CN105067824A - 一种基于聚多巴胺修饰的光纤spr传感器表面连接抗体方法 - Google Patents

一种基于聚多巴胺修饰的光纤spr传感器表面连接抗体方法 Download PDF

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苏荣欣
石瑟
黄仁亮
齐崴
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Abstract

本发明涉及一种基于聚多巴胺修饰的光纤SPR传感器表面连接抗体方法；通过多巴胺在金膜表面快速简便的自发聚合，形成聚多巴胺修饰的金膜表面；通过金膜表面聚多巴胺中醌基与抗体中氨基的席夫碱反应，抗体被连接在聚多巴胺修饰的金膜表面。利用本发明方法连接抗体后，传感器共振波长偏移量约为传统方法的2倍；对抗原检测的灵敏度约为传统连接抗体方法的4倍，检测限比传统连接抗体方法约低7倍。本发明的传感器可以通过多巴胺的自身聚合被有效的功能化，该功能化操作简单、反应迅速。比传统的连接抗体方法有更高的抗体连接效率，对抗原检测，有更高的灵敏度。具有很好的经济适用性和可行性。

Description

一种基于聚多巴胺修饰的光纤SPR传感器表面连接抗体方法
技术领域
本发明涉及一种基于聚多巴胺修饰的光纤SPR传感器表面连接抗体方法，属于表面等离子共振谱仪传感器表面修饰与功能分子连接方法。
技术背景
光纤型表面等离子共振(Surfaceplasmonresonance，SPR)传感器，用于监测分子相互作用与目标分子定量检测，已广泛应用于疾病诊断、DNA杂交与细胞行为监测、环境与食品安全检测等领域。它不但保持了传统棱镜型SPR传感器高灵敏度、无标记、实时检测等特点，并且具有其独特优势，包括：小型化、可抵抗电磁波干扰、可实现远距离传感等。
抗体在传感器表面的连接效率，对SPR免疫分析实验结果起着关键作用。传感器上连接越多的抗体，就能检测到越多的抗原。目前，SPR传感器连接抗体方法主要是利用抗体中的氨基与11-巯基十一烷酸修饰的传感器上的羧基之间的反应，从而将抗体连接至传感器表面。然而，由于该方法在抗体连接前，需要用1-乙基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)对传感器表面的羧基进行活化，而此活化过程存在着严重的水解现象，从而导致了此方法连接抗体效率大大降低。因此，开发有效的连接抗体方法，提高抗体连接效率和抗原检测灵敏度，成为专家学者们亟待解决的问题之一。
发明内容
本发明目的在于提供一种基于聚多巴胺修饰的光纤SPR传感器表面连接抗体方法。该连接抗体方法快速、简便，具有优异的抗体连接效率以及赋予传感器高的抗原检测灵敏度。本发明是通过以下技术方案加以实现的。
本发明的一种基于聚多巴胺修饰的光纤SPR传感器表面连接抗体方法，包括以下步骤：
1)称取多巴胺盐酸盐，将其溶于10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，配制成1-2mg/mL的多巴胺溶液；将清洗过的传感器浸泡于配置的多巴胺溶液中，于振荡器中反应20-50min，用去离子水冲洗，氮气吹干，得到聚多巴胺修饰的传感器；
2)将步骤1)制备的聚多巴胺修饰的传感器浸泡于50-100μg/mL的抗体的PBS中，SPR谱仪实时监测传感器共振波长变化，3-5h后，传感器表面连接抗体反应初步达到平衡；为使传感器表面连接抗体更加牢固和充分，将此连接抗体反应转移到4℃的恒温箱中继续反应过夜，然后取出，PBS清洗，氮气吹干。
所述的PBS浓度为10mM，pH＝7.4。
所述步骤1)中，振荡器转速需为120转每分钟。
所述步骤2)中，抗体为带氨基或巯基的其它抗体。
所述抗体为抗人免疫球蛋白G、牛血清白蛋白抗体或前列腺炎抗体。
本发明的连接抗体方法用于棱镜型SPR传感器与QCM传感器。
本发明的光纤SPR传感器连接抗体方法，到目前为止是没有人报道过的；为了进一步评价本发明方法的连接抗体效果，我们采用传统的连接抗体方法(抗体中的氨基与11-巯基十一烷酸修饰的传感器上的羧基之间的反应)作为对比实验，对本发明方法与传统方法的连接抗体与检测抗原效果进行了比较，验证本发明方法具有高的抗体连接效率和抗原检测灵敏度。
本发明通过多巴胺在金膜表面快速简便的自发聚合，形成聚多巴胺修饰的金膜表面；通过金膜表面聚多巴胺中醌基与抗体中氨基的席夫碱反应，抗体被连接在聚多巴胺修饰的金膜表面。考察了聚多巴胺修饰的传感器连接抗体以及检测抗原效果，结果显示：利用本发明方法连接抗体后，传感器共振波长偏移量约为传统方法的2倍；对抗原检测的灵敏度约为传统连接抗体方法的4倍，检测限比传统连接抗体方法约低7倍。本发明的连接抗体方法，拥有优异的抗体连接效率与高的抗原检测灵敏度，且方法简单、快速，具有很好的经济适用性和可行性。与现有SPR传感器连接抗体方法相比，本发明的优点在于：
(1)本发明方法中，传感器可以通过多巴胺的自身聚合被有效的功能化，该功能化操作简单、反应迅速。
(2)本发明方法，比传统的连接抗体方法有更高的抗体连接效率，见附图1；对抗原检测，有更高的灵敏度，见附图2。
(3)本发明方法中的传感器表面的聚多巴胺层，可以在强氧化性溶剂中快速解聚，从传感器表面去除，所以利用本发明方法进行抗体连接或免疫实验后，可迅速简便的实现传感器再生。
附图说明
图1本发明方法(抗体中氨基与聚多巴胺修饰的传感器中醌基反应)与传统方法(抗体中氨基与11-巯基十一烷酸修饰的传感器中羧基反应)连接抗体动力学曲线。
图2本发明方法(抗体中氨基与聚多巴胺修饰的传感器中醌基反应)与传统方法(抗体中氨基与11-巯基十一烷酸修饰的传感器中羧基反应)连接抗体后，对抗原的检测能力对比。
具体实施方式
实施例1
将SPR传感器用乙醇、水清洗，氮气吹干，备用。称取多巴胺盐酸盐，将其溶于10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，配制成2mg/mL的多巴胺溶液。将清洗过的传感器浸泡于配置的多巴胺溶液中，于振荡器中(120转每分钟)反应30min，取出，用去离子水冲洗，氮气吹干，金膜表面被聚多巴胺功能化。将聚多巴胺修饰的传感器通过SMA等接头连接到光纤SPR谱仪上，然后，将其浸泡于100μg/mL的羊抗人免疫球蛋白G的PBS中，光纤SPR谱仪实时监测聚多巴胺修饰的传感器共振波长变化，每隔一定的时间叠加一次活动光谱，记录该时刻下传感器的共振波长。用origin软件作图，得到聚多巴胺修饰的SPR传感器对羊抗人免疫球蛋白G的动力学吸附曲线(见附图1)。
对比实验：将SPR传感器用乙醇、水清洗，氮气吹干，浸入1mM的11-巯基十一烷酸乙醇溶液中，室温反应12h，取出，乙醇冲洗，氮气吹干。修饰后的传感器，浸入1-乙基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺(0.4mM/0.1mM)的混合液中30min，活化11-巯基十一烷酸修饰的传感器表面上的羧基，取出，去离子水冲洗，氮气吹干。将11-巯基十一烷酸修饰的传感器通过SMA等接头连接到光纤SPR谱仪上，然后，将其浸泡于100μg/mL的羊抗人免疫球蛋白G的PBS中，与聚多巴胺修饰的传感器同样的监测方法与数据处理，得到11-巯基十一烷酸修饰的SPR传感器对羊抗人免疫球蛋白G的动力学吸附曲线(见附图1)。
图中显示：在连接羊抗人免疫球蛋白G抗体实验达到平衡时，聚多巴胺修饰的SPR传感器波长偏移约为11-巯基十一烷酸修饰的SPR传感器波长偏移的2倍，且从曲线斜率得知：聚多巴胺修饰的SPR传感器连接抗体速度远快于11-巯基十一烷酸修饰的SPR传感器连接抗体速度。该结果表明：与传统连接抗体方法相比，本发明方法(抗体中氨基与聚多巴胺修饰的传感器中醌基反应)拥有更好的抗体连接效率。
实施例2
将实施例1获得的连接抗体反应初步达到平衡的传感器，转入4℃的恒温箱中继续反应过夜，然后取出，用PBS冲洗，氮气吹干，浸入2μg/mL的人免疫球蛋白G溶液中，37℃反应30min，测定传感器此时在PBS中的共振波长，计算出传感器因抗原抗体相互作用的共振波长偏移值；将结合有人免疫球蛋白G的传感器浸泡于10mM的NaOH中10min，抗原抗体解除相互作用，传感器表面抗体被再生；将再生后连接有抗体的聚多巴胺修饰的传感器浸入不同浓度的人免疫球蛋白G的PBS中，记录每一浓度人免疫球蛋白G引起的传感器共振波长的偏移值，绘制聚多巴胺修饰的SPR传感器检测人免疫球蛋白G的工作曲线(见附图2)。用同样的检测操作方法，进行11-巯基十一烷酸修饰的传感器对一系列浓度的人免疫球蛋白G的检测，绘制11-巯基十一烷酸修饰的SPR传感器检测人免疫球蛋白G的工作曲线(见附图2)。
图中显示：与11-巯基十一烷酸修饰的SPR传感器相比，聚多巴胺修饰的SPR传感器对人免疫球蛋白G检测拥有更高的灵敏度，通过计算得知：聚多巴胺修饰的SPR传感器对人免疫球蛋白G检测，灵敏度是11-巯基十一烷酸修饰的SPR传感器的4倍；检测限比11-巯基十一烷酸修饰的SPR传感器低7倍。
实施例3
将SPR传感器用乙醇、水清洗，氮气吹干，备用。称取多巴胺盐酸盐，将其溶于10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，配制成1mg/mL的多巴胺溶液。将清洗过的传感器浸泡于配置的多巴胺溶液中，于振荡器中(120转每分钟)反应30min，取出，用去离子水冲洗，氮气吹干，金膜表面被聚多巴胺功能化。将聚多巴胺修饰的传感器通过SMA等接头连接到光纤SPR谱仪上，然后，将其浸泡于50μg/mL的羊抗人免疫球蛋白G抗体的PBS中，光纤SPR谱仪实时监测聚多巴胺修饰的传感器共振波长变化，达到平衡时，将此连接抗体反应转移到4℃的恒温箱中继续反应过夜，然后取出，PBS清洗，氮气吹干，测定此时传感器的共振波长。结果显示：该聚多巴胺修饰的传感器连接羊抗人免疫球蛋白G抗体后，波长偏移量为37.22nm。
实施例4
将两根SPR传感器用乙醇、水清洗，氮气吹干，备用。称取多巴胺盐酸盐，将其溶于10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，配制成2mg/mL的多巴胺溶液。将清洗过的传感器浸泡于配置的多巴胺溶液中，于振荡器中(120转每分钟)，一根传感器反应20min，一根传感器反应50min，取出，用去离子水冲洗，氮气吹干，金膜表面被聚多巴胺功能化。将多巴胺聚合时间为20min的传感器通过SMA等接头连接到光纤SPR谱仪上，然后，将其浸泡于100μg/mL的羊抗人免疫球蛋白G的PBS中，光纤SPR谱仪实时监测聚多巴胺修饰的传感器共振波长变化，达到平衡时，将此连接抗体反应转移到4℃的恒温箱中继续反应过夜，然后取出，PBS清洗，氮气吹干，测定此时传感器的共振波长。同样的操作与测定方法，得到多巴胺聚合时间为50min的传感器连接抗体后的共振波长变化，结果显示：两根传感器连接羊抗人免疫球蛋白G抗体后，波长偏移量分别为35.53nm与78.21nm。
实施例5
将SPR传感器用乙醇、水清洗，氮气吹干，备用。称取多巴胺盐酸盐，将其溶于10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，配制成2mg/mL的多巴胺溶液。将清洗过的传感器浸泡于配置的多巴胺溶液中，于振荡器中(120转每分钟)反应30min，取出，用去离子水冲洗，氮气吹干，金膜表面被聚多巴胺功能化。将聚多巴胺修饰的传感器通过SMA等接头连接到光纤SPR谱仪上，然后，将其浸泡于100μg/mL的牛血清白蛋白抗体的PBS中，光纤SPR谱仪实时监测聚多巴胺修饰的传感器共振波长变化，达到平衡时，将此连接抗体反应转移到4℃的恒温箱中继续反应过夜，然后取出，PBS清洗，氮气吹干，测定此时传感器的共振波长。结果显示：该聚多巴胺修饰的传感器连接牛血清白蛋白抗体后，波长偏移量为43.55nm。
本发明公开和提出的一种基于聚多巴胺修饰的光纤SPR传感器表面连接抗体方法，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件和工艺路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的表面修饰与抗体连接技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

Claims (7)

1.一种基于聚多巴胺修饰的光纤SPR传感器表面连接抗体方法；其特征是利用多巴胺在金膜表面的自发聚合将金膜传感器功能化，采用聚多巴胺中的醌基与抗体中的氨基之间的席夫碱反应，将抗体连接至聚多巴胺修饰的传感器表面。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是包括如下步骤：
1)称取多巴胺盐酸盐，将其溶于10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，配制成1-2mg/mL的多巴胺溶液；将清洗过的传感器浸泡于配置的多巴胺溶液中，于振荡器中反应20-50min，用去离子水冲洗，氮气吹干，得到聚多巴胺修饰的传感器；
2)将步骤1)制备的聚多巴胺修饰的传感器浸泡于50-100μg/mL的抗体的PBS中，SPR谱仪实时监测传感器共振波长变化，3-5h后，传感器表面连接抗体反应初步达到平衡；将此连接抗体反应转移到4℃的恒温箱中继续反应过夜，然后取出，PBS清洗，氮气吹干。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是所述的PBS浓度为10mM，pH＝7.4。
4.如权利要求2所述的方法，其特征是所述步骤1)中，振荡器转速需为120转每分钟。
5.如权利要求2所述的方法，其特征是所述步骤2)中，抗体为带氨基或巯基的其它抗体。
6.如权利要求5所述的方法，其特征是所述抗体为抗人免疫球蛋白G、牛血清白蛋白抗体或前列腺炎抗体。
7.本发明的连接抗体方法用于棱镜型SPR传感器与QCM传感器。
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