节pH值至6.0)；

梯度洗脱程序：

0～5min，A35％；5～40min，A35％→70％；40～57min，A70％→95％；57～65min，A95％；

流动相流速：1.0mL·min^-1；检测波长：240nm；柱温：30℃；进样量10μL。

用制备的10批次的栀子提取物进行分析，进行色谱峰匹配，结果1～10号峰在10批样品色谱图中均出现。因此标定10个峰为共有色谱峰，据此建立该提取物的HPLC质量控制图谱，结果见图1。该10批次的栀子提取物药理活性相似。

实施例7：提取物药理试验

一、材料与方法

1.1试验药物：栀子提取物①～⑤分别按照实施例1～5制备，用生理盐水配成混悬液，4℃保存。阳性药甘露聚糖肽，片剂，成都利尔药业有限公司，用研钵研成粉末，生理盐水配制成1mg/mL的混悬液，4℃保存。环磷酰胺(CTX)，白色冻干粉剂，山西泰盛制药有限公司，用生理盐水溶解，配制成4mg/mL的溶液，4℃避光保存。

1.2动物：昆明种小鼠，雌雄各半，一级，体重20±2g，由四川大学实验动物中心提供。

1.3试剂：印度墨汁(CHROMA-GESELLSCHAFTSCHMDGMBH&CO.出品)，2,4-二硝基氯苯(DNCB，上海三爱思试剂有限公司)。

1.4方法

1.4.1栀子提取物对CTX所致免疫低下小鼠模型巨噬细胞吞噬能力的影响

将216只小鼠按性别体重随机分为18组(空白对照组、模型组、阳性药组，栀子提取物①～⑤低中高剂量组)，除空白对照组外，其余各组小鼠均腹腔注射CTX40mg/kg连续4天，同时灌胃给药10天。末次给药1h后，小鼠尾静脉注射印度墨汁(1：4)生理盐水溶液0.5mL/只，分别于注射后2min和5min眼眶取血20μL，加入2mL0.1％Na₂CO₃溶液中，在590nm比色。将动物处死后，取肝、脾称重，计算吞噬指数K和校正吞噬指数α。

1.4.2栀子提取物对小鼠迟发型超敏反应(DTH)的影响

将170只小鼠按性别体重随机分为17组，腹部去毛3cm×3cm，每鼠涂50μL1％DNCB(1:1丙酮麻油溶解)致敏，并于第二日强化致敏一次，阴性组除外。灌胃给药8天后，将10μL1％DNCB涂于小鼠右耳两面，24h后处死，剪下左右耳分别打孔取直径8mm耳片，称重。以左右耳片重量差为肿胀度比较组间差异。

1.4.3栀子提取物对CTX所致免疫低下模型小鼠血清溶血素含量的影响

180只小鼠按性别体重随机分为18组，除空白对照组外，其余各组小鼠均腹腔注射CTX20mg/kg连续5天，同时各给药组灌胃给药(0.2mL/10g)10天。所有组均在给药第三天腹腔注射5％绵羊红细胞0.2mL/只致敏。末次给药1h后，眼眶取血，离心分离血清，用生理盐水稀释100倍。取稀释血清1mL，与5％绵羊红细胞0.5mL、10％补体(豚鼠血清)0.5mL混匀，置37℃水浴箱中30min，0℃终止反应，离心取上清液于540nm处比色。

1.4.4栀子提取物对CTX所致小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

180只小鼠按性别体重随机分为18组，每组10只，除空白对照组外，其余各组小鼠均腹腔注射CTX20mg/kg(0.1mL/10g)连续5天，同时各给药组灌胃给药10天。末次给药1h后，各鼠腹腔注射5％绵羊红细胞生理盐水溶液0.4mL，8h后处死，剖腹露腹膜，注入NS2mL，轻揉腹部1min，吸取腹腔液涂于载玻片上，37℃孵育30min，取出以生理盐水冲洗玻片上未被吞噬的SRBC及其他细胞，吹干，甲醇固定5min，Giemsa染色20min。水洗晾干后，在显微镜下观察200个巨噬细胞，计算吞噬百分率和吞噬指数。

二、结果

2.1栀子提取物对CTX所致免疫低下模型小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响结果见表1(注：与模型组相比*P<0.05，**P<0.01)。由实验结果可知，免疫低下模型组与空白对照组相比，其吞噬指数和校正吞噬指数显著性的低于空白对照组；栀子提取物①～③中、高剂量组以及阳性组与模型组相比，吞噬指数和校正吞噬指数显著性的高于模型组；栀子提取物④～⑤各剂量组与模型组相比无显著差异。结果：栀子提取物①～③中、高剂量对CTX所致免疫低下小鼠模型具有免疫增强的作用。

表1栀子提取物对CTX所致小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响(x±s)

组别	剂量/(mg/kg)	鼠数(只)	K值	α值
					正常对照组	-	12	0.0238±0.0047**	4.11±0.42**
模型组	-	12	0.0113±0.0022	3.06±0.296
					甘露聚糖肽	20	12	0.0324±0.0078**	4.60±0.57**
提取物①低剂量组	250	12	0.0129±0.003	3.37±0.58
					提取物①中剂量组	500	12	0.0230±0.0075**	3.74±0.76*
提取物①高剂量组	1000	12	0.0262±0.0134**	3.71±0.75*
					提取物②低剂量组	250	12	0.0127±0.0028	3.34±0.631
提取物②中剂量组	500	12	0.0229±0.0083**	3.71±0.82*
					提取物②高剂量组	1000	12	0.0258±0.0146**	3.72±0.723*
提取物③低剂量组	250	12	0.0129±0.002	3.35±0.67
					提取物③中剂量组	500	12	0.0225±0.0087**	3.72±0.634*
提取物③高剂量组	1000	12	0.0260±0.0141**	3.71±0.771*
					提取物④低剂量组	20	12	0.0115±0.0025	3.15±0.49
提取物④中剂量组	250	12	0.0118±0.0063	3.33±0.52
					提取物④高剂量组	500	12	0.0120±0.0124	3.35±0.576
提取物⑤低剂量组	20	12	0.0113±0.0031	3.16±0.412
					提取物⑤中剂量组	250	12	0.0116±0.0071	3.31±0.537
提取物⑤高剂量组	500	12	0.0119±0.0132	3.36±0.601

2.2栀子提取物对CTX所致小鼠免疫低下模型的血清溶血素含量的影响结果见表2(注：与模型组相比*P<0.05，**P<0.01)。由结果可知，模型组血清溶血素含量非常显著低于空白组；栀子提取物①～③中高剂量组的血清溶血素含量显著高于模型组；栀子提取物④～⑤各剂量组与模型组无显著差异。

表2栀子提取物对CTX所致小鼠血清溶血素含量的影响(x±s)

组别	剂量/(mg/kg)	鼠数(只)	OD值
				正常对照组	-	10	2.71±0.87**
模型组	-	10	0.80±0.52
				甘露聚糖肽	20	10	2.03±1.15**

提取物①低剂量组	250	10	1.25±0.91
				提取物①中剂量组	500	10	1.95±1.33*
提取物①高剂量组	1000	10	2.13±1.11**
				提取物②低剂量组	250	10	1.21±0.93
提取物②中剂量组	500	10	1.94±1.29*
				提取物②高剂量组	1000	10	2.10±1.13**
提取物③低剂量组	250	10	1.24±0.86
				提取物③中剂量组	500	10	1.92±1.37*
提取物③高剂量组	1000	10	2.11±1.08**
				提取物④低剂量组	250	10	0.92±0.75
提取物④中剂量组	500	10	1.05±0.93
				提取物④高剂量组	1000	10	1.09±1.01
提取物⑤低剂量组	250	10	0.89±0.79
				提取物⑤中剂量组	500	10	1.03±0.99
提取物⑤高剂量组	1000	10	1.10±1.03

2.3栀子提取物对CTX所致小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响结果见表3(与模型组相比*P<0.05，**P<0.01)。由结果可知，模型组腹腔巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数非常显著低于空白组；阳性药及栀子提取物①～③各剂量组腹腔巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数均显著性的高于模型组；栀子提取物④～⑤各剂量组与模型组相比无显著差异。

表3栀子提取物对CTX所致小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(x±s)

组别	剂量/(mg/kg)	鼠数(只)	吞噬百分率(％)	吞噬指数
					正常对照组	NS	10	0.51±0.09**	0.73±0.20*
模型组	NS	10	0.35±0.12	0.48±0.23
					甘露聚糖肽	20	10	0.60±0.13**	0.88±0.22**
提取物①低剂量组	250	10	0.60±0.17**	0.85±0.29**
					提取物①中剂量组	500	10	0.61±0.23**	0.87±0.39*
提取物①高剂量组	1000	10	0.74±0.19**	1.05±0.33**
					提取物②低剂量组	250	10	0.58±0.19**	0.81±0.33**
提取物②中剂量组	500	10	0.60±0.25**	0.86±0.37*
					提取物②高剂量组	1000	10	0.72±0.21**	1.01±0.35**
提取物③低剂量组	250	10	0.57±0.13**	0.83±0.27**

提取物③中剂量组	500	10	0.59±0.21**	0.85±0.35*
					提取物③高剂量组	1000	10	0.71±0.18**	1.03±0.30**
提取物④低剂量组	20	10	0.38±0.09	0.52±0.25
					提取物④中剂量组	250	10	0.39±0.11	0.55±0.27
提取物④高剂量组	500	10	0.42±0.08	0.59±0.21
					提取物⑤低剂量组	20	10	0.37±0.10	0.50±0.23
提取物⑤中剂量组	250	10	0.38±0.13	0.53±0.29
					提取物⑤高剂量组	500	10	0.43±0.10	0.57±0.25

综上可见，栀子提取物具有提高小鼠免疫功能的作用，但是这种作用与栀子提取物中肉豆蔻的含量有重要关系，肉豆蔻的含量对栀子提取物的活性起到至关重要的作用。

实施例8：片剂的制备

按实施例1方法制得提取物，按其与赋形剂重量比为1:10的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例9：口服液的制备

按实施例1方法先制得提取物，按常规口服液制法制成口服液。

实施例10：胶囊剂或颗粒剂的制备

按实施例1方法先制得提取物，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。

实施例11：注射液的制备

按实施例1方法制得提取物，加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例12：无菌粉针的制备

按实施例1方法先制得提取物，溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

Claims (9)

1.一种栀子提取物，其特征在于所述提取物由以下方法制备：(a)以重量计，每100份药材包含干燥的栀子成熟果实75～85份和干燥的肉豆蔻成熟果实15～25份，混合粉碎，用乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味；(b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(c)正丁醇萃取物用大孔树脂富集，先用5～15％乙醇冲洗8～12个柱体积除去多糖，再用65～75％乙醇洗脱7～9个柱体积，收集65～75％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥。

2.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：步骤(a)中所述用乙醇热回流提取所采用的乙醇浓度为90～95％。

3.根据权利要求2所述的提取物，其特征在于：步骤(a)中所述用乙醇热回流提取所采用的乙醇浓度为95％。

4.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：步骤(c)中所述大孔树脂为AB-8型大孔树脂。

5.根据权利要求4所述的提取物，其特征在于步骤(c)为：正丁醇萃取物用AB-8型大孔树脂富集，先用10％乙醇冲洗10个柱体积除去多糖，再用70％乙醇洗脱8个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥。

6.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：所述提取物的液相分析方法为：

色谱柱：AgilentTCC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：A为乙腈，B为0.1％甲酸溶液(三乙胺调节pH值至6.0)；

梯度洗脱程序：0～5min，A35％；5～40min，A35％→70％；40～57min，A70％→95％；57～65min，A95％；

流动相流速：1.0mL·min^-1；

检测波长：240nm；柱温：30℃；

进样量10μL。

7.药物制剂，其特征在于：含有治疗有效量的权利要求1所述的提取物和药学上可接受的载体。

8.权利要求1所述的提取物在制备增强免疫的药物中的应用。

9.权利要求7所述的药物制剂在制备增强免疫的药物中的应用。