CN105074010A - 甲基化dna的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种迅速且简便的甲基化DNA的检测方法。一种甲基化DNA的检测方法,其特征在于,包括以下工序:(1)用亚硫酸氢盐处理样品DNA的工序;(2)将该用亚硫酸氢盐处理了的样品DNA通过PCR进行扩增的工序;以及(3)将得到的PCR扩增产物施加于离子交换色谱的工序。
Description
技术领域
本发明涉及一种甲基化DNA的检测方法。更详细而言,本发明涉及一种将用亚硫酸氢盐处理了的DNA进行PCR扩增,将其产物通过离子交换色谱进行分析的迅速且简便的甲基化DNA的检测方法。
背景技术
近年,已认识到表观遗传学参与各种生命现象,与其解析相关的研究正在积极进行。尤其是,已阐明DNA的异常甲基化深度参与癌症化而受到关注。作为癌细胞中的特征性的表观遗传异常,已知部分基因启动子区域中的CpG岛的异常DNA甲基化。CpG岛是介由磷酸二酯键(p)的胞嘧啶(C)-鸟嘌呤(G)的2碱基序列高频出现的区域,其多存在于基因上游的启动子区域。CpG岛的异常DNA甲基化通过癌抑制基因的失活等来参与癌变。CDKN2A、CDH1、MLH1、RB、BRCA1、TSLC1、RUNX3等各种癌抑制基因由于启动子区域存在的CpG岛的异常甲基化导致失活从而诱发癌化。DNA被甲基化时,由于该DNA甲基化在细胞分裂时被复制,由子细胞继承,因此癌抑制基因因异常甲基化而失活时,癌抑制基因失活的状态会持续。
作为已经确立的甲基化DNA的解析方法,有利用亚硫酸氢盐(重亚硫酸盐、bisulfite)反应的方法。该方法是甲基化DNA解析中最通用的方法。用亚硫酸氢盐处理单链DNA时,胞嘧啶经过磺化、水解脱氨化、脱磺化,被变换为尿嘧啶。另一方面,被甲基化的胞嘧啶,由于最初发生的磺化的反应速度极慢,因此在实际进行的亚硫酸氢盐处理的反应时间中仍保持为甲基化胞嘧啶。因此,使用亚硫酸氢盐处理了的DNA进行PCR(PolymeraseChainReaction)时,甲基化胞嘧啶仍为胞嘧啶,但是非甲基化胞嘧啶由尿嘧啶被置换为胸腺嘧啶而被扩增。利用该PCR扩增产物的序列中产生的胞嘧啶和胸腺嘧啶的碱基差异,解析甲基化状态。将其作为基本原理而通用的方法是专利文献1、非专利文献1记载的Methylation-SpecificPCR(MSP)法和非专利文献2、3记载的CombinedBisulfiteRestrictionAnalysis(COBRA)法。
MSP法是在DNA的亚硫酸氢盐处理后,依次进行使用了甲基化序列特异引物和非甲基化序列特异引物的PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳,通过两个引物所致的扩增产物的有无来判定对象区域的DNA甲基化状态的方法。COBRA法是在DNA的亚硫酸氢盐处理后,依次进行使用甲基化DNA和非甲基化DNA共同的引物的PCR扩增、使用识别甲基化DNA和非甲基化DNA中序列不同的位置的限制性内切酶的处理、琼脂糖凝胶电泳,通过限制性内切酶处理片段的有无来判定对象区域的DNA甲基化状态的方法。两种方法从在没有特别的装置的情况下能够进行甲基化DNA的定量解析的方面来看均是目前广泛使用的方法,但是存在在解析中使用电泳法这点上需要花费劳动和时间的课题。
另一方面,在生物化学、医学等领域中的核酸、蛋白质、多糖类等生物高分子的分离分析中,作为简便且短时间能够精度良好地检测的方法,通用的是离子交换色谱。离子交换色谱是利用柱填充剂的离子交换基团和测定对象物质中的离子性基团之间发生的静电相互作用而分离测定对象物质的方法,包括利用阴离子交换的离子交换色谱和利用阳离子交换的离子交换色谱。阴离子交换色谱使用具有阳离子性官能团作为离子交换基团的柱填充剂,能够分离阴离子性物质。此外,阳离子交换色谱使用具有阴离子性官能团作为离子交换基团的柱填充剂,能够分离阳离子性物质。
使用离子交换色谱分离核酸的PCR扩增产物时,通常使用利用核酸分子中含有的磷酸的负电荷进行分离的阴离子交换色谱。作为阴离子交换色谱中的柱填充剂的阳离子性官能团,包括二乙基氨基乙基这样的弱阳离子性基团、季铵基这样的强阳离子性基团。填充有含有这些阳离子性的官能团作为离子交换基团的柱填充剂的色谱柱已经市售,在多个研究领域中使用。
此外本发明人报告了作为离子交换色谱用柱填充剂,开发了含有强阳离子性基团和弱阳离子性基团这两种基团作为柱填充剂的阳离子性官能团的柱填充剂,通过使用了填充有该填充剂的柱的离子交换色谱,分离分析了20mer的非甲基化合成寡聚核苷酸间的单碱基的差异(专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:美国专利第5786146号公报
专利文献2:国际公开公报第2012/108516号小册子
非专利文献
非专利文献1:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93,9821-9826(1996)
非专利文献2:NucleicAcidsRes.,24,5058-5059(1996)
非专利文献3:NucleicAcidsRes.,25,2532-2534(1997)
发明内容
如上所述,基于利用了亚硫酸氢盐反应的DNA甲基化解析进行癌风险诊断时,为了更早期或更正确的诊断,要求精度良好地检测由亚硫酸氢盐反应产生的DNA碱基序列的差异。本发明的课题在于提供一种消除利用电泳的解析所需要的劳动和时间的、迅速且简便的甲基化DNA的检测方法。特别是,本发明的课题在于提供一种检测信号的分离性能良好,能够以高精度且高灵敏度检测DNA甲基化的方法。
本发明人等发现将用亚硫酸氢盐处理的DNA通过PCR进行扩增,将得到的PCR扩增产物通过离子交换色谱进行分离,从而能够迅速且简便地检测甲基化DNA。本发明人等然后进一步对离子交换色谱的分析条件进行深入研究,最终令人惊讶地发现甲基化DNA的检测信号的峰分离依赖于该离子交换色谱的柱温度而飞跃式提高,进而完成本发明。
本发明具有以下构成。
[1]一种甲基化DNA的检测方法,该检测方法包括以下工序(1)、(2)和(3):
(1)用亚硫酸氢盐处理样品DNA的工序;
(2)将该用亚硫酸氢盐处理了的样品DNA通过PCR进行扩增的工序;以及
(3)将得到的PCR扩增产物施加于离子交换色谱的工序。
[2]一种甲基化DNA的检测方法,该检测方法包括以下工序(1)、(2)和(3’):
(1)用亚硫酸氢盐处理样品DNA的工序;
(2)将该用亚硫酸氢盐处理了的样品DNA通过PCR进行扩增的工序;以及
(3’)在45℃以上且小于90℃的柱温度下,将得到的PCR扩增产物施加于离子交换色谱的工序。
[3]根据[1]或[2]记载的方法,其中,上述离子交换色谱是阴离子交换色谱。
[4]根据[1]~[3]中任1项记载的方法,其中,上述离子交换色谱中使用的柱填充剂含有在表面具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团这两种基团的基材粒子。
[5]根据[1]~[4]中任1项记载的方法,其中,上述离子交换色谱中,上述PCR扩增产物的洗脱所使用的洗脱液含有反离液离子。
[6]根据[1]~[5]中任1项记载的方法,其中,上述反离液离子是硫酸根离子和铵根离子中的任一种或两种。
[7]根据[1]~[6]中任1项记载的方法,其中,进一步包括以下工序:将用亚硫酸氢盐处理上述样品DNA而得的产物的PCR扩增产物的由离子交换色谱得到的检测信号,与用亚硫酸氢盐处理与上述样品DNA的碱基序列相同但没有甲基化的DNA而得的产物的PCR扩增产物、或用亚硫酸氢盐处理与上述样品DNA的碱基序列相同且甲基化的比例已知的DNA而得的产物的PCR扩增产物的由离子交换色谱得到的检测信号进行比较。
[8]根据[7]记载的方法,其中,进一步包括以下工序:基于上述比较的工序的结果,测定上述样品DNA中的甲基化DNA有无存在、甲基化率或存在比率。
[9]根据[1]~[6]中任1项记载的方法,其中,进一步包括以下工序:从用亚硫酸氢盐处理上述样品DNA而得的产物的PCR扩增产物的由离子交换色谱得到的检测信号中,减去用亚硫酸氢盐处理与上述样品DNA的碱基序列相同但没有甲基化的DNA而得的产物的PCR扩增产物的由离子交换色谱得到的检测信号,得到差值数据。
[10]根据[9]记载的方法,其中,进一步包括以下工序:基于上述差值数据,测定上述样品DNA中的甲基化DNA有无存在、甲基化率或存在比率。
[11]一种从样品DNA的信号提取甲基化DNA的信号的方法,包括以下工序(1)~(6):
(1)用亚硫酸氢盐处理样品DNA的工序;
(2)将该用亚硫酸氢盐处理了的样品DNA通过PCR进行扩增的工序;
(3)将工序(2)中得到的PCR扩增产物施加于离子交换色谱的工序;
(4)用亚硫酸氢盐处理与该样品DNA的碱基序列相同但没有甲基化的DNA并进行PCR扩增的工序;
(5)将工序(4)中得到的PCR扩增产物施加于离子交换色谱的工序;以及
(6)从工序(3)中得到的色谱检测信号中减去工序(5)中得到的色谱检测信号而得到差值数据的工序。
[12]离子交换色谱用柱在甲基化DNA检测中的使用,其中,所述离子交换色谱用柱填充有柱填充剂,所述柱填充剂含有在表面具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团这两种基团的基材粒子。
[13]离子交换色谱用洗脱液在甲基化DNA检测中的使用,其中,所述离子交换色谱用洗脱液含有反离液离子。
根据本发明,提供一种利用离子交换色谱的甲基化DNA的检测方法。本发明的方法中进行的离子交换色谱,甲基化DNA和非甲基化DNA的检测信号的峰分离优异,能够精度良好地检测甲基化DNA。因此,根据本发明,能够提供一种不需要电泳法这样的劳动和时间的、迅速且简便且高精度的甲基化DNA的检测方法。本发明的甲基化DNA的检测方法对癌风险检查等临床检查是有用的。
附图说明
图1是使用了参考例1中得到的阴离子交换柱的、来自CDKN2A基因启动子的甲基化DNA和非甲基化DNA的PCR扩增产物(136bp)的色谱图。
图2是使用了参考例1中得到的阴离子交换柱的、来自CDKN2A基因启动子的甲基化DNA和非甲基化DNA的PCR扩增产物(77bp)的色谱图。
图3是使用了参考例1中得到的阴离子交换柱的、来自MTAP启动子基因的甲基化DNA和非甲基化DNA的PCR扩增产物(202bp)的色谱图。
图4-1是用参考例1中得到的阴离子交换柱在柱温度40℃~85℃进行分析时的、利用亚硫酸氢盐对来自CDKN2A基因启动子的甲基化DNA和非甲基化DNA处理后的产物的PCR扩增产物(136bp)的色谱图。
图4-2是用参考例1中得到的阴离子交换柱在柱温度40℃~85℃进行分析时的、利用亚硫酸氢盐对来自CDKN2A基因启动子的甲基化DNA和非甲基化DNA处理后的产物的PCR扩增产物(136bp)的色谱图。
图5-1是用参考例1中得到的阴离子交换柱在柱温度40℃~85℃进行分析时的、利用亚硫酸氢盐对来自CDKN2A基因启动子的甲基化DNA和非甲基化DNA处理后的产物的PCR扩增产物(77bp)的色谱图。
图5-2是用参考例1中得到的阴离子交换柱在柱温度40℃~85℃进行分析时的、利用亚硫酸氢盐对来自CDKN2A基因启动子的甲基化DNA和非甲基化DNA处理后的产物的PCR扩增产物(77bp)的色谱图。
图6是PCR扩增产物的峰高度比率相对于样品DNA中的100%甲基化DNA含有率的绘图。
图7-1是DNA甲基化率所致的色谱洗脱时间的变动。A:DNA甲基化率不同的DNA(0%、25%、50%、75%、100%)的色谱图B:DNA甲基化位置不同的50%甲基化DNA(随机、5’端附近、3’端附近、中央)的色谱图。
图7-2是DNA甲基化率所致的色谱洗脱时间的变动。C:洗脱时间相对于DNA甲基化率的绘图。
具体实施方式
本发明中,作为成为甲基化DNA检测的对象的样品DNA,可举出包括动物、植物、微生物在内的所有生物的DNA,优选为动物,更优选为哺乳动物的DNA。作为哺乳动物,可举出人、猴、小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、羊、山羊、马、牛、猪、狗、猫等,但是不局限于此。样品DNA,可以从来自于含有DNA的生物的试样进行提取、分离或精制得到。
作为上述来自于含有样品DNA的生物的试样,可举出从上述生物采取的各种细胞,例如,组织细胞、血细胞、或尿、粪便、唾液、其他体液或分泌液中存在的细胞、以及来自于上述生物的培养细胞株等。另外,在来自于该生物的试样中,也可以含有各种疾病(实体癌、白血病等)的特征性细胞。
作为从上述试样提取、分离或精制样品DNA的方法,没有特别限制,可以适当选择使用公知的方法。作为制备样品DNA的公知的方法,可举出酚氯仿法或使用市售的DNA提取试剂盒、例如后述的QIAampDNAMinikit(Qiagen公司制)、CleanColumns(NexTec公司制)、AquaPure(Bio-Rad公司制)、ZRPlant/SeedDNAKit(ZymoResearch公司制)、prepGEM(ZyGEM公司制)、BuccalQuick(TrimGen公司制)的DNA提取方法等。
本发明的甲基化DNA的检测方法中,用亚硫酸氢盐处理从上述试样提取的样品DNA。作为DNA的亚硫酸氢盐处理的方法,没有特别限制,可以适当选择使用公知的方法。作为用于亚硫酸氢盐处理的公知的方法,例如,可举出使用后述的EpiTectBisulfiteKit(48)(Qiagen公司制)、MethylEasy(HumanGeneticSignaturesPty公司制)、Cells-to-CpGBisulfiteConversionKit(AppliedBiosystems公司制)、CpGenomeTurboBisulfiteModificationKit(MERCKMILLIPORE公司制)等市售试剂盒的方法。
接下来,将用亚硫酸氢盐处理了的样品DNA通过PCR进行扩增。作为PCR扩增的方法,没有特别限制,可以根据扩增对象的DNA序列、长度、量等适当选择使用公知的方法。PCR扩增产物的链长可以在考虑PCR的扩增时间的缩短以及离子交换色谱中的分析时间的缩短、分离性能的维持等要素的基础上进行适当选择。例如,使用CpG岛多的样品DNA时的PCR扩增产物的链长,优选为1000bp以下,更优选为700bp以下,进一步优选为500bp以下。另一方面,使用CpG岛少的样品DNA时的PCR扩增产物的链长,下限为使用避免PCR中非特异杂交的15mer附近的引物时的PCR扩增产物的链长即30~40bp。另一方面,优选以CpG岛的含有率变得丰富的方式设计引物。例如,CpG位点的胞嘧啶,相对于PCR扩增产物的链长优选含有2%以上,更优选含有5%以上。
将DNA进行亚硫酸氢盐处理时,该DNA中的非甲基化胞嘧啶被变换为尿嘧啶,但甲基化胞嘧啶仍为胞嘧啶。将亚硫酸氢盐处理了的DNA进行PCR扩增时,来自非甲基化胞嘧啶的尿嘧啶由于进一步被置换为胸腺嘧啶,因此在甲基化DNA和非甲基化DNA之间,胞嘧啶和胸腺嘧啶的存在比率产生差异。本发明的甲基化DNA检测方法中,利用该碱基的存在比率的差异,解析DNA的甲基化状态。
接下来,将得到的PCR扩增产物施加于离子交换色谱。本发明中进行的离子交换色谱优选为阴离子交换色谱。作为本发明中进行的离子交换色谱中使用的色谱柱的填充剂,是表面具有强阳离子性基团的基材粒子即可,没有特别限制,优选为在专利文献2记载的填充剂表面具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团这两种基团的基材粒子。
本说明书中,上述强阳离子性基团是指在pH为1~14的宽的范围内解离的阳离子性基团。即,上述强阳离子性基团不受水溶液的pH影响,能够保持解离的(阳离子化)状态。
作为上述强阳离子性基团,可举出季铵基团。具体而言,例如,可举出三甲基铵基、三乙基铵基、二甲基乙基铵基等三烷基铵基等。此外,作为上述强阳离子性基团的反离子,例如,可举出氯化物离子、溴化物离子、碘化物离子等卤化物离子。
在上述基材粒子的表面导入的上述强阳离子性基团量,没有特别限制,相对于填充剂的干燥重量的优选的下限为1μeq/g,优选的上限为500μeq/g。上述强阳离子性基团量小于1μeq/g时,保持力弱,分离性能变差。上述强阳离子性基团量超过500μeq/g时,会产生保持力过强,不容易将PCR扩增产物洗脱,分析时间过长等问题。
本说明书中,上述弱阳离子性基团是指pka为8以上的阳离子性基团。即,上述弱阳离子性基团受到水溶液的pH带来的影响,解离状态变化。即,pH比8高时,上述弱阳离子性基团的质子解离,不具有正电荷的比例增加。相反pH比8低时,上述弱阳离子性基团质子化,具有正电荷的比例增加。
作为上述弱阳离子性基团,例如,可举出叔氨基、仲氨基、伯氨基等。其中,优选为叔氨基。
在上述基材粒子的表面导入的上述弱阳离子性基团量,没有特别限制,相对于填充剂的干燥重量的优选的下限为0.5μeq/g,优选的上限为500μeq/g。上述弱阳离子性基团量小于0.5μeq/g时,过少有时分离性能没有提高。上述弱阳离子性基团量超过500μeq/g时,与强阳离子性基团同样产生保持力过强,不容易将PCR扩增产物洗脱,分析时间过长等问题。
上述基材粒子表面的强阳离子性基团或弱阳离子性基团量,通过将氨基中含有的氮原子定量能够进行测定。作为将氮定量的方法,例如可举出凯氏定氮法。本发明(实施例)记载的填充剂的情况下,首先,将聚合后强阳离子性基团中含有的氮定量,接下来,通过将导入弱阳离子性基团后的强阳离子性基团和弱阳离子性基团中含有的氮定量,能够算出之后导入的弱阳离子性基团量。这样,通过定量,制备填充剂时,能够将强阳离子性基团量和弱阳离子性基团量调整在上述范围内。
作为上述基材粒子,例如可以使用利用聚合性单体等得到的合成高分子微粒、二氧化硅系等无机微粒等,优选为由合成有机高分子构成的疏水性交联聚合物粒子。
上述疏水性交联聚合物,可以是将至少1种疏水性交联单体和至少1种具有反应性官能团的单体共聚而得到的疏水性交联聚合物、将至少1种疏水性交联单体和至少1种具有反应性官能团的单体和至少1种疏水性交联单体共聚而得到的疏水性交联聚合物的任意一个。
作为上述疏水性交联性单体,是1分子单体中具有2个以上乙烯基的单体即可,没有特别限制,例如,可举出乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚丙二醇二(甲基)丙烯酸酯等二(甲基)丙烯酸酯、三羟甲基甲烷三(甲基)丙烯酸酯、四羟甲基甲烷三(甲基)丙烯酸酯等三(甲基)丙烯酸酯或四(甲基)丙烯酸酯、或二乙烯基苯、二乙烯基甲苯、二乙烯基二甲苯、二乙烯基萘等芳香族系化合物。应予说明,本说明书中上述(甲基)丙烯酸酯是指丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯,(甲基)丙烯酰基是指丙烯酰基或甲基丙烯酰基。
作为上述具有反应性官能团的单体,可举出缩水甘油基(甲基)丙烯酸酯、异氰酸酯乙基(甲基)丙烯酸酯等。
作为上述疏水性非交联性单体,是具有疏水性的性质的非交联性聚合性有机单体即可,没有特别限制,例如,可举出(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸叔丁酯等(甲基)丙烯酸酯、苯乙烯、甲基苯乙烯等苯乙烯系单体。
上述疏水性交联聚合物是将上述疏水性交联性单体和上述具有反应性官能团的单体共聚得到的聚合物时,上述疏水性交联聚合物中的来自上述疏水性交联性单体的片段的含有比例优选下限为10重量%,更优选下限为20重量%。
本发明的离子交换色谱用填充剂优选是在上述基材粒子的表面具有聚合物层的填充剂,该聚合物层具有上述强阳离子性基团和上述弱阳离子性基团。此外,具有上述强阳离子性基团和上述弱阳离子性基团的聚合物中,上述强阳离子性基团和上述弱阳离子性基团优选分别来自独立的单体。具体而言,本发明的离子交换色谱用填充剂,优选是在由上述疏水性交联聚合物粒子和共聚于上述疏水性交联聚合物粒子表面的具有强阳离子性基团的亲水性聚合物的层构成的被覆聚合物粒子的表面,导入了弱阳离子性基团的填充剂。
上述具有强阳离子性基团的亲水性聚合物是由具有强阳离子性基团的亲水性单体构成的聚合物,可以含有来自于1种以上具有强阳离子性基团的亲水性单体的片段。即,作为制造上述具有强阳离子性基团的亲水性聚合物的方法,可举出将具有强阳离子性基团的亲水性单体均聚的方法、将2种以上的具有强阳离子性基团的亲水性单体共聚的方法、将具有强阳离子性基团的亲水性单体和不具有强阳离子性基团的亲水性单体共聚的方法等。
作为上述具有强阳离子性基团的亲水性单体,优选为具有季铵基团的单体。具体而言,例如,可举出甲基丙烯酰氧乙基三乙基氯化铵、甲基丙烯酰氧乙基二甲基乙基氯化铵、甲基丙烯酰氧乙基二甲基苄基氯化铵、丙烯酰氧乙基二甲基苄基氯化铵、丙烯酰氧乙基三乙基氯化铵、丙烯酰氧乙基二甲基乙基氯化铵、丙烯酰胺乙基三甲基氯化铵、丙烯酰胺乙基三乙基氯化铵、丙烯酰胺乙基二甲基乙基氯化铵等。
作为在上述被覆聚合物粒子的表面导入上述弱阳离子性基团的方法,可以使用公知的方法。具体而言,例如,作为将叔氨基作为上述弱阳离子性基团导入的方法,可举出:在由含有来自于具有缩水甘油基的单体的片段的疏水性交联聚合物构成的疏水性交联聚合物粒子的表面,将上述具有强阳离子性基团的亲水性单体共聚,接下来使缩水甘油基与具有叔氨基的试剂进行反应的方法;在由含有来自于具有异氰酸酯基的单体的片段的疏水性交联聚合物构成的疏水性交联聚合物粒子的表面,将上述具有强阳离子性基团的亲水性单体共聚,接下来,使异氰酸酯基与具有叔氨基的试剂进行反应的方法;在上述疏水性交联聚合物粒子的表面,将上述具有强阳离子性基团的亲水性单体和具有叔氨基的单体共聚的方法;使用具有叔氨基的硅烷偶联剂,在具备上述具有强阳离子性基团的亲水性聚合物层的被覆聚合物粒子的表面导入叔氨基的方法;在由含有来自于具有羧基的单体的片段的疏水性交联聚合物构成的疏水性交联聚合物粒子的表面,将上述具有强阳离子性基团的亲水性单体共聚,接下来,使用碳二亚胺使羧基和具有叔氨基的试剂缩合的方法;在由含有来自于具有酯键的单体的片段的疏水性交联聚合物构成的疏水性交联聚合物粒子的表面,将上述具有强阳离子性基团的亲水性单体共聚,将酯键部分水解后,接下来,使用碳二亚胺使通过水解生成的羧基和具有叔氨基的试剂缩合的方法等。其中,优选:在由含有来自于具有缩水甘油基的单体的片段的疏水性交联聚合物构成的疏水性交联聚合物粒子的表面,将上述具有强阳离子性基团的亲水性单体共聚,接下来,使缩水甘油基与具有叔氨基的试剂反应的方法;在由含有来自于具有异氰酸酯基的单体的片段的疏水性交联聚合物构成的疏水性交联聚合物粒子的表面,将上述具有强阳离子性基团的亲水性单体共聚,接下来,使异氰酸酯基与具有叔氨基的试剂反应的方法。
作为与缩水甘油基或异氰酸酯基等反应性官能团反应的上述具有叔氨基的试剂,是具有叔氨基和能够与反应性官能团反应的官能团的试剂即可,没有特别限制,作为上述叔氨基和能够与反应性官能团反应的官能团,例如,可举出伯氨基、羟基等。其中,优选为末端具有伯氨基的基团。作为具有该官能团的具体的试剂,可举出N,N-二甲基氨基甲基胺、N,N-二甲基氨基乙基胺、N,N-二甲基氨基丙基胺、N,N-二甲基氨基丁基胺、N,N-二乙基氨基乙基胺、N,N-二乙基氨基丙基乙基胺、N,N-二乙基氨基丁基胺、N,N-二乙基氨基戊基胺、N,N-二乙基氨基己基胺、N,N-二丙基氨基丁基胺、N,N-二丁基氨基丙基胺等。
上述强阳离子性基团优选为季铵盐与上述弱阳离子性基团优选为叔氨基的相对的位置关系,优选为上述强阳离子性基团位于与上述弱阳离子性基团相比距离基材粒子的表面远的位置,即外侧。例如,优选上述弱阳离子性基团位于距离基材粒子表面以内,上述强阳离子性基团距离基材粒子表面以内且与弱阳离子性基团相比位于外侧。
本发明的离子交换色谱用填充剂所使用的上述基材粒子的平均粒径,没有特别限制,优选下限为0.1μm、优选上限为20μm。上述平均粒径小于0.1μm时,柱内变为过度高压,有时引起分离不良。上述平均粒径超过20μm时,柱内的死体积变得过大,有时引起分离不良。应予说明,本说明书中上述平均粒径表示体积平均粒径,可以使用粒度分布测定装置(AccuSizer780/ParticleSizingSystems公司制等)测定。
作为本发明中进行的离子交换色谱所使用的洗脱液的组成,可以使用公知的条件。
作为上述洗脱液所使用的缓冲液,优选使用含有公知的盐化合物的缓冲液类、有机溶剂类,具体而言,例如,可举出Tris盐酸缓冲液,由Tris和EDTA构成的TE缓冲液,由Tris、硼酸和EDTA构成的TBA缓冲液等。
上述洗脱液的pH,没有特别限制,优选下限为5,优选上限为10。认为通过设定为该范围,上述弱阳离子性基团作为离子交换基团(阴离子交换基团)也有效发挥作用。上述洗脱液的pH的更优选的下限为6,更优选的上限为9。
作为上述洗脱液中含有的盐,例如,可以使用氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾等由卤化物和碱金属构成的盐、氯化钙、溴化钙、氯化镁、溴化镁等由卤化物和碱土金属构成的盐、高氯酸钠、高氯酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、硝酸钠、硝酸钾等无机酸盐等。此外,也可以使用乙酸钠、乙酸钾、琥珀酸钠、琥珀酸钾等有机酸盐。上述盐可以任一种单独使用或组合使用。
作为上述洗脱液的盐浓度,可以根据分析条件进行适当调整,优选下限为10mmol/L,优选上限为2000mmol/L,更优选下限为100mmol/L,更优选上限为1500mmol/L。
另外,本发明的离子交换色谱中使用的洗脱液中,为了进一步提高分离性能而含有反离液离子(アンチカオトロピックイオン)。反离液离子具有与离液离子相反的性质,具有使水合结构稳定化的作用。因此,具有增强填充剂和核酸分子之间的疏水性相互作用的效果。本发明的离子交换色谱的主要相互作用是静电相互作用,除此之外,通过也利用疏水性相互作用的作用,分离性能提高。
作为上述洗脱液中含有的反离液离子,可举出磷酸根离子(PO4 3-)、硫酸根离子(SO4 2-)、铵根离子(NH4 +)、钾离子(K+)、钠离子(Na+)等。这些离子的组合中,优选使用硫酸根离子和铵根离子。上述反离液离子,可以任一种单独使用或组合使用。应予说明,上述反离液离子的一部分包含上述洗脱液中含有的盐、缓冲液的成分。使用这样的成分时,由于具备作为洗脱液中含有的盐的性质或缓冲能力以及作为反离液离子的性质这两种性质,因此在本发明中优选。
本发明的离子交换色谱用洗脱液中的反离液离子的分析时的浓度,可以根据分析对象物进行适当调整,作为反离液盐优选为2000mmol/L以下。具体而言,可举出使反离液盐的浓度在0~2000mmol/L的范围内进行梯度洗脱的方法。因此,分析开始时的反离液盐的浓度不需要是0mmol/L,此外,分析结束时的反离液盐的浓度也不需要是2000mmol/L。上述梯度洗脱的方法,可以是低压梯度法,也可以是高压梯度法,优选为边进行利用高压梯度法的精密的浓度调整边进行洗脱的方法。
上述反离液离子,可以仅添加至洗脱所使用的洗脱液中的1种中,也可以添加至多种洗脱液中。此外上述反离液离子,可以具备增强填充剂与PCR扩增产物之间的疏水性相互作用的效果或缓冲能力以及将PCR扩增产物从色谱柱进行洗脱的效果这两种作用。
本发明中进行的离子交换色谱中,分析PCR扩增产物时的柱温度,优选为30℃以上,更优选为40℃以上,进一步优选为45℃以上。离子交换色谱的柱温度小于30℃时填充剂和PCR扩增产物之间的疏水性相互作用变弱,得到期望的分离效果变得困难。进一步如图4-1、图4-2、图5-1、图5-2和表3所示,离子交换色谱的柱温度小于45℃时,甲基化DNA的亚硫酸氢盐处理物的PCR扩增产物(甲基化DNA样品)和非甲基化DNA的亚硫酸氢盐处理物的PCR扩增产物(非甲基化DNA样品)的保留时间之差小。另外,对双链DNA中单侧链被甲基化的半甲基化DNA(成为与甲基化DNA样品和非甲基化DNA样品的等量混合物等同的组成)的亚硫酸氢盐处理物的PCR扩增产物(半甲基化DNA样品)进行分析时的色谱,分离不良好,且不清楚。另一方面,柱温度为55℃以上时,来自半甲基化DNA样品中的甲基化DNA链的PCR扩增产物和来自非甲基化DNA链的PCR扩增产物被分离而作为保留时间不同的2个峰分别被检测到,因此即使在半甲基化DNA样品中也能够检测DNA的甲基化。进一步地,柱温度为60℃以上时,由于甲基化DNA样品与非甲基化DNA样品之间的保留时间之差进一步扩大,且各个峰也变得更清楚,因此能够精度更好地进行DNA的甲基化的检测。
进一步,如果离子交换色谱的柱温度变高,则由于甲基化DNA样品和非甲基化DNA样品明显被分离,因此根据样品DNA中的甲基化DNA和非甲基化DNA的存在比率,两者的保留时间的峰面积或峰高度容易产生差异。因此,如果提高柱温度,则基于甲基化DNA样品和非甲基化DNA样品之间的保留时间的峰的面积或高度来测定样品DNA中的甲基化DNA和非甲基化DNA各自的存在量或存在比率变得更加容易。
另一方面,离子交换色谱的柱温度变为90℃以上时,由于PCR扩增产物中的核酸分子的双链解离,因此分析上不优选。进一步,柱温度变为100℃以上时,由于有发生洗脱液的沸腾的可能,因此分析上不优选。因此,本发明中进行的离子交换色谱中分析PCR扩增产物时的柱温度,可以为30℃以上且小于90℃,优选为40℃以上且小于90℃,更优选为45℃以上且小于90℃,进一步优选为55℃以上且小于90℃,进一步更优选为55℃~85℃,还优选为60℃~85℃。
对上述离子交换色谱柱的试样注入量,没有特别限制,可以根据色谱柱的离子交换容量和试样浓度进行适当调整。流速优选为0.1mL/min~3.0mL/min,更优选为0.5mL/min~1.5mL/min。虽然流速变慢时可以期待分离的提高,但是变得过慢时有可能导致分析需要长时间,峰的扩展化所致的分离性能的降低。相反流速变快时在分析时间缩短这方面具有优点,但是由于峰被压缩,导致分离性能降低。因此,虽然是根据柱的性能而适当调整的参数,但优选设定为上述流速的范围。各样品的保留时间可以通过对各样品进行预备实验而预先确定。送液方法可以使用线性梯度洗脱法、逐步洗脱法等公知的送液方法,作为本发明中的送液方法,优选为线性梯度洗脱法。对于梯度(gradient)的大小,可以将洗脱使用的洗脱液在0%~100%的范围内根据柱的分离性能和分析对象物(此处为PCR扩增产物)的特性进行适当调整即可。
本发明中,通过将以上述顺序亚硫酸氢盐处理了的DNA的PCR扩增产物施加于离子交换色谱,检测样品DNA中的DNA的甲基化。本说明书中,DNA的“检测甲基化”是指测定该DNA中的甲基化DNA有无存在或存在量,测定该DNA中的甲基化DNA和非甲基化DNA的存在量之比,或测定该DNA的甲基化的比例(也称为甲基化率)。
更详细而言,将上述亚硫酸氢盐处理了的样品DNA的PCR扩增产物施加于离子交换色谱时,根据该扩增产物中含有的DNA的碱基序列,得到显示不同信号的色谱图。通过将由得到的样品DNA的亚硫酸氢盐处理物的PCR扩增产物得到的检测信号与由与样品DNA的碱基序列相同但没有甲基化的DNA的亚硫酸氢盐处理物(以下,称为阴性对照)的PCR扩增产物得到的检测信号、或由与样品DNA的碱基序列相同且甲基化的比例已知的(例如,100%)DNA的亚硫酸氢盐处理物(以下,称为阳性对照)的PCR扩增产物得到的检测信号进行比较,可以测定样品DNA中的甲基化DNA有无存在(参见图1~3)。
或者,通过将由样品DNA的亚硫酸氢盐处理物的PCR扩增产物获得的检测信号与由阴性和阳性对照的PCR扩增产物得到的检测信号进行比较,可以测定样品DNA中的甲基化DNA的存在量和非甲基化DNA的存在量之比。再或者,通过将由与样品DNA的碱基序列相同且甲基化的比例已知的多个DNA的亚硫酸氢盐处理物(以下,称为标准)所致的多个PCR扩增产物得到的检测信号与由样品DNA的亚硫酸氢盐处理物的PCR扩增产物得到的检测信号进行比较,可以测定样品DNA中的甲基化DNA的甲基化率、存在量、以及与非甲基化DNA的存在量之比(参见图6、图7-1和图7-2)。
本发明的方法中,代替上述阴性对照、阳性对照或标准的PCR扩增产物,也可以使用由与上述阴性对照、阳性对照或标准相同的碱基序列构成的、化学或基因工程合成的DNA。进一步本发明的方法中,在阴性对照、阳性对照或标准的制备中也可以使用市售品,例如可以使用EpiTectControlDNAandControlDNASet(Qiagen公司制)。
此外根据本发明,对于双链DNA中单侧链被甲基化的半甲基化DNA,也可以检测DNA甲基化。用亚硫酸氢盐处理半甲基化DNA的产物的PCR扩增产物成为亚硫酸氢盐处理了的甲基化DNA的PCR扩增产物和亚硫酸氢盐处理了的非甲基化DNA的PCR扩增产物的混合物。本发明中进行的离子交换色谱中,由于能够精度良好地分离测定这些甲基化DNA链和非甲基化DNA链,因此能够检测半甲基化DNA(参见图4-1、图4-2、图5-1、图5-2)。
在优选的实施方式中,本发明中进行的离子交换色谱中,将含有上述样品DNA的亚硫酸氢盐处理物的PCR扩增产物的试样和含有上述阴性对照或阳性对照或上述标准的PCR扩增产物的试样,分别提供给离子交换色谱分析。通过将柱中吸附的试样使用多个洗脱液进行梯度洗脱,从而可以根据DNA甲基化率以不同的保留时间将样品DNA的亚硫酸氢盐处理物的PCR扩增产物和阴性对照或阳性对照或标准的PCR扩增产物洗脱。
由阴性对照得到的检测信号可以通过代替样品DNA,使用与样品DNA碱基序列相同但没有甲基化的DNA,按照上述顺序进行亚硫酸氢盐处理和PCR,将得到的PCR扩增产物施加于离子交换色谱而获得。由阳性对照得到的检测信号可以通过代替样品DNA,使用与样品DNA碱基序列相同且甲基化率已知的(例如,100%)DNA按照上述顺序进行亚硫酸氢盐处理和PCR,将得到的PCR扩增产物施加于离子交换色谱而获得。或者,也可以通过将上述合成DNA、市售的DNA作为阴性或阳性对照施加于离子交换色谱,从而获得由阴性或阳性对照得到的检测信号。
由标准得到的检测信号可以通过代替样品DNA,使用与样品DNA碱基序列相同且甲基化的比例已知的多个DNA按照上述顺序进行亚硫酸氢盐处理和PCR,将得到的多个PCR扩增产物分别施加于离子交换色谱而获得。进一步,可以根据得到的各个检测信号,制作标准曲线。或者,通过将上述合成DNA、市售的DNA作为标准施加于离子交换色谱,也可以得到由标准得到的检测信号。
接下来,将从上述色谱得到的由样品DNA的亚硫酸氢盐处理物的PCR扩增产物得到的检测信号与由阴性或阳性对照、或标准得到的检测信号进行比较。基于两者的检测信号的差异,可以检测样品DNA的甲基化。
例如,由样品DNA的亚硫酸氢盐处理物的PCR扩增产物得到的检测信号的峰的保留时间如果偏离阴性对照的峰的保留时间,可以判定样品DNA甲基化。进而此时,如果保留时间的偏离越大,可以推知甲基化率越大。相反,由样品DNA的亚硫酸氢盐处理物的PCR扩增产物得到的检测信号的峰的保留时间如果越偏离100%甲基化阳性对照的峰的保留时间,可以推知样品DNA的甲基化率越小。或者,基于由甲基化率已知的标准得到的多个峰的保留时间制作标准曲线,基于该标准曲线可以确定样品DNA的甲基化率(参见图7-1和图7-2)。
此外例如,通过将由样品DNA的亚硫酸氢盐处理物的PCR扩增产物得到的检测信号的峰的高度或峰面积,与由甲基化DNA的甲基化率和混合比已知的DNA的亚硫酸氢盐处理物的PCR扩增产物得到的检测信号的峰的高度或峰面积进行比较,可以确定样品DNA中的甲基化DNA的存在比率(例如非甲基化DNA的存在比率、以特定的比例被甲基化的DNA的存在比率等)(参见图6)。
本发明的方法中,作为判定色谱的检测信号的峰的有无的方法,可举出使用已有的数据处理软件例如LCsolution(岛津制作所)、GRAMS/AI(ThermoFisherScientific公司)、IgorPro(WaveMetrics公司)等的峰检测。例示使用LCsolution的峰有无的判定方法时,具体而言,首先指定要检测出峰的保留时间的区间。接下来,为了除去噪音等不要的峰,设定各种参数。例如,可举出将参数“WIDTH”设置为大于不要的峰的半峰宽,将参数“SLOPE”设置为大于不要的峰的上升斜率,通过改变参数“DRIFT”的设定来选择垂直分割或基线分割分离度低的峰等。对于参数值而言,由于根据分析条件、选择的基因标记物的种类、样本的量等得到不同的色谱图,因此按照色谱图设定适当的值即可。
根据本发明的甲基化DNA的检测方法,迅速、简便、且高精度的甲基化DNA的检测成为可能。作为本发明的甲基化DNA的检测方法的应用例,可举出在临床检查上的应用。已知DNA的甲基化的状态影响细胞的癌化,尤其是大多报告了CpG岛的异常DNA甲基化参与致癌(例如,参见日本特开2010-063413号公报)。因此,本发明的甲基化DNA的检测方法可以很好地应用于癌发病检查、癌发病风险检查等临床检查。
进一步,本发明的方法中,从由样品DNA的亚硫酸氢盐处理物的PCR扩增产物得到的检测信号减去由阴性对照得到的检测信号,可以求出差值数据。通过求出差值数据,可以从作为样品DNA整体的检测信号中除去来自非甲基化DNA的信号(噪音),仅提取来自甲基化DNA的信号。该差值数据相当于样品DNA中的甲基化DNA所致的检测信号。例如,上述差值数据中,如果能够检测到与阴性对照不同的保留时间的峰,则可以判断样品DNA中存在甲基化DNA。进一步,通过将该差值数据的峰的保留时间、峰的高度或峰面积与由阴性对照、阳性对照、或标准得到的检测信号的值进行比较,可以确定样品DNA中的甲基化DNA的甲基化率、存在比率。通过使用该差值数据,即使在仅微弱检测到来自甲基化DNA的信号成分的样品,例如甲基化DNA的存在比率低的样品DNA、含有甲基化率低的甲基化DNA的样品DNA中,甲基化DNA的检测、解析也是可能的。因此,通过使用该差值数据,与样品DNA中的甲基化DNA相关的更高精度的解析是可能的。应予说明,在求出差值数据时,优选预先使样品DNA和阴性对照使用的DNA的DNA量一致。DNA量的确认,可以通过吸光度测定等测定方法确认。
上述差值数据在癌发病检查、癌发病风险检查等临床检查中特别有效。用于上述临床检查而采取的样本,有时含有正常细胞,或有时含有多个DNA甲基化未进展到这种程度的前癌状态的细胞。由于通过使用上述差值数据,可以除去来自样本中的正常细胞、前癌细胞中的正常DNA的非甲基化DNA的影响,因此,能够进行更高精度的甲基化DNA的检测,进一步如果利用该检测结果,可以精度更良好地进行癌发病、癌发病风险的诊断。
作为本发明的甲基化DNA的检测方法的其他应用例,可举出在细胞的分化状态的解析中的应用。已知基因组上的甲基化模式是细胞分化的决定因素,在未分化的干细胞(例如ES细胞、iPS细胞、各种生物体干细胞)和分化的细胞中,各自细胞的DNA的甲基化模式不同。如果使用本发明的甲基化DNA的检测方法,由于能够解析与细胞的分化状态相应的甲基化模式的差异,所以能够高度解析DNA提取中使用的细胞的分化阶段、分化状态不同的细胞是否混合等细胞的分化状态。
综上所述,通过使用上述离子交换色谱用柱和洗脱液,能够分离或检测甲基化DNA。因此本发明提供填充有含有上述在表面具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团这两种基团的基材粒子的柱填充剂的用于甲基化DNA检测的离子交换色谱用柱,此外提供上述含有反离液离子的用于甲基化DNA检测的离子交换色谱用洗脱液。上述本发明的柱或洗脱液在提供给公众时、或向公众发出提供的告知时,通过表示或者提倡可以用于甲基化DNA的检测的宗旨,或记载于记载有可用于甲基化DNA的检测的宗旨的文件、电子媒体(例如,使用说明书、目录、小册子、CD、Web等),可以与其他柱、洗脱液识别开。
进一步本发明将上述的本发明的柱与离子交换色谱中使用的器械或部件(例如泵、梯度混合器、保护柱等)、离子交换色谱中使用的试剂类(例如,本发明的洗脱液、柱清洗液等)、本发明的检测方法的各工序中使用的部件、试剂(例如,DNA提取用的柱、试剂和PCR扩增工序中使用的试剂(例如,引物、聚合酶等))的一个以上进行组合,作为甲基化DNA检测中使用的试剂盒进行提供。上述本发明的试剂盒,在提供给公众时、或向公众发出提供的告知时,通过表示或者提倡可以用于甲基化DNA的检测的宗旨,或记载于记载有可用于甲基化DNA的检测的宗旨的文件、电子媒体(例如,使用说明书、目录、小册子、CD、Web等),可以与其他柱、洗脱液识别开,这与本发明的柱、本发明的洗脱液是相同的。
实施例
以下通过实施例对本发明做详细说明,但本发明不受以下实施例的限制。
[参考例1]阴离子交换柱的制备
向带有搅拌机的反应器中的3重量%聚乙烯醇(日本合成化学公司制)水溶液2000mL中,添加四乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业公司制)200g、三乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业公司制)100g、甲基丙烯酸缩水甘油酯(和光纯药工业公司制)100g和过氧化苯甲酰(KISHIDA化学公司制)1.0g的混合物。边搅拌边加热,氮气环境下80℃聚合1小时。接下来,作为具有强阳离子性基团的亲水性单体,将甲基丙烯酸乙基三甲基氯化铵(和光纯药工业公司制)100g溶解于离子交换水。将其添加至相同的反应器,按照相同方式,边搅拌边在氮气环境下80℃聚合2小时。通过用水和丙酮将得到的聚合组合物清洗,得到表面具有亲水性聚合物层的被覆聚合物粒子,其中亲水性聚合物具有季铵基团。对得到的被覆聚合物粒子,使用粒度分布测定装置(AccuSizer780/ParticleSizingSystems公司制)进行测定,平均粒径为10μm。
使得到的被覆聚合物粒子10g在离子交换水100mL中分散,准备反应前浆料。接下来,边搅拌该浆料,边添加N,N-二甲基氨基丙基胺(和光纯药工业公司制)10mL,在70℃反应4小时。反应结束后,使用离心分离机(日立制作所公司制,“HimacCR20G”),除去上清,用离子交换水清洗。清洗后,使用离心分离机除去上清。进一步重复4次该利用离子交换水的清洗,得到在基材粒子的表面具有季铵基团和叔氨基的离子交换色谱用填充剂。
将上述离子交换色谱用填充剂填充于液体色谱系统的不锈钢制柱(柱尺寸:内径4.6mm×长度20mm)。
[参考例2]样本细胞的制备
1)LoVo、LS174T、HCT116细胞的培养
为了得到CDKN2A基因启动子部位(序列编号1)的100%甲基化DNA、非甲基化DNA、以及它们的杂合结合体DNA(半甲基化DNA),购入具有各个状态(status)的该启动子基因的3种细胞系LoVo、LS174T、和HCT116(DSPharmaBiochemical公司制)。培养是在适合各个细胞的培养基条件下进行。LoVo是在Ham’sF-12(F-12NutrientMixture)培养基中添加10%FBS(FetalBovineSerum),在加湿室中5%CO2存在下于37℃培养(B.Drewinko,M.M.Romsdahl,L.Y.Yang.,CancerRes.36,1976,467)。LS174T是在MEM(MinimumEssentialMedium)Earle’s培养基中添加10%FBS和1%NEAA(Non-EssentialAminoAcids),在加湿室中5%CO2存在下于37℃培养(B.H.Tom,L.P.Rutzky,M.M.Jakstys.InVitro.12,1976,180)。HCT116是在McCoy‘s5AMedium培养基中添加10%FBS,在加湿室中5%CO2存在下于37℃培养(M.G.Brattain,W.D.Fine,J.Thompson.CancerRes.41,1981,1751)。培养使用75mL的细胞培养瓶进行,培养结束后的细胞按照常规的方法回收制成团状在-80℃保存。
2)DHL-9、293T细胞的培养
为了得到MTAP基因启动子部位(序列编号5)的甲基化、非甲基化,使用具有各个状态(status)的该启动子基因的2种细胞系DHL-9和293T。培养在适用于各个细胞的培养基条件下进行。DHL-9是在RoswellParkMemorialInstituteTissueCultureMedium1640培养基中添加10%(v/v)FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mmol/LL-谷氨酰胺,在加湿室中5%CO2存在下于37℃培养。293T是在DMEM(Dulbecco'smodifiedEagle'smedium)培养基中添加10%(v/v)FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素,在加湿室中5%CO2存在下于37℃培养。培养使用75mL的细胞培养瓶进行,培养结束后的细胞按照常规的方法回收制成团状在-80℃保存。
[实施例1]来自样本细胞的甲基化DNA的检测
1)基因组DNA的提取和亚硫酸氢盐处理
参考例2中培养的细胞系LoVo、LS174T、HCT116、DHL-9、或293T的基因组DNA,使用QIAampDNAMiniKit(50)(Qiagen公司制)从-80℃保存的细胞团提取,使用分光光度计测定DNA浓度后,在使用前-80℃下保存。准备各个基因组DNA每个1μg,使用EpiTectBisulfiteKit(48)(Qiagen公司制)进行亚硫酸氢盐处理并精制。亚硫酸氢盐处理后的DNA,精制时视为全部被回收(20ng/μL),用于接下来的操作。此外将未进行亚硫酸氢盐处理的DNA调整为10ng/μL用于接下来的操作。准备的DNA在使用前以-20℃保存。
2)PCR
将1)中得到的亚硫酸氢盐处理基因组DNA进行PCR扩增。PCR在含有模板DNA10ng、GeneAmp1×PCRbuffer(LifeTechnologies公司制)、200μmol/LGeneAmpdNTPMix(LifeTechnologies公司制)、0.75UAmpliTaqGoldDNA聚合酶(LifeTechnologies公司制)、0.25μmol/L正义和反义引物的25μL反应液中进行。PCR中,进行94℃10分钟初期热变性后,将94℃30秒→57℃(使用F3-R3引物时)30秒或58℃(使用F4-R3引物时)30秒→72℃30秒作为1个循环,持续40循环,进一步进行72℃7分钟的延伸反应。PCR结束后,在预先添加溴化乙锭的3%琼脂糖凝胶中,对反应液5μL混合loadingdyesolution1μL后上样,进行电泳,观察PCR扩增产物,确认得到目标PCR扩增产物。
3)HPLC分析
使用参考例1中准备的阴离子交换柱,在以下条件下进行离子交换色谱,分离检测2)中得到的各PCR扩增产物。
系统:LC-20ASERIS(岛津制作所公司制)
洗脱液:洗脱液A25mmol/LTris盐酸缓冲液(pH7.5)
洗脱液B25mmol/LTris盐酸缓冲液(pH7.5)+1mol/L硫酸铵
分析时间:分析时间10分钟
洗脱法:在以下的梯度条件下线性增加洗脱液B的混合比率。0分钟(洗脱液B40%)→10分钟(洗脱液B100%)
样本:LoVo(甲基化DNA)PCR扩增产物136bp
LS174T(非甲基化DNA)PCR扩增产物136bp
HCT116(半甲基化DNA)PCR扩增产物136bp
LoVo(甲基化DNA)PCR扩增产物77bp
LS174T(非甲基化DNA)PCR扩增产物77bp
HCT116(半甲基化DNA)PCR扩增产物77bp
DHL-9(甲基化DNA)PCR扩增产物202bp
293T(非甲基化DNA)PCR扩增产物202bp
流速:1.0mL/min
检测波长:260nm
试样注入量:5μL(来自LoVo、LS174T或HCT116的试样)
7μL(来自DHL-9或293T的试样)
柱温度40~85℃
对于甲基化DNA的PCR扩增产物和非甲基化DNA的PCR扩增产物的峰分离度Rs而言,在将各峰的保留时间定义为tR1、tR2(tR1<tR2),将各峰的半峰宽定义为W0.5h1、W0.5h2时,根据日本药典和JIS高效液相色谱通则的定义由以下数学式表示。
[数学式1]
其中,tR1、tR2、W0.5h1、W0.5h2使用相同的单位。此外,关于峰半峰宽W0.5h的计算方法,将峰视为标准偏差σ的正态分布时由以下数学式表示。
[数学式2]
W0.5h=2.354σ
[实验1]CDKN2A基因启动子区域的甲基化解析
按照实施例1的顺序,检测从LoVo和LS174T提取的DNA中的CDKN2A基因启动子区域的甲基化。PCR中,由各亚硫酸氢盐处理DNA的CDKN2A基因启动子DNA(序列编号1),使用引物CDKN2A-F3和CDKN2A-R3(序列编号2、3)扩增136bp区域,以及使用引物CDKN2A-F4和CDKN2A-R3(序列编号4、3)扩增77bp区域。离子交换色谱分析中柱温度设置为40℃。模板DNA的序列、引物的序列、扩增产物大小、和启动子的序列的扩增区域中的CpG岛的数目由表1示出。离子交换色谱分析的结果由图1和图2示出。
[表1]
[实验2]MTAP基因启动子区域的甲基化解析
按照实施例1的顺序,检测从DHL-9和293T提取的DNA中的MTAP基因启动子区域的甲基化。PCR中,使用引物(序列编号6、7),将各亚硫酸氢盐处理DNA的MTAP基因启动子DNA(序列编号5)中的202bp区域扩增。离子交换色谱分析中的柱温度设置为70℃。模板DNA的序列、引物的序列、扩增产物尺寸、和启动子的序列的扩增区域中的CpG岛的数目由表2示出。离子交换色谱分析的结果由图3示出。
[表2]
方框包围的区域是引物结合位置,atg:翻译起始密码子
[实验3]CDKN2A基因启动子区域的甲基化解析
按照实施例1的顺序,检测从LoVo、LS174T和HCT116提取的DNA中的CDKN2A基因启动子区域的甲基化。PCR中,与实验1同样,将各亚硫酸氢盐处理DNA的CDKN2A基因启动子DNA(序列编号1)中的136bp区域和77bp区域扩增。离子交换色谱分析中的柱温度设置为40℃~85℃。
图4-1、图4-2、图5-1、图5-2中表示来自CDKN2A基因启动子的100%甲基化DNA、非甲基化DNA、和半甲基化DNA的亚硫酸氢盐处理物的PCR扩增产物(分别为136bp和77bp)的离子交换色谱分析的结果。离子交换色谱的柱温度,在图4-1、图4-2、图5-1和图5-2中,柱温度为(A)40℃、(B)45℃、(C)50℃、(D)55℃、(E)60℃、(F)65℃、(G)70℃、(H)85℃。表3中表示上述PCR扩增产物(77bp)的各柱温度下的峰分离度Rs。
[表3]
通过实验1~3的结果和考察
根据利用HPLC的分析结果(图1、2、3),可以确认能够精度良好地分离检测甲基化DNA和非甲基化DNA。没有甲基化的DNA,模板启动子序列中的CpG岛的胞嘧啶通过亚硫酸氢盐处理被变换为尿嘧啶,PCR中作为胸腺嘧啶被扩增。另一方面,甲基化DNA,由于CpG岛的甲基化胞嘧啶即使进行亚硫酸氢盐处理也没有产生变化,仍为胞嘧啶,因此PCR中作为胞嘧啶被扩增。因此,图1、2、3示出的结果表示通过PCR扩增产物的胞嘧啶和胸腺嘧啶的差异,甲基化DNA和非甲基化DNA被分离检测。应予说明,焦磷酸测序解析的结果,可确认LoVo和DHL-9的DNA100%被甲基化。
对于各个模板启动子序列的PCR扩增区域中的CpG岛的数量,用于图1的分析的样品中为10/136bp,用于图2的分析的样品为7/77bp,用于图3的分析的样品中为16/202bp。因此,如果PCR扩增产物的序列中产生弱至10%的碱基差的程度的甲基化,利用本发明的方法,能够短时间内精度良好地检测。
此外,如图4-1、图4-2、图5-1、图5-2和表3所示,可以确认甲基化DNA和非甲基化DNA的亚硫酸氢盐处理物的PCR扩增产物的HPLC中的峰分离随着柱温度的上升而提高。因此,本发明的方法中通过调节离子交换色谱分析的柱温度,能够精度更良好地检测甲基化DNA和非甲基化DNA。
[实验4]甲基化/非甲基化DNA混合样品的解析
1)甲基化/非甲基化DNA混合样品的制备
按照实施例1的顺序,制备CDKN2A基因启动子部位(序列编号1)的100%甲基化DNA和非甲基化DNA,使用EpiTectBisulfiteKit(48)(Qiagen公司制)进行亚硫酸氢盐处理。亚硫酸氢盐处理了的100%甲基化DNA和非甲基化DNA按照特定的比例混合,制备甲基化/非甲基化DNA混合样品。将各DNA按照与实验1同样的顺序进行PCR扩增,得到136bp的PCR扩增产物。
2)HPLC分析
按照实施例1的顺序,进行上述得到的PCR扩增产物的离子交换色谱。柱温度设置为70℃。分离检测各PCR扩增产物,测定保留时间的峰高度。分别求出各样品中的100%甲基化DNA的峰高度相对于仅含有100%甲基化DNA的(甲基化DNA含有率100%)样品的峰高度的比率、以及各样品中的非甲基化DNA的峰高度相对于仅含有非甲基化DNA的(甲基化DNA含有率0%)样品的峰高度的比率。图6表示将各样品DNA中的100%甲基化DNA和非甲基化DNA的峰高度的比率相对于样品DNA中的100%甲基化DNA含有率绘制的图。
如图6所示,利用HPLC样品DNA中的100%甲基化DNA和非甲基化DNA被明显分离为不同的峰,而且其峰高度的比率,与样品DNA中各自存在比率成比例。因此,本发明方法中通过测定HPLC的峰高度,能够测定样品DNA中含有的甲基化率不同的DNA的存在比率。
[实验5]甲基化率不同的DNA样品的解析
对全长为384bp的由腺嘌呤(A)48bp、胸腺嘧啶(T)158bp、鸟嘌呤(G)100bp、胞嘧啶0bp、和39个位置的CpG位点78bp构成的合成DNA,合成从39个位置的CpG位点全部被甲基化的DNA(100%甲基化DNA)至全部没有被甲基化的DNA(0%甲基化DNA)的甲基化率不同的8个DNA。应予说明,对于50%甲基化DNA,合成甲基化位置在5’端附近、在3’端附近、和在中央附近的3种模式的DNA。各合成DNA的甲基化率和CpG岛的甲基化数由表4示出。
[表4]
对于上述8个合成DNA,按照实施例1的顺序检测甲基化。DNA甲基化率不同的DNA(0%、25%、50%、75%、100%)的HPLC的色谱图由图7-1A示出,DNA甲基化位置不同的50%甲基化DNA(随机、5’端附近、3’端附近、中央)的HPLC的色谱图由图7-1B示出,HPLC的洗脱时间(保留时间)相对于DNA甲基化率绘制的数据由图7-2C示出。HPLC分析的洗脱时间,相对于DNA甲基化率具有极高的相关性。进而,对于50%甲基化DNA,能够确认不依赖于甲基化位置地显示基本相同的保留时间。因此,可知不依赖于DNA中的甲基化位置而依赖于甲基化率来决定保留时间。因此,本发明的方法中通过测定HPLC的保留时间,能够测定样品DNA中含有的甲基化率。
Claims (13)
1.一种甲基化DNA的检测方法,其特征在于,包括以下工序(1)、(2)和(3):
(1)用亚硫酸氢盐处理样品DNA的工序;
(2)将该用亚硫酸氢盐处理了的样品DNA通过PCR进行扩增的工序;以及
(3)将得到的PCR扩增产物施加于离子交换色谱的工序。
2.一种甲基化DNA的检测方法,其特征在于,包括以下工序(1)、(2)和(3’):
(1)用亚硫酸氢盐处理样品DNA的工序;
(2)将该用亚硫酸氢盐处理了的样品DNA通过PCR进行扩增的工序;以及
(3’)在45℃以上且小于90℃的柱温度下,将得到的PCR扩增产物施加于离子交换色谱的工序。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述离子交换色谱是阴离子交换色谱。
4.根据权利要求1~3中任1项所述的方法,其中,所述离子交换色谱中使用的柱填充剂含有基材粒子,在该基材粒子的表面具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团这两种基团。
5.根据权利要求1~4中任1项所述的方法,其中,所述离子交换色谱中,所述PCR扩增产物的洗脱所使用的洗脱液含有反离液离子。
6.根据权利要求1~5中任1项所述的方法,其中,所述反离液离子是硫酸根离子和铵根离子中的任一种或两种。
7.根据权利要求1~6中任1项所述的方法,其中,进一步包括以下工序:将用亚硫酸氢盐处理所述样品DNA而得的产物的PCR扩增产物的由离子交换色谱得到的检测信号,与用亚硫酸氢盐处理与所述样品DNA的碱基序列相同但没有甲基化的DNA而得的产物的PCR扩增产物的由离子交换色谱得到的检测信号进行比较,或者与用亚硫酸氢盐处理与所述样品DNA的碱基序列相同且甲基化的比例已知的DNA而得的产物的PCR扩增产物的由离子交换色谱得到的检测信号进行比较。
8.根据权利要求7所述的方法,其中,进一步包括以下工序:基于所述比较的工序的结果,测定所述样品DNA中甲基化DNA有无存在、甲基化率或存在比率。
9.根据权利要求1~6中任1项所述的方法,其中,进一步包括以下工序:从用亚硫酸氢盐处理所述样品DNA而得的产物的PCR扩增产物的由离子交换色谱得到的检测信号中,减去用亚硫酸氢盐处理与所述样品DNA的碱基序列相同但没有甲基化的DNA而得的产物的PCR扩增产物的由离子交换色谱得到的检测信号,得到差值数据。
10.根据权利要求9所述的方法,其中,进一步包括以下工序:基于所述差值数据,测定所述样品DNA中甲基化DNA有无存在、甲基化率或存在比率。
11.一种从样品DNA的信号提取甲基化DNA的信号的方法,其特征在于,包括以下工序(1)~(6):
(1)用亚硫酸氢盐处理样品DNA的工序;
(2)将该用亚硫酸氢盐处理了的样品DNA通过PCR进行扩增的工序;
(3)将工序(2)中得到的PCR扩增产物施加于离子交换色谱的工序;
(4)用亚硫酸氢盐处理与该样品DNA的碱基序列相同但没有甲基化的DNA,并进行PCR扩增的工序;
(5)将工序(4)中得到的PCR扩增产物施加于离子交换色谱的工序;以及
(6)从工序(3)中得到的色谱检测信号中减去工序(5)中得到的色谱检测信号而得到差值数据的工序。
12.离子交换色谱用柱在甲基化DNA检测中的使用,所述离子交换色谱用柱填充有柱填充剂,所述柱填充剂含有在表面具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团这两种基团的基材粒子。
13.离子交换色谱用洗脱液在甲基化DNA检测中的使用,所述离子交换色谱用洗脱液含有反离液离子。
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