CN105044081B - 一种Pb2+含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

一种Pb²⁺含量的测定方法，属于化学发光技术领域，利用末端含富G寡核苷酸链的发卡DNA1修饰磁珠制备DNA1修饰磁珠DNA1‑MB，当含Pb²⁺样品加入DNA1‑MB中后，形成Pb²⁺‑G四链体结构；再加入DNA2后，DNA2的5’端与G四链体结构3’端单链部分杂交形成足点域，在足点域的作用下DNA2未杂交的部分与G四链体未杂交部分继续进行杂交形成双链DNA，将Pb²⁺替换下来进行下一个G四链体结构的形成，如此Pb²⁺被循环利用，同时将大量的DNA2附着在磁珠上，利用光二极管诱导化学发光原理，利用化学发光仪检测化学发光强度，根据化学发光强度实现对Pb²⁺的测定。本发明方法简单、成本低、灵敏度高。

Description

一种Pb2+含量的测定方法

技术领域

本发明属于化学发光技术领域，具体为一种Pb²⁺含量的测定方法。

背景技术

随着金属制品、汽油、蓄电池、化学涂料等产品使用量的不断增加以及工农业三废的排放，铅以多种途径广泛进入到人们的生活环境中，并呈加剧趋势，不仅直接影响农作物的生长发育、产量、品质等，而且间接通过食物链对人体健康造成严重的危害，铅污染已经引起了广泛关注。传统的重金属铅检测技术已经难以满足环境与食品安全监控的需求，因此，建立方便、快速的重金属铅的检测技术十分必要。

目前测定Pb²⁺的传统方法灵敏度不高，操作复杂，不容易满足实际检测要求。常用的铅的检测方法有原子吸收光谱法(李宏卫，曹建劲，苏志华，等.铅检测方法研究进展[J].安徽农业科学，2008，36(19)：8255～8256，8262)；分子信标核酸检测技术(毛华伟，赵晓东，杨锡强.脱氧核酶研究进展[J].中国生物工程杂志,2003,23(4)：43～47)，化学发光法(Xiang Li,Gongke Wang,Xuelian Ding,Yuhan Chen,Yaping Gou and Yan Lu.A turn-onfluorescent sensor for detection of Pb²⁺based on graphene oxide and G-quadruplex DNA.Phys. Chem.Chem.Phys,2013,15,12800-12804)。这些方法各有其优点，能不同程度的满足对Pb²⁺的检测要求，但方法的灵敏度不高、操作复杂。所以必须发展一种灵敏度高，简单的新型检测方法。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种Pb²⁺含量的测定方法。

本发明是通过以下措施来实现的：

(1)利用链霉亲和素与生物素的作用将生物素修饰的DNA1与链霉亲和素修饰磁珠进行交联制备发卡DNA1修饰磁珠DNA1-MB；

(2)利用Pb²⁺可以诱导富G寡核苷酸链形成G四链体结构的特征，当含Pb²⁺样品加入DNA1-MB中后，富G寡核苷酸链形成G四链体结构；然后，加入标记探针DNA2后，DNA2 的5’端与G四链体结构3’端单链部分杂交形成足点域，在足点域的作用下DNA2未杂交的部分与G四链体未杂交部分继续进行杂交反应，形成双链DNA，将DNA2附着在磁珠上，同时，将Pb²⁺替换下来，被替换下来的Pb²⁺进行下一个G四链体结构的形成，并使另外一条 DNA2附着在磁珠上，如此Pb²⁺被循环利用，同时将大量的DNA2附着在磁珠上，利用光二极管诱导化学发光原理，利用化学发光仪检测化学发光强度，根据化学发光强度实现对Pb²⁺的测定。

本发明所建立的一种Pb²⁺含量的测定方法，其特征是：

当含Pb²⁺样品加入后，发卡结构被打开，生成Pb²⁺-G四链体的稳定结构。然后，加入标记探针DNA2后，DNA2与G四链体末端的足点域杂交，Pb²⁺-G四链体结构被破坏，打开G 四链体，释放出Pb²⁺。使Pb²⁺能与未反应的发卡DNA1作用，使得Pb²⁺循环利用，将更多的标记探针DNA2杂交于磁珠表面。通过光二极管诱导化学发光检测化学发光信号，从而实现 Pb²⁺含量的测定。以Pb²⁺浓度为横坐标，化学发光信号强度为纵坐标，绘制标准曲线；测定未知样品的化学发光信号强度，根据标准曲线得到样品中Pb²⁺的含量，从而实现对Pb²⁺进行定量测定。

本发明研制Pb²⁺测定方法具有如下特点：

在足点域杂交作用下，DNA2与G四链体碱基配对，同FITC标记的碱基序列与生成的Pb²⁺-G四链体末端的足点域杂交，Pb²⁺-G四链体结构被破坏，打开G四链体，释放出Pb²⁺的原理，再根据光二极管诱导化学发光建立了一种化学发光测定Pb²⁺的方法。

只需要两条DNA链就建立了Pb²⁺的测定方法，这种设计有着简单、快速的优势。另外，根据实验化学发光信号(图3)可以看出，当本发明的方法用于检测Fe²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Hg²⁺Ag⁺、Cd²⁺和Cu²⁺时，其发光强度远远低于检测Pb²⁺的化学发光信号，说明该方法具有很高的选择性来检测Pb²⁺。因此，本发明涉及的方法在构建检测Pb²⁺的研究方法中体现出良好的发展前景。

具体步骤为：

a磁珠的前期处理。取10μL链霉亲和素修饰的磁珠至1mL离心管中，并用100μL pH8.0的Tris-HCl缓冲溶液清洗两遍；

b发卡DNA的预处理。发卡DNA在使用之前在95℃孵化2min，并逐步降至室温备用；

c发卡DNA1在磁珠表面的固定。将100μL pH 6.8的磷酸缓冲溶液加入到盛有10μL磁珠的1mL离心管中，并加入10μL 1.00×10^-5M生物素修饰的发卡DNA1链，在37℃下振荡反应30min，得发卡DNA1修饰的磁珠，并用磷酸缓冲溶液洗涤3遍，并分散于100μL 的磷酸缓冲溶液中；

d Pb²⁺含量的测定。再加入含Pb²⁺样品，DNA1的发卡结构被打开，并生成Pb²⁺-G四链体的稳定结构，再加入标记探针DNA2链后，在足点域作用下，DNA2与G四链体碱基配对， Pb^{2 +}-G四链体结构被破坏，打开G四链体，释放出Pb²⁺，使Pb²⁺再与未反应的发卡DNA1作用，使得Pb²⁺循环利用，同时标记探针DNA2留在磁珠上，通过光二极管诱导化学发光检测化学发光信号，从而实现Pb²⁺含量的测定。

附图说明

图1为本发明的实验原理图。

图2为Pb²⁺的标准曲线。

图3为检测方法选择性实验结果。

具体实施方式

以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

本发明涉及的一种检测Pb²⁺的化学发光传感器，将链霉亲和素修饰磁珠，以其为捕获载体，捕获发卡DNA1；用FITC标记DNA2为标记探针。当含Pb²⁺样品加入DNA1修饰的磁珠溶液时，形成Pb²⁺-G四链体结构。然后加入标记探针，标记探针与G四链体结合；利用磁分离技术，取磁性分离物，并分散于磷酸缓冲溶液中；该溶液在光二极管诱导下产生化学发光。

本发明是通过以下措施来实现的：一种检测Pb²⁺的制备方法，包括以下步骤：

(1)磁珠的前期处理：

所述磁珠处理，优选的，利用生物素与链霉亲和素作用将生物素修饰的DNA1与磁珠进行反应制备了DNA1-MB。具体过程如下：

(a)取10μL链霉亲和素修饰的磁珠至1mL离心管中，在8000r/min条件下离心10 分钟。

(b)用100μL pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液清洗两遍，并分散到100μL的Tris-HCl缓冲溶液中。

(2)发卡DNA的预处理：

优选的，实验中的发卡DNA在使用之前在95℃下孵化2min，然后，逐步降温至室温。

(3)发卡DNA1在磁珠表面的固定：

优选的，将100μL pH 6.8的磷酸缓冲溶液加入到盛有10μL的磁珠溶液中，并加入10 μL 1.0×10^-5M的生物素修饰的发卡DNA1，在37℃下振荡反应30min，得发卡DNA1 修饰的磁珠，用磷酸缓冲溶液洗涤3遍，并分散于100μL磷酸缓冲溶液中。

(4)Pb²⁺的检测：

优选的，将100μL含有Pb²⁺的样品溶液加入到100μL发卡DNA1修饰的磁珠中。37℃下震荡反应30分钟。然后，加入100μL 1.0×10^-5M的FITC标记的DNA2溶液，37℃下震荡4小时，然后磁性分离，弃去清液，将磁珠用磷酸缓冲溶液洗涤两次，然后将所得磁珠分散于100μL磷酸缓冲溶液中。取200μL pH 11.3，浓度为0.01M的鲁米诺溶液于小烧杯中，并加入上述所得的50μL磁珠溶液。打开光二极管电源，照射15秒后关闭电源，然后测定化学发光强度，根据化学发光强度实现对Pb²⁺的测定。

实施例：一种Pb²⁺含量的测定方法

1.实验部分

1.1仪器与试剂

IFFM-E型流动注射化学发光分析仪(西安瑞迈分析仪器有限公司)；THZ-82A气浴恒温振荡器(全坛市医疗仪器厂)。

化学发光试剂鲁米诺购自阿拉丁试剂公司；链霉亲和素修饰磁珠(优选的，直径2～3μm) 购自天津倍思乐色谱技术开发中心；

所用人工合成DNA序列(购自北京赛百盛生物工程有限公司)如下。

所述的DNA的部分序列为：

DNA1：5’-biotin-ATCCGATCGGATACCCGGGTGGGTGGGTGGGTATCCGA-3’。

DNA2：5-TCGGATACCCACCCACCCACCCG-FITC-3’。

1.2实验步骤

1.2.1磁珠的前期处理：

将生物素修饰的DNA1与磁珠进行反应制备DNA1-MB。具体过程如下：(a)取10μL 链霉亲和素修饰的磁珠至1mL离心管中，8000r/min离心。(b)用100μL pH 8.0的Tris-HCl 缓冲溶液清洗两遍，并分散到100μL的Tris-HCl缓冲溶液中。

1.2.2发卡DNA的预处理：

实验中的发卡DNA在使用之前在95℃下孵化2min，然后，逐步降温至室温。

1.2.3发卡DNA1在磁珠表面的固定：

将100μL pH 6.8的磷酸缓冲溶液加入到盛有10μL的磁珠溶液中，并加入10μL 1.0×10^-5M的生物素修饰的发卡DNA1，在37℃下振荡反应30min，得发卡DNA1修饰的磁珠，用磷酸缓冲溶液洗涤3遍，并分散于100μL磷酸缓冲溶液中。

1.2.4Pb²⁺的检测：

将100μL含有Pb²⁺的样品溶液加入到100μL发卡DNA1修饰的磁珠中。37℃下震荡反应30分钟。然后，加入100μL 1.0×10^-5M的FITC标记的DNA2溶液，37℃下震荡 4小时，然后磁性分离，弃去清液，将磁珠用磷酸缓冲溶液洗涤两次，然后将所得磁珠分散于100μL磷酸缓冲溶液中。取200μL pH 11.3，浓度为0.01M的鲁米诺溶液于小烧杯中，并加入上述所得的50μL磁珠溶液。打开光二极管电源，照射15秒后关闭电源，然后测定化学发光强度，根据化学发光强度实现刀Pb²⁺的测定。

1.3结果与讨论

在优选的条件下，不同浓度Pb²⁺与化学发光信号之间成一定线性关系，得到了检测Pb²⁺的标准曲线、线性范围及线性方程。当Pb²⁺的浓度在1.0×10^-10～1.0×10^-7M之间时，体系的化学发光信号随着Pb²⁺浓度的增大而增大(图2)。线性回归方程为I_CL＝67.437C–31.965(I_CL为体系的化学发光信号；C为Pb²⁺的浓度，10nM；n＝7，R＝0.9979)。该方法检测限为3.0×10^-11 M。对浓度5.0×10^-9M的Pb²⁺进行7次平行重复测定的RSD为4.2％，表明本法有较好的重现性。

选择Fe²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Hg²⁺Ag⁺、Cd²⁺和Cu²⁺作为检测方法对Pb²⁺检测的对比物。如图3所示：将方法检测浓度为2.0×10^-8M Pb²⁺，以及1.0×10^-5M Fe²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Hg²⁺Ag⁺、Cd²⁺和Cu²⁺，并将化学发光信号进行比较。可以看出，检测Fe²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、 Ni²⁺、Hg²⁺Ag⁺、Cd²⁺和Cu²⁺的化学发光信号远远低于检测Pb²⁺的化学发光信号(图3)，说明该化学发光适体传感器具有足够高的选择性来测Pb²⁺。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、代替、组合、简化，较为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种Pb²⁺含量的测定方法，其特征是包括以下步骤：

1.1 磁珠的前期处理，取10μL链霉亲和素修饰的磁珠至1mL离心管中，并用100μL pH8.0的Tris-HCl缓冲溶液清洗两遍；

1.2 发卡DNA1的预处理，发卡DNA1在使用之前在95℃孵化2min，并逐步降至室温备用；

1.3 发卡DNA1在磁珠表面的固定，将100μL pH 6.8的磷酸缓冲溶液加入到盛有10μL磁珠的1mL离心管中，并加入10μL 1.00×10^-5M生物素修饰的发卡DNA1链，在37℃下振荡反应30min，得发卡DNA1修饰的磁珠，并用磷酸缓冲溶液洗涤3遍，并分散于100μL的磷酸缓冲溶液中；

1.4 Pb²⁺含量的测定，再加入含Pb²⁺样品，发卡DNA1的发卡结构被打开，并生成Pb²⁺-G四链体的稳定结构，再加入标记探针DNA2链后，在足点域作用下，DNA2与G四链体碱基配对，Pb²⁺-G四链体结构被破坏，打开G四链体，释放出Pb²⁺，使Pb²⁺再与未反应的发卡DNA1作用，使得Pb²⁺循环利用，同时标记探针DNA2留在磁珠上，通过光二极管诱导化学发光检测化学发光信号，从而实现Pb²⁺含量的测定；具体步骤为，将100μL含有Pb²⁺的样品溶液加入到100μL发卡DNA1修饰的磁珠中；37℃下震荡反应30分钟；然后，加入100μL 1.0×10^-5M的FITC标记的DNA2溶液，37℃下震荡4小时，然后磁性分离，弃去清液，将磁珠用磷酸缓冲溶液洗涤两次，然后将所得磁珠分散于100μL磷酸缓冲溶液中；取200μL pH 11.3，浓度为0.01M的鲁米诺溶液于小烧杯中，并加入上述所得的50μL磁珠溶液；打开光二极管电源，照射15秒后关闭电源，然后测定化学发光强度，根据化学发光强度实现对Pb²⁺的测定；

其中，DNA序列为：

发卡DNA1：5’-biotin-ATCCGATCGGATACCCGGGTGGGTGGGTGGGTATCCGA-3’；

DNA2：5’-TCGGATACCCACCCACCCACCCG-FITC-3’。