CN105037278B - Sirt5调节剂及其筛选方法 - Google Patents

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Abstract

Sirt5，一种线粒体去乙酰化酶，在本发明中其被鉴定具有脱丙二酰和脱琥珀酰活性。基于Sirt5强的酶活性，本发明公开了一种鉴定Sirt5调节剂的方法。特异性的Sirt5调节剂可以被用于Sirt5的生物功能的研究，也可以靶向Sirt5活性用于治疗人类疾病。

Description

Sirt5调节剂及其筛选方法
本申请是申请号为201180043047.0、申请日为2011年7月7日、发明名称为“Sirt5调节剂及其筛选方法”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2011/043130的国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2010年7月7日、申请号为61/362,078的美国临时申请的优先权。
交叉引用美国相关专利申请
本发明要求美国临时专利申请的优先权(申请号：NO.61/362,078，申请日：2010年7月7日)，在此将其作为参考文献整体引用并到本发明中。
关于美国联邦资助研究的说明
本发明得到美国政府的资助，获得NIH基金，合同号为GM086703。因此政府拥有本发明的某些权利。
发明背景
沉默信息调控蛋白2(Sir2)或者叫去乙酰化酶(Sirtuins)，是一个具有辅酶(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)依赖蛋白去乙酰活性的进化保守的酶家族(A.A.Sauve,et al.,Annu.Rev.Biochem.75:435(2006)；S.-i.Imai,et al.,Trends inPharmacological Sciences 31:212(2010)；M.C.Haigis,et al.,Annual Review ofPathology:Mechanisms of Disease 5:253(2010)).自从最初发现sirtuin的去乙酰活性(S.-i.Imai,et al.,Nature 403:795(2000)；K.G.Tanner,et al.,ProcNatl.Acad.Sci.U.S.A.97:14178(2000))，揭示了sirtuins的很多重要的生物功能，并且也很好的理解了NAD依赖的去乙酰机制(S.–i.Imai,et al.,Trends in PharmacologicalSciences 31:212(2010)；M.C.Haigis,et al.,Annual Review of Pathology:Mechanismsof Disease 5:253(2010))。基于序列的相似性，sirtuins被分为不同的类型(R.A.Frye,Biochem,Biophys.Res.Commun.273:793(2000))。哺乳动物有7种sirtuins，Sirts1-7。Sirts1-3属于第一类，Sirt4属于第二类，Sirt5属于第三类，Sirt6和Sirt7属于第四类(R.A.Frye,Biochem.Biophys.Res.Commun.273:793(2000))。
研究sirtuin活性的一个主要障碍在于7种人类sirtuins中的4种(Sirt4-7)要么有非常弱的去乙酰活性，要么没有去乙酰活性(E.Michishita,et al.,Mol.Biol.Cell 16:4623(2005)；M.C.Haigis et al.,Cell 126:941(2006)；A.Schuetz et al.,Structure15:377(2007)；G.Liszt,et al.,J.Biol.Chem.280:21323(2005)；E.Michishita et al.,Nature 452:492(2008))。这对研究Sirtuins和开发调节他们活性的小分子带来了许多困难。比如，由于没有强活性检测方法，所以难以开发以Sirts4-7为靶点的抑制剂或激活剂。也难以确认以Sirt1、Sirt2和Sirt3为靶点的抑制剂或激活剂是否也同样作用于Sirts4-7。
发明概述
Sirt5，一种线粒体去乙酰化酶，被发现是一种有效的脱丙二酰和脱琥珀酰酶。这个发现证明了哺乳动物线粒体蛋白新的翻译后进行修饰的过程，即赖氨酸残基的丙二酰化和琥珀酰化。Sirt5去除线粒体蛋白赖氨酸残基上的戊二酰，丙二酰和琥珀酰基团，这个过程被认为可以可逆的调节线粒体蛋白的活性。由于发现了这个强酶活性，使得能够开发识别Sirt5调节剂的方法。Sirt5特异性的调节剂可被用于研究Sirt5的生物功能和靶向Sirt5活性用于治疗人类疾病。
附图简述
图1：使用AMC-琥珀酰肽来测试Sirt5的荧光实验。
图2A-2D：Sirt5的结构揭示了一个不寻常的酰基袋。(A)Sirt5的酰基袋被CHES的缓冲分子与Arg105和Tyr102相互作用产生的硫酸盐部分占据。所述硫酸酯距离硫代乙酰基团(B)Sirt5-硫代乙酰肽结构和Sir2Tm-乙酰肽结构的对比。(C)理论预测丙二酰/琥珀酰肽可能是Sirt5更好的底物。(D)Sirt5-琥珀酰肽-NAD三重结构表明琥珀酰基团和Tyr102和Arg105的相互作用。
图3A-3F：Sirt5催化的丙二酰和琥珀酰赖氨酸的水解。纯化的去乙酰化酶(Sirt10.75μM或Sirt5 3.3μM)和0.3mM的酰基肽一起孵育，1.0mM NAD加到含有1mM DTT的60μL的20mM Tris-HCl缓冲液中(pH7.5)，在37℃反应2小时。反应用60μL 10％TFA终止。去除沉淀的蛋白后，使用LCMS分析反应混合物。灰色曲线表明酰基肽的质量(乙酰肽，m/z 1274.0；丙二酰肽，m/z 1318.0；琥珀酰肽，m/z1332.0)和脱乙酰肽的质量(m/z 1232.0)的离子峰强度(10x放大)。黑色曲线表明所有从100-2000的质量(总离子数或者TIC)的离子峰强度。对于Sirt1，当H3K9乙酰肽(A)作为底物时可检测出脱乙酰产物，当使用H3K9丙二酰(B)和琥珀酰(C)肽时没有水解产物被检出。对于Sirt5，脱乙酰产物很少被检出(D)，而脱丙二酰(E)和脱琥珀酰(F)产物可以被检出。
图4A-4B：(A)琥珀酰赖氨酸残基存在于牛肝脏线粒体中。使用32P-NAD可以检出Sirt5催化的丙二酰和琥珀酰肽的水解，形成32P标记的O-Ma-ADPR(条带2)和O-Su-ADPR(条带3)。用乙酰肽则没有反应发生(条带1)。当组蛋白被用作乙酰赖氨酸(条带8)或H3K9乙酰肽(条带4)的来源时，Sirt1催化的O-Ac-ADPR的形成可以被检测出来。当用32P-NAD和Sirt5孵育被胰蛋白酶消化的牛肝脏线粒体肽时形成O-Su-ADPR(条带9)，但用Sirt1则不能形成(条带10)，这表明琥珀酰赖氨酸残基存在于牛肝脏线粒体肽提取物中。作为对照组的用BSA肽和Sirt5的反应不会产生O-Su-ADPR(条带12)。CD38能水解NAD产生ADPR，它被用来产生在第13条带上的标准32P-ADPR点。(B)Sirt5的缺失可以增加老鼠肝脏部位的CPS1琥珀酰水平。在野生型或Sirt5敲除的肝脏中免疫沉淀出CPS1，用32P-NAD检测出琥珀酰化水平。合成的乙酰，丙二酰和琥珀酰肽可被用来分别产生对照点O-Ac-ADPR，O-Ma-ADPR和O-Su-ADPR。
图5A-5C：Sirt1和Sirt5催化的H3K9肽(A)脱乙酰化，(B)脱丙二酰化和(C)脱琥珀酰化通过HPLC被检测(检测波长为215nm)。一个更长的HPLC柱被用于更好地分离酰基肽和脱酰基肽。结果进一步表明Sirt1有更好的脱乙酰活性，而Sirt5有更好的脱丙二酰和脱琥珀酰活性。
图6A-6B：(A)表示Sirtuin催化的NAD依赖的脱酰基化反应，这个反应产生O-酰基-ADP-核糖。(B)sirtuin催化的NAD依赖的脱乙酰基化的机理。
图7A-7D：O-丙二酰-ADPR的(A)和O-琥珀酰-ADPR(B)的HPLC纯化及MS确认(C和D)。在A和B中的黑色曲线是Sirt5催化的H3K9酰基肽脱丙二酰化和脱琥珀酰化的HPLC曲线(检测波长为260nm)。用Sirt1孵育的肽没有产生相同的产物(灰色曲线)。O-丙二酰-ADPR(C)和O-琥珀酰-ADPR(D)进一步通过MALDI-MS分析。O-丙二酰-ADPR和O-琥珀酰-ADPR的形成表明Sirt5催化的反应机制和第一类的脱乙酰化酶的脱乙酰化机制相同。
图8：Sirt5催化的脱丙二酰和脱琥珀酰反应。
图9：受保护的硫代琥珀酰赖氨酸化合物的合成，被用于制备H3K9 TSu肽。
图10：AMC-琥珀酰肽的合成。
图11：ISGASE(SuK)-AMC是Sirt5的底物。ISGASE(SuK)-AMC肽在有或没有Sirt5下孵育4小时，然后加1μg胰蛋白酶孵育3小时。与没有Sirt5的阴性对照相比，1，2，和5μM的Sirt5使荧光分别增加11，20，和26倍。
图12：SGASE(SuK)-AMC不是Sirt1，2，和3的底物。ISGASE(SuK)-AMC肽用1μM不同的去乙酰化酶孵育4小时，然后用1μg胰蛋白酶孵育3小时。与没有去乙酰化酶的阴性对照相比，只有使用Sirt5的荧光才增强。
图13：使用荧光底物ISGASE(SuK)-AMC筛选Sirt5抑制剂。没有Sirt5和有Sirt5，但是不加小分子的反应做对照组。所有小分子的浓度为30μM。H3K9 TSu和suramin表现出显著的Sirt5抑制活性。
图14：ISGASE(AcK)-AMC是Sirt2底物。ISGASE(AcK)-AMC肽用1μM不同的去乙酰化酶孵育10小时，然后加入1μg胰蛋白酶孵育3小时。与没有去乙酰化酶的阴性对照相比，Sirt2增强荧光最多，但Sirt5和Sirt3没有显著增强荧光。
图15：使用ISGASE(AcK)-AMC和Sirt2筛选发现H3K9 TSu而不是苏拉明(suramin)是Sirt5特异性的抑制剂。
发明内容
去乙酰化酶(Sirtuins)是一类进化保守的酶，与很多生物功能有关。Sirts1-3被认为有强的脱乙酰活性，但是在本发明公开之前，Sirts4-7没有被发现有强的酶活性。比如，Sirt5的脱乙酰活性弱，其脱乙酰的效力比Sirt1低500倍。
本发明第一次发现Sirt5对丙二酰和琥珀酰肽比对乙酰肽具有更显著的水解活性。进一步说，本发明表明在哺乳动物细胞中存在蛋白赖氨酸琥珀酰化和丙二酰化。另外，在Sirt5敲除的小鼠组织中，观察到CPS1(一个已知的Sirt5靶蛋白)的赖氨酸琥珀酰化水平增高。因此，可以认为Sirt5在体内的主要活性是脱琥珀酰和脱丙二酰，而不是脱乙酰。
本发明的研究者发现了Sirt5的强酶活性，使开发鉴别Sirt5特异性调节剂的方法成为可能。Sirt5特异性调节剂可被用于研究Sirt5的生物功能，可以靶向Sirt5活性用于治疗人类疾病。
Sirt5活性
本发明中使用的“Sirt5活性”包括酶去除赖氨酸残基上的酰基(丙二酰，琥珀酰，戊二酰和乙酰)。所以，Sirt5活性包括赖氨酸残基的脱丙二酰，脱琥珀酰，脱戊二酰和脱乙酰。
在本发明的一些实施例中，公开了Sirt5独特的脱琥珀酰和脱丙二酰活性。“Sirt5脱琥珀酰活性”是指Sirt5酶去除赖氨酸残基上的琥珀酰基。“Sirt5脱丙二酰活性”是指Sirt5酶去除赖氨酸残基上的丙二酰基。
Sirt5能作用于孤立的带有酰基的赖氨酸残基，或者是作用于在肽或蛋白中的酰基化的赖氨酸残基。Sirt5活性，比如，脱琥珀酰和脱丙二酰活性可以发生在体内作为对含有琥珀酰或丙二酰赖氨酸的蛋白翻译后进行修饰，使得下游生理反应的产生。
“Sirt5调节剂”或“Sirt5调控剂”或“Sirt5调控化合物”是可以激活或抑制Sirt5活性的底物。“Sirt5抑制剂”是可以降低或阻止Sirt5活性的底物。“Sirt5激活剂”是可以提高或促进Sirt5活性的底物。
检测Sirt5活性的方法
一方面，本发明公开了一种在样本中检测Sirt5脱丙二酰，脱琥珀酰或脱戊二酰活性水平的实验。
上述实验基于含有丙二酰，琥珀酰，或戊二酰赖氨酸的底物。所述赖氨酸连接指示剂部分，所述赖氨酸和指示剂部分间的连接可以被裂解剂裂解，所述裂解剂对赖氨酸残基的丙二酰化，琥珀酰化或戊二酰化状态敏感。因此，当所述底物在能被Sirt脱丙二酰化，脱琥珀酰化或脱戊二酰化的环境下与Sirt5接触时，酰基的去除(可能导致裂解部位的暴露)允许裂解剂作用于裂解部位，然后释放指示剂部分，产生可检测的信号。
用于在实验中检测Sirt5活性的合适底物可以是任何含有琥珀酰，丙二酰或戊二酰赖氨酸残基的分子，包括孤立的赖氨酸残基或者是含有赖氨酸的肽。在具体的实施例中，用于实验的底物是含有琥珀酰或丙二酰赖氨酸残基的肽，并连接有指示剂部分。
本发明所使用的术语“肽”包括通过肽键相连的2个或者更多氨基酸。对肽的链长没有特别限制。所述肽链短到可以是4到5个氨基酸，也可以长到50个氨基酸或者更长。在一些实施例中，被用于方法的肽的长度是15到25个氨基酸。除了肽一般在C端包括琥珀酰，丙二酰或戊二酰赖氨酸外，对肽的氨基酸序列也没有特别的限制。优选的，所述肽底物在丙二酰或琥珀酰赖氨酸残基之前没有赖氨酸或者精氨酸残基，这样一旦去除琥珀酰或丙二酰基，在琥珀酰或丙二酰赖氨酸和指示剂部分间的连接(比如酰氨键)可以被裂解剂有效地作用。在一个具体实施例中，所述肽链具有序列异亮氨酸-丝氨酸-甘氨酸-丙氨酸-丝氨酸-谷氨酸-赖氨酸(ISGASEK,SEQ ID NO:1)，其中所述的赖氨酸是酰化的(琥珀酰化，丙二酰化或戊二酰化)。
不管是孤立的还是作为肽的一部分，所述丙二酰，琥珀酰或戊二酰赖氨酸和指示剂部分连接。所述连接是共价连接，在赖氨酸的酰基被去除后可以被裂解剂裂解。比如，所述共价连接是一个酰胺键，形成于丙二酰，琥珀酰或戊二酰赖氨酸羧基和指示剂化合物的氨基之间，在赖氨酸的酰基被去除后(比如，导致所述肽键向蛋白水解酶暴露)易被蛋白水解酶裂解。
所述裂解剂可以是任何能可预见性地裂解在特定氨基酸残基之间肽的试剂(比如蛋白水解的裂解方式)，但是在赖氨酸被琥珀酰化，丙二酰化或者戊二酰化时不能裂解肽键。如一个实施例所述，裂解剂是蛋白水解酶，比如可以水解肽键的酶(也指肽酶)。所述的蛋白水解酶包括但不限于胰蛋白酶，钙蛋白酶，赖氨酰肽链内切酶，赖氨酸-C蛋白内切酶，金属肽链内切酶，血纤维蛋白溶酶，羧肽酶，胰凝乳蛋白酶，V8蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，凝血酶，弹性蛋白酶，gluc-C,endo lys-C或者蛋白酶K，半胱天冬酶-1，半胱天冬酶-2，半胱天冬酶-3，半胱天冬酶-4，半胱天冬酶-5，半胱天冬酶-6，半胱天冬酶-7，半胱天冬酶-8，MetAP-2，腺病毒蛋白酶，HIV蛋白酶等。
在一个具体的实施例中，所述裂解剂是胰蛋白酶。胰蛋白酶水解肽键，所述肽键的羧基来自赖氨酸和精氨酸残基；因此，胰蛋白酶可以裂解Sirt5底物的赖氨酸残基的羧基末端的肽。另外一种合适的裂解剂是胃蛋白酶，它能水解在丙基苯氨酸，色氨酸和酪氨酸残基的氨基末端的肽键。因此，所述胃蛋白酶可以裂解赖氨酸残基和邻近的丙基苯氨酸，色氨酸或酪氨酸残基之间的底物肽。
在这些实验中，Sirt5酶活性是通过蛋白水解消化，用裂解剂从肽上裂解指示剂部分，产生一个可检测的信号。
“指示剂部分”是能检测到Sirt5活性的分子或Sirt5底物的组分。指示剂部分或许可以是，比如，荧光或其他标记分子，比如7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)，FLAG，或聚组氨酸抗体标签。在具体实施例中，所述指示剂部分具有荧光性质。
在一个实施例中，所述指示剂部分是单独的荧光小分子或荧光团。所述“荧光团”是指能引起分子发出荧光的分子组分。它是分子中的功能性基团，能吸收特定波长的能量，并再以特定波长发射能量。通常的荧光团是异硫氰酸酯的荧光素(FITC)，罗丹明的衍生物(TRITC)，香豆素，芘，青色素，马来酰亚胺的衍生物染料，CF染料，荧光探针染料，DyLightFluors，Oyester染料，Atto染料，HiLyte Fluors，萤光素和Alexa Fluors。荧光素酶，比如萤火虫荧光素，当用萤火虫荧光素酶和ATP孵育时可以发光。所发射的光可被用于检测Sirt5活性。
在本发明的一些实施例中，所使用的荧光团产生的荧光强度或者发射波长会随着荧光团和肽之间连接的存在或消失而变化，而且所述荧光强度或发射波长的改变可以被荧光分光光度计检测出来。在一个实施例中，所述指示剂部分是氨基甲基香豆素。在一个优选的实施例中，所述指示剂部分是7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)。因此，Sirt5脱琥珀酰活性的荧光底物的一个优选的例子是AMC-琥珀酰肽，比如，ISGASE(SuK)-AMC(其中SuK代表琥珀酰赖氨酸)，来自谷氨酸脱氢酶的肽序列。相似的，Sirt5脱丙二酰活性的荧光底物的一个例子是AMC-丙二酰肽，比如ISGASE(MaK)-AMC(其中MaK代表丙二酰赖氨酸)。
在另一个实施例中，所使用的荧光团产生的荧光强度或者发射波长不必须随着荧光团和肽之间连接的存在或消失而变化，但是，底物肽也被淬火基团标记。比如，所述荧光团可以和酰化赖氨酸肽的羧基末端相连，而所述淬火基团可以和含有酰化赖氨酸的肽链中的不同氨基酸相连。由于底物中存在淬火基团，这些底物的荧光强度较弱。但是，当裂解剂把所述肽赖氨酸残基的C末端裂解时，所述荧光强度提高。这个可以检测裂解的底物肽的量。本发明中适宜的淬火基团包括DNP，Black Hole QuencherTM部分，和DABCYL。
另外一个实施例中，所述指示剂部分是荧光小分子或荧光团，且属于供体-受体对荧光团对中的一个。在这个实施例中，所述指示剂荧光团连接于酰化赖氨酸肽的羧基末端(在“FRET”实施例中所述肽典型地包括在酰化赖氨酸的C末端有一个或多个氨基酸)，供体-受体对荧光团对中的另一个分子位于附近，比如与所述肽底物的另一个氨基酸相连。因此，在赖氨酸和指示剂部分之间的连接被裂解之前，所述邻近的供体-受体荧光团从供体和受体间进行能量转移，所述能量转移可以被FRET检测。荧光共振能量转移(FRET)是一个非辐射性的途径，在电子激发状态的分子通过FRET可以释放能量返回到更稳定的基态。所述能量的转移发生于偶极-偶极相互作用的空间：如果两荧光团处于合适的距离，能量能从激发态分子(供体荧光团)转移到邻近的分子(受体荧光团)。在这个实施例中，Sirt5作用后，蛋白水解作用导致荧光团对中的一个分子对从底物上释放，使得荧光团分离，降低了FRET信号强度，这与Sirt5活性具有相关性。
为完成检测Sirt5活性实验，首先将含有Sirt5的样品与本发明所述合适的底物接触，并在合适的条件下孵育。所述“样品”是指任何含有纯化，部分纯化或没有纯化的目标Sirt5，而且可以是从细胞或组织中的溶解产物，或者Sirt5蛋白的产物(纯化自细胞或组织或者是重组的表达系统)。在Sirt5样品和底物的孵育阶段后，将裂解剂同合适的反应缓冲液加入反应中。在第二次孵育阶段以后，用水或其它中性pH缓冲液稀释，使用荧光检测器在对所用荧光团所适宜的激发和检测波长下记录荧光。所述的信号强度与Sirt5具有相关性。
所述实验可以在微型板中进行。比如，将底物肽加到反应缓冲液中，随后将溶液加入到可用于检测荧光的微型板的孔中，将板孵育。随后，将一小份Sirt5样品加入每个孔中，在给定的时间内去酰化。然后，将一小份蛋白水解酶和合适的反应缓冲液加入到每个孔，使用荧光酶标仪定时检测所述溶液的荧光强度。
在一些实施例中，为避免与预测的Sirt5酶活性相关的底物肽不足，在实验中使用过量的底物肽。优选的，为了在普通的生物样品中检测Sirt5活性，比如细胞核的提取物，在反应中底物的浓度通常是1到200μM，更优选的，20到50μM。另一方面，所述裂解剂的浓度可以主要根据所用底物肽的量进行调整。通常，所述裂解剂的量根据预测产生底物肽的数量而调整，使在给定的条件下实现所述底物肽的充分裂解。优选的，所述裂解剂活性要能够保证，比如即使所有使用的底物肽都脱乙酰化，都可以被裂解剂裂解时，在反应给定的实验条件下在反应孵育中肽被充分裂解。优选的，当底物肽以0.01到1mM浓度被用于反应时，所用的胰蛋白酶数量，比如，每60μl反应液中通常为0.2到5μg。更优选的，为每60μl反应液中1到2μg。
关于第一个反应(Sirt5引起的脱酰基化)，反应的pH可以考虑选择Sirt5适宜的pH值。例如，所述pH通常可以调整到6.0到8.5，优选的，pH 6.8到8.5。反应缓冲液可以从能够提供上述给定的pH的缓冲液中进行选择。例如，Tris-HCl，Hepes-KOH，等可以被用于本发明的方法中。更优选的，例如，可以使用20mM Tris-HCl，pH 7.4。NAD是Sirt5需要的共同底物，通常使用的浓度为0.5mM。优选的，在反应液中加盐和防腐剂。例如，往反应中加1mM二硫苏糖醇(DTT)。第一个反应(Sirt5引起的脱酰基化)在35-40℃之间孵育2-20小时。优选的孵育条件包括，例如，在37℃下，于含有NAD(0.5mM)和DTT(1mM)的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4,20mM)中孵育含有Sirt5的样品和底物的液体混合物4小时。
使用裂解剂进行第二个反应，所述裂解剂和合适的反应缓冲液加入反应中。例如，胰蛋白酶(1μg)和CaCl2(1mM)加入到反应中，在37℃下孵育大约3小时。
胰蛋白酶孵育后，用水或其它中性的pH缓冲液稀释反应，使用荧光检测器在对所用荧光团所适宜的激发和检测波长下记录荧光。所述的信号强度与Sirt5活性具有相关性。筛选SIRT5调节剂的方法
另一方面，本发明提供了一种筛选Sirt5脱丙二酰，脱琥珀酰或脱戊二酰活性的调节剂的方法。
所述筛选方法主要基于前面描述的评价Sirt5活性的实验，除了在有候选化合物或者没有候选化合物的情况下进行实验。
与没有候选化合物时的Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性相比，在存在候选化合物时，如果Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性减弱，此候选化合物被鉴定为Sirt5抑制剂。在存在候选化合物时，与没有候选化合物时的Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性相比，如果Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性增强，此候选化合物被鉴定为Sirt5激活剂。
在所述筛选方法中被使用的测试化合物包括，例如，合成或重组的肽；低分子量的合成化合物(小分子)；来源于动物，植物或细菌的细胞提取物；细胞培养上清液。
脱丙二酰化或脱琥珀酰化实验和脱乙酰化实验联合使用来提高特异性
如上所述的筛选Sirt5调节剂的实验可以包括一个补充的第二步脱乙酰活性的实验，用来鉴别化合物可以调节Sirt5但不能调节Sirts1-3或其它有脱乙酰活性的去乙酰化酶。在这个第二部分实验中，例如，使用AMC-乙酰肽来鉴定被确认为是Sirt5调节剂的化合物其调节Sirts1/2/3的能力。在一个具体的实施例中，AMC-乙酰肽是ISGASE(AcK)-AMC肽，其中AcK是乙酰赖氨酸。通过使用底物ISGASE(AcK)-AMC和Sirts1-3任意一个，对被确认为是Sirt5调节剂的化合物进一步进行测试。在第二部分实验中，化合物被发现可以调节Sirt5活性，也可以调节Sirts1-3任意一个活性，则其不被认为是Sirt5特异性调节剂。然而，一个化合物被发现可以调节Sirt5活性，但不能调节Sirts1-3任意一个活性，其被认为是Sirt5特异性调节剂。因此，例如，使用AMC-琥珀酰肽的Sirt5实验，联合使用AMC-乙酰肽的Sirt1/2/3实验，能用来筛选选择性调节Sirt5活性的化合物。
所有实验都可以微型化，自动化以便用于高通量分析。所述实验能在一个或多个分离的容器中进行；但是，本发明公开的实验的一个优点在于，能在一个容器中进行，比如，微型板孔，其使用容易而且可以自动操作。如果需要的话，所述底物可以选择性地固定化在固体介质上，比如通过生物素-链霉亲和素连接。
本发明描述的合成底物的方法为现有技术。例如，在后续实施例中会描述在上述公开的荧光实验中所用底物的合成方法。
其它的检测方法
本发明提供了另一个检测方法是质谱检测。这个实验中，Sirt5的活性是通过和Sirt5接触后，测定底物肽的质量来鉴别的。比较起始物质(琥珀酰，丙二酰或戊二酰肽)和产物(比如脱琥珀酰，脱丙二酰或脱戊二酰肽)的数量，这与底物上的Sirt5活性的量相关。在这个实验中，产物的增加表明有Sirt5活性，产物很少或没有产物则表明Sirt5活性很小或没有活性。
通过使用质谱实验，候选化合物可以如下被鉴定为Sirt5抑制剂或Sirt5激动剂。相对于没有候选化合物时产生的产物，当存在候选化合物时，产物减少(比如，脱琥珀酰化，脱丙二酰化，或脱戊二酰化肽)，则候选化合物被鉴别为Sirt5抑制剂。相对于没有候选化合物时产生的产物，当存在候选化合物时，产物增加(比如，脱琥珀酰化，脱丙二酰化，或脱戊二酰化肽)，则候选化合物被鉴别为Sirt5激动剂。存在和不存在有调节作用的化合物产生的活性的差异应该至少是20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，200％，300％，400％，500％或更多。
IC50和EC50
候选化合物抑制Sirt5活性的能力可以通过确定其IC50来表示。候选化合物激活Sirt5活性的能力可以通过确定其EC50来表示。本发明所使用的“IC50”或者“一半最大抑制浓度”是表示抑制一半的活性所需的化合物的量。可以通过构建剂量响应曲线，检测不同浓度的化合物在降低或阻止酶活作用来确定化合物的IC50。对于一个给定的抑制剂，IC50可以通过测定抑制一半最大酶活所需的浓度来计算。所述浓度的检测一般会形成S形曲线，即在浓度相对较小的改变会造成快速增加。随着浓度增加效力减慢的点即为IC50。根据现有技术所知，可以通过对最佳拟合线求导来从数学上确定这个点。
本发明进一步所使用的，“EC50”或“一半最大有效浓度”是指引起基线和最大活性之间的中点的强度反应时的化合物浓度。因此，递增的剂量响应曲线的EC50表示其达到最大作用50％时的化合物的浓度。
优选的，本发明Sirt5抑制剂抑制Sirt5的活性的IC50小于或等于5μM。更优选的，Sirt5抑制剂抑制Sirt5脱丙二酰化和脱琥珀酰化的活性的IC50小于或等于5μM，而且抑制Sirts1-3脱乙酰活性的IC50大于或等于100μM。化合物抑制Sirt5脱丙二酰化和脱琥珀酰化的活性的IC50小于或等于5μM，而且抑制Sirts1-3脱乙酰活性的IC50大于或等于100μM，则被认为是Sirt5特异性抑制剂。
本发明Sirt5激动剂优选地激活Sirt5的活性的EC50小于或等于5μM。更优选地，Sirt5激活剂激活Sirt5脱丙二酰化和脱琥珀酰化的活性的EC50小于或等于5μM，而且激活Sirts1-3脱乙酰活性的EC50大于或等于100μM。化合物激活Sirt5脱丙二酰化和脱琥珀酰化的活性的EC50小于或等于5μM，而且激活Sirts1-3脱乙酰活性的EC50大于或等于100μM，则被认为是Sirt5特异性激动剂。
可用于开展实验的试剂盒
另一方面，本发明提供了一种检测样品中Sirt5活性的试剂盒，可筛选上述抑制或增强Sirt5活性的化合物。所述试剂盒包括含有上述酰化赖氨酸的底物肽。
一个实施例提供了一种检测Sirt5活性的试剂盒，包括：(a)底物肽；(b)裂解剂，它裂解底物肽的活性会随着底物肽的酰化水平的变化而变化。
另一个实施例提供了一种能筛选抑制或提高Sirt5活性的化合物的试剂盒，包括：(a)底物肽；(b)Sirt5；(c)裂解剂，它裂解底物肽的活性会随着底物肽的酰化水平的变化而变化。通常，每个组分，(a)底物肽，(b)Sirt5，和(c)裂解剂是分开包装的。
本发明中的试剂盒分开的组分通过组合实现最终适合反应的浓度。进一步说，除了上述组分，所述试剂盒还可以包括提供合适反应条件的缓冲液。酶制剂和底物肽可以和其它稳定蛋白的组分组合在一起。例如，优选的在制备液中加入使最终浓度是1％的BSA和多元醇，比如蔗糖和果糖，其最终浓度达0.2到10％，优选的，1％，作为防止蛋白在冻干后失活的成分。根据本发明所述试剂盒的每个组分可以是液体或干燥形式。本领域中常用的洗涤剂，防腐剂，缓冲液等，可以加到上述组分中，只要他们不会阻碍脱酰化活性的检测。
候选抑制剂的合成
硫代琥珀酰和硫代丙二酰肽通过形成停滞的共价中间体抑制Sirt5脱琥珀酰和脱丙二酰活性。所述硫代琥珀酰和硫代丙二酰肽参与Sirt5催化反应的第一步，形成不能进一步反应的共价中间体。因为其它去乙酰化酶不能识别琥珀酰和丙二酰赖氨酸肽，所以硫代琥珀酰和硫代丙二酰肽是Sirt5特异性抑制剂。
在一个实施例中，所述候选化合物是小分子。所述的“小分子”是指小分子有机化合物，比如，杂环，肽，糖类，甾体之类的。优选的，所述小分子调节剂的分子量小于1500道尔顿，1000道尔顿,，800道尔顿，或者甚至小于500道尔顿。所述化合物可以被修饰以提高其性质，比如有效性，稳定性或者药学上的兼容性。在一个具体的实施例中，所述Sirt5抑制剂是H3K9硫代琥珀酰(H3K9 TSu)肽。硫代琥珀酰优选于硫代丙二酰是因为琥珀酰赖氨酸比丙二酰赖氨酸具有更低的对Sirt5的Km值。
SIRT5特异性抑制剂
本发明提供了抑制Sirt5脱琥珀酰或脱丙二酰活性的化合物。所述Sirt5抑制剂被描述具有下列通式：
在通式(1)中，R1是负电荷(比如，阴离子)或可电离基团。负电荷或可电离基团的例子包括羧酸盐(-COO-)，羧基(-COOH)，硫代羧酸盐(-CSO-)，磺酸盐(-SO3 -)，磷酸盐(-PO3 2-)，和硝基(-NO2)。所述R2选自S，NR5，和O，其中，R5是氢原子(H)或含有1到7个碳原子的烃基(比如，甲基，乙基，异丙基，苯基或苄基)。所述基团X0，X1，X2，X3，X4，X5，X6和X7独立的选自–(CH2)n–(其中n代表1，2，或3)，-NR5-，-O-，-S-，或键，条件是X0-X4中至少一个不是键，并且X5-X7中至少一个不是键。通常，X5，X6和X7是-CH2-基团或键，条件是X5-X7中至少一个不是键。经常地，X0-X3中至少一个，二个，三个或所有四个都是-CH2-基团，而X4选自-CH2-，-NR5-，-O-，或-S-基团。在具体实施例中，X0-X3所有四个都是-CH2-基团，但X4选自-CH2-，-NR5-，-O-，或-S-基团，并且X5-X7是-CH2-基团或键，条件是X5-X7至少一个不是键。R3和R4基团独立的选自H，烃(R)，氨基酸，二肽，三肽，寡肽(比如，从4，5，6，8，10，12或15个氨基酸残基到20，25，30，35，40，45或50个氨基酸残基)，蛋白质，核碱基，核苷酸，二核苷酸，三核苷酸，寡核苷酸，单糖，二糖，寡糖，和保护基团(比如tBOC或FMOC基团)，或它们的组合物，或它们的修饰形式(比如，脂蛋白或核蛋白)，其中R4也可以是-OR，-NHR或-NC(O)R基团，并且R3也可以是-C(O)R或-C(O)NHR基团。通常，当R1是羧基时，R2不是O，当R2是O时，R1不是羧基。
在通式(1)的特别实施例中，R2是S，所以产生了下述化合物的亚通式：
在通式(1)的其它特别实施例中，R2是S，R1是羧基，所以产生了下述化合物的亚通式：
在通式(1)的其它特别实施例中，R2是S，R1是羧基，并且X4是-NR5-，所以产生了下述化合物的亚通式：
在通式(1c)中，X0-X3优选自–(CH2)n–基团(其中n代表1，2，或3)或键，其中X0-X3至少一个不是键；X5-X7优选自-CH2-基团或键，并且X5-X7至少一个不是键。在一个具体的实施例中，X0-X3所有四个都是-CH2-基团，并且X5-X7是CH2-基团或键，条件是X5-X7至少一个不是键。
在通式(1)中，双键基团R2可以选择性地被两个单键基团(R5和R6)取代，如下通式所示：
在通式(2)中，R5和R6独立的选自H，含有1-6个碳原子的烃基(R)，OH，OR，SH，SR，和NHR，也有例外，通常，R5和R6不都选自OH，OR，SH，SR，和NHR(比如，如果R5和R6的其中一个是OH，OR，SH，SR，或NHR，那么R5和R6的另一个是H或R)。在一些实施例中，当R5和R6的其中一个是OH或OR基团时，那么R1不是羧基基团。
本发明中使用的术语“烃基”和“烃基连接”，在第一个实施例中，是仅由碳和氢组成的。在不同的实施例中，一个或多个烃基或连接可以精确地包括，或者是最少量的，或者是最大量的，比如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，或18个碳原子，或者在任何前述碳原子数量之间的碳原子的特别范围内。
比如，所述烃基或者连接可以是饱和的直链(比如，直链烷基或亚烃基的连接)。直链烷基基团(或亚烃基连接)的一些例子包括甲基(或亚甲基，比如，-CH2-，或次甲基连接)，乙基(或乙烯或二甲亚基，如-CH2CH2-连接)，n-丙基，n-丁基，n-戊基，和n-己基基团。
所述烃基或者连接选择性可以是饱和的和支链的(比如，支链烷基或亚烃基连接)。支链烷基的一些例子包括异丙基，异丁基，sec-丁基，t-丁基，异戊基，新戊基，2-甲基戊基，和3-甲基戊基。支链亚烃基连接是从上述典型的支链烷基中去除氢原子获得的(比如，异丙烯，-CH(CH3)CH2-)。
所述烃基或者连接可以选择性地是饱和的和环状的(比如，环烷基或环亚烃基连接)。环烷基的一些例子包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基，和环庚基。所述环烷基也可以是多环的(比如二环)基团，在两环(比如二环己基)之间通过键相连或者共用(比如，稠合的)边(比如，十氢化萘和降莰烷)。所述环亚烃基连接是那些从上述典型的环烷基中去除氢原子获得的。
所述烃基或者连接可以选择性地是不饱和的和直链的(比如，直链烯族或烯基或连接)。不饱和现象是通过一个或多个碳碳双键和/或一个或多个碳碳三键的存在而发生。直链烯基的一些例子包括乙烯基，2-丙烯-1-yl(烯丙基)，3-丁烯-1-yl，2-丁烯-1-yl，丁二烯基，4-戊烯基-1-yl，3-戊烯基-1-yl，2-戊烯基-1-yl，2,4-戊二烯基-1-yl，5-己烯基-1-yl，4-己烯基-1-yl，3-己烯基-1-yl，3,5-己二烯基-1-yl，1,3,5-己三烯基-1-yl，6-戊烯基-1-yl，乙炔基，和炔丙基(2-丙炔基)。直链烯基连接的一些例子是这些从上述典型的直链烯基(比如，次亚乙烯基，-CH＝CH-，或亚乙烯基)中去除氢原子获得的。
所述烃基或者连接可以选择性是不饱和的和支链的(比如，支链烯族或烯基或连接)。支链烯基的一些例子包括2-丙烯-2-yl，3-丁烯-2-yl，3-丁烯-3-yl，4-戊烯基-2-yl，4-戊烯基-3-yl，3-戊烯基-2-yl，3-戊烯基-3-yl和2,4-戊二烯基-3-yl。支链烯基连接的一些例子是这些从上述典型的支链烯基中去除氢原子获得的。
所述烃基或者连接可以选择性地是不饱和的和环状的(比如，环烯基或环烯基连接)。不饱和的和环状的烃基一些例子包括环丙烯基，环丁烯基，环戊烯基，环戊二烯基，环己烯基，环己二烯基，苯基和苄基。所述不饱和的环状烃基也可以是多环的(比如二环)基团，在两个环状基团之间通过键相连(比如二苯基)或者共用(比如，稠合的)边(比如，萘，蒽，菲，萉和茚)。所述环烯烃基连接是那些从上述典型的环烯基(亚苯基，和二亚苯基)中去除氢原子获得的。
在一些实施例中，一个或多个烃基或者连接也可以包括一个或多个杂原子(比如，非碳和非氢原子)，比如一个或多个杂原子选自氧，氮，硫，卤，和磷原子。含氧基团的一些例子包括羟基(OH)，羰基(比如，酮，醛，酯，酰胺，或尿素官能团)，和碳-氧-碳(醚)基团。所述醚基也可以是聚环氧烷基团，比如，聚环氧乙烷基团。含氮基团的一些例子包括伯氨基，仲氨基，叔氨基，季氨基，氰化物官能团，酰胺基团(如前所述，比如，-C(O)NR2，其中，R独立地选自氢原子和烃基)，硝基，尿素官能团，亚氨基和氨基甲酸酯，其中，应理解，所述季氨基必需带有正电荷和需要抗衡离子。含硫基团的一些例子包括巯基(比如，-SH)，硫醚(比如，硫化物)，二硫化物，亚砜，砜，磺酸酯，硫酸盐基团。本发明考虑的卤原子包括氟，氯，溴。
在一个具体实施例中，所述候选化合物是硫代琥珀酰化合物，一个优选的实施例中，候选化合物是H3K9硫代琥珀酰肽。
上述抑制剂化合物的合成依赖于已建立的众所周知的方法。例如，将丙二酸和琥珀酸连接到赖氨酸的侧链，可以使用从胺和羧酸合成酰胺化合物的众所周知的反应条件。从羰基氧原子(例如，R2)到硫代羰基的转化，可以通过，例如，使用众所周知的方法与Lawensson试剂的反应。
组合物
任何在这里描述的Sirt5调节化合物，可以被制备或修饰成具有更利于给哺乳动物给药的特性，例如改进稳定性，细胞渗透能力，等等。例如，为了增强底物细胞的渗透性，肽链可以包含一串多个氨基酸(例如8-10精氨酸残基)。
可以使用一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂，把这里描述的Sirt5调节化合物用常规方法制成制剂。例如，Sirt5调节化合物和它们生理学上可接受的盐和溶剂化物可以制成适用于不同按给药方式的制剂，例如，注射(如SubQ,IM,IP,IV)，吸入或吹入(通过嘴或鼻子)或者口服，口腔，舌下，透皮，鼻腔，肠道外或者直肠给药。在一个具体实施例中，Sirt5调节化合物可以局部施用于靶向细胞部位，比如，在一个特定的组织，器官，液体(如血液，脑脊髓液等)。调节Sirt5的化合物可以被制备成多种给药方式使用，包括全身和外用或局部使用。一般的技术和配方可以在雷明登氏药学全书中找到，Meade出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州。
所述药物组合物(包括化妆品制剂)可能包含一个或多个所述的Sirt5调节化合物，重量占比约为0.00001到100％，例如从0.001到10％或者从0.1％到5％。在某些外用制剂中，活性成分在配方中约占重量的0.25％到75％，优选地在配方中约占重量的0.25％到30％，更优选地在配方中约占重量的范围为0.5％到15％，最最优选地在配方中约占重量的1％到10％。
所述Sirt5调节化合物的毒性和治疗效果可以通过细胞培养或动物实验的标准药学方法来确定。LD50是使50％人数致死的剂量。毒性和治疗效果(LD50/ED50)之间剂量的比率是治疗指数。优选表现出大治疗指数的Sirt5调节化合物。存在毒副作用的调节Sirt5的化合物也可以使用，但应该要小心设计一个传递系统，目标是使所述化合物到达靶组织，以尽量减少未感染细胞的潜在损伤，从而减少副作用。
从细胞培养实验和动物研究所得到的数据可以用来确定用于人类的制剂的剂量范围。这种化合物剂量可以在低或无毒性的ED50的循环浓度范围内。剂量可以根据剂型和给药途径在范围内改变。任何化合物的有效治疗剂量可以从细胞培养实验来初步估计。制成制剂在动物模型中使用以获得循环血浆浓度的范围，包括在细胞培养中测定的IC50。这些信息可以用于更准确地确定对人类有用的剂量。血浆中的水平可以被检测，例如，用高效液相色谱法。
治疗方法/治疗条件
本发明进一步提供了治疗或预防异常的Sirt5脱琥珀酰或脱丙二酰活性引起的紊乱的方法。这种方法是基于对对象给予有效量的Sirt5调节剂以治疗或预防紊乱。在某些方面，本发明提供了用于调节Sirt5活性的方法及其使用的方法。
在某些实施例中，本发明提供了使用Sirt5抑制剂或激动剂的方法。Sirt5抑制剂可以用于多种治疗应用，包括，例如增加细胞的寿命，并治疗或预防疾病和紊乱。所述疾病或紊乱包括，例如和老龄化或压力相关的疾病或紊乱，糖尿病，肥胖，神经元退行性变疾病，心血管疾病，凝血障碍，炎症，癌症，和/或面部发红，等。所述方法包括给予需要治疗的患者有效药物剂量的上述Sirt5抑制剂。
在一些实施例中，本发明所述的Sirt5调节化合物可以单独使用或与其他化合物联合使用。在一个实施例中，2种或更多Sirt5调节化合物的混合物可以在需要时给予服药对象。在另一个实施例中，一种或更多种Sirt5调节化合物可以与一种或多种用来治疗或预防多种疾病的治疗药物一起给药，这些疾病包括，例如，癌症，糖尿病，神经元退行性变疾病，心血管疾病，凝血障碍，炎症，面部发红，肥胖，老化，紧张，等等。
在许多实施例中，含Sirt5调节化合物的联合治疗可以是(1)含一种或多种Sirt5调节化合物与一种或多种治疗剂(例如一个或更多本发明所述的治疗剂)的药物组合物；和(2)一种或多种Sirt5调节化合物调和一种或多种治疗剂联合给药，其中，所述Sirt5调节化合物和治疗剂不在同一个制剂组合物中(但是，可能在同一个盒子或包装中，例如吸塑包装或多室包装；可以被使用者分开的连接，连接的单独密封容器(例如铝箔袋)；或Sirt5调节化合物和其它治疗剂分开在不同容器的试剂盒)。当使用分离制剂时，Sirt5调节化合物可以与其他治疗剂同时，间歇性，交错，前，后，或组合进行给药。
发明详述
实施例1
试剂和仪器
试剂购自Aldrich或Acros，购买可能获得的最高纯度的试剂，以购买时的形式使用。1H NMR，13C NMR和2D NMR是在INOVA 500光谱仪上测试的。NMR数据通过MestReNova(版本5.2.5)分析。LCMS的使用条件是SHIMADZU LCMS-QP8000α，使用Sprite TARGA C18色谱柱(40×2.1mm，5μm，Higgins Analytical，Inc.，Mountain View，CA)，检测波长是215和260nm。LCMS所用的溶剂为含有0.1％甲酸的水和含有0.1％甲酸的乙腈。
Fmoc-赖氨酸(丁基-丙二酰基)-OH和Fmoc-赖氨酸(丁基-琥珀酰基)-OH的合成
在无水的N,-N’-二甲基甲酰胺(DMF,2.0mL)中的单取代-丁基-丙二酸酯(480mg,3.0mmol)或单取代-丁基-琥珀酸酯(522.0mg,3mmol)被加到N-羟基琥珀酰亚胺(334mg,2.9mmol)中，在室温下搅拌。然后将含有N,N’-二环己基碳二亚胺(598mg,2.9mmol)的无水DMF(3.0mL)加入到反应液中。搅拌2小时后，过滤反应混合物。将滤出液在室温下加到含有Fmoc-赖氨酸-OH(736mg,2.0mmol)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA,1.0mL,5.8mmol)的无水DMF(2.0mL)溶液中。将混合物再搅拌半小时。在上述混合物中加入10mL水和6mL 1M HCl调节pH至2-3。上述混合物用100mL乙酸乙酯萃取三次，然后用50mL盐水洗涤两次。有机层用无水硫酸钠干燥。蒸空除去溶剂后，残留物用10:1CH2Cl2:CH3OH的硅胶板纯化，得到产率90％的目标产物。
Fmoc-赖氨酸(丁基-丙二酰基)-OH。1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ8.01(t,1H,J＝5.5Hz),7.89(d,2H,J＝7.0Hz),7.73(dd,2H,J＝2.0,7.0Hz),7.46(d,1H,J＝7.0Hz),7.41(t,2H,J＝7.5Hz),7.33(t,2H,J＝7.8Hz),4.27(m,2H),4.23(m,1H),3.87(dt,1H,J＝4.5,8.5Hz),3.07(s,2H),3.03(m,2H),1.65(m,2H),1.39(m,2H),1.38(s,9H),1.33(m,2H).13CNMR(125MHz,DMSO-d6):δ174.26,167.29,165.24,156.08,143.91,143.84,140.75,140.73,127.66,127.11,125.33,120.15,120.14,80.40,80.39,65.57,54.10,46.70,43.74,38.51,30.74,28.65,27.70,23.02.LCMS(ESI)calcd.for C28H35N2O7[M+H+]511.3,obsd.510.8.
Fmoc-赖氨酸(丁基-琥珀酰基)-OH。1H NMR(500MHz,CD3OD):δ7.75(d,2H,J＝8.0Hz),7.61(dd,2H,J＝4.5,7.5Hz),7.35(t,2H,J＝7.3Hz),7.26(t,2H,J＝7.3Hz),4.30(m,2H),4.15(t,1H,J＝7.0Hz),4.04(dd,1H,J＝4.5,8.0Hz),3.14(t,2H,J＝7.0Hz),2.49(t,2H,J＝7.0Hz),2.38(t,2H,J＝7.3Hz),1.75(m,2H),1.49(m,2H),1.40(s,9H),1.37(m,2H).13C NMR(125MHz,CD3OD):δ180.22,174.46,173.72,158.64,145.49,145.28,142.69,142.68,128.91,128.29,126.38,126.35,121.07,81.81,67.97,57.11,48.54,40.37,33.23,31.93,31.87,30.17,28.48,24.32.LCMS(ESI)calcd.for C29H37N2O7[M+H+]525.3,obsd.524.8.
乙酰，硫代乙酰，丙二酰和琥珀酰肽的合成
乙酰，硫代乙酰，丙二酰和琥珀酰肽是在Fmoc-Wang树脂上合成的，使用标准的Fmoc/tBu化学合成方法，用O-苯并三唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸/1-羟基苯并三唑(HBTU/HOBt)进行的(Du et al.,Biochemistry 48:2878-2890,2009)。使用Fmoc-赖氨酸(乙酰基)-OH,Fmoc-赖氨酸(硫代乙酰基)-OH(Fatkins et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.16:3651-3656,2006),Fmoc-赖氨酸(丁基-丙二酰基)-OH和Fmoc-赖氨酸(丁基-琥珀酰基)-OH将修饰的赖氨酸与上述肽合并。通过用含有苯酚(5％)，茴香硫醚(5％)，乙二硫醇(2.5％)，和水(5％)的三氟乙酸(TFA)和树脂孵育2小时，使产物从树脂上解吸附，并除去保护基团。粗肽通过反相HPLC纯化，使用BECKMAN COULTER System Gold125P溶剂组件和168检测器，TARGA C18色谱柱(250×20mm,10μm,Higgins Analytical,Inc.,Mountain View,CA)，检测波长215nm。流动相为含0.1％TFA的水(溶剂A)和含0.1％TFA的乙腈(溶剂B)。所述肽用流速10mL/min的梯度进行洗脱：0％溶剂B洗脱5min，然后在25min内溶剂B的比例从0％提升到25％进行洗脱。肽的鉴别和纯化通过LCMS鉴定。所述表4为合成肽列表。
人类去乙酰化酶的克隆，表达和纯化
人类Sirts1，2，3，5，和6如文献所述进行表达(J.Du,et al.,Biochemistry 48:2878(2009))。Sirt4因为表达的困难没有包括在本次研究中。人类Sirt7编码序列是使用引子JT072_Sirt7(1-400)EcoRI5(5’-AGTCAGGAATTCATGGCAGCCGGGGGTCT-3’)(SEQ ID NO:2)和JT073_Sirt7(1-400)XhoI3(5’-AGTCAGCTCGAGTTACGTCACTTTCTTCCTTTTT-3’)(SEQ IDNO:3)进行PCR扩增。扩增的产物被EcoRI和XhoI消化。被消化的PCR产物被纯化和连接到同样被消化的表达载体pET28a上。使用TOPO和GATEWAY克隆技术(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)将C末端有Flag标签的Sirt5(Flag-Sirt5)和缺失的Sirt5(34-302)克隆到pDEST-F1内用于表达。Sirt7，Flag-Sirt5和Sirt5(34-302)在大肠杆菌中表达并用记载的方法进行纯化(J.Du,et al.,Biochemistry 48:2878(2009))。纯化后，Flag-Sirt5和Sirt5(34-302)在室温下被TEV消化2小时，然后使用HisTrapTM HP色谱柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ)纯化和用HiLoad 26/60 Superdex 75 prep grade色谱柱(GEHealthcare,Piscataway,NJ)进行硅胶过滤。蛋白浓度通过Bradford试剂测定。
Sirt5 X-射线衍射数据收集和结构优化
Sirt5-H3K9硫代乙酰肽和Sirt5-H3K9琥珀酰肽通过1：20蛋白：肽的摩尔比准备，并在冰上孵育30-60分钟。通过悬滴蒸汽扩散的方法使晶体长大。在数据收集之前，Sirt5-H3K9琥珀酰肽的共结晶在10mM NAD中浸透，保持10-120分钟。所有的X-射线衍射数据都是在CHESS(Cornell High Energy Synchrotron Source)A1或F1站收集的。数据是通过programs HKL2000(Z.Otwinowski,et al.,Methods Enzymol.276:472(1997))处理的。通过源于CCP4程序套(Collaborative,Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.50:760(1994))的程序Molrep，使Sirt5复合物的两种结构经分子互换进行解析。Sirt5-ADPR结构(PDB code:2B4Y)作为检索的模版。使用CCP4中的REFMAC5和COOT，进行结构的优化和模型的建立。结果：Sirt5的结构揭示了一个不寻常的酰化袋
对Sirts4-7缺少强的脱乙酰活性的一个可能的解释是它们对肽序列有严格的要求。为了证实这点，6种人去乙酰化酶(除了Sirt4，它不能在大肠杆菌中以可溶的形式进行表达)的活性可以通过16种不同的乙酰肽检测。在所述实验条件下，Sirt1-3和5表现出脱乙酰活性，但是Sirt6和Sirt7却没有。所有的16个肽被Sirt1-3有效地脱乙酰化，但是只有8个被Sirt5缓慢地乙酰化。组蛋白H3K9乙酰肽是Sirt1-3和Sirt5的最好的底物之一。通过这些肽，检测了不同去乙酰化酶的kcat和Km(表1)。Sirt5的催化效率(kcat/Km)比Sirt1低500倍。
表1.4种人类去乙酰化酶对H3 K9酰化肽的动力参数
*Sirt5的kcat和Km值不能被检测出来是因为V比[S]的曲线是线性的(Km比被检测的最高底物浓度更高)。因此只有kcat/Km值可获得。kcat和Km值使用KaleidaGraph曲线拟合Vinitial/[E]比[S]的曲线获得。
为了理解为什么Sirt5脱乙酰活性很弱，制备出了硫代乙酰肽和Sirt5的混合晶体(相对应的乙酰肽不能使Sirt5结晶)。使用报道的Sirt5结构，通过分子互换解析结构(A.Schuetz et al.,Structure 15:377(2007))。除了硫代乙酰肽，缓冲分子CHES(N-环己基-2-氨基乙磺酸)也和Sirt5连接(图2A)。在硫代乙酰肽和Sirt5之间的相互作用包括主要的骨架氢键的相互作用，与在Thermotoga maritime Sir2(Sir2Tm)(一种具有强脱乙酰活性的细菌去乙酰化酶)中观察到的类似(M.S.Cosgrove et al.,Biochemistry 45:7511(2006))。所以，肽序列的选择性不可能是Sirt5缺少强的脱乙酰活性的主要原因。
但是，在与乙酰肽和NAD(PDB 2h4f)的混合时，将Sirt5的结构和Sir2Tm的结构(K.G.Hoff,et al.,Structure 14:1231(2006))(图2B)进行叠加，发现了一个惊人的结构。在Sirt5中硫代乙酰赖氨酸的位置和在Sir2Tm中的乙酰赖氨酸的位置在叠加的结构中几乎相同。在Sir2Tm中的乙酰基团被三个疏水性残基，Phe48，Ile100，和Ile159包围。相反，当Sirt5中的Phe48(Sir2Tm number)被Ala86取代时，Sirt5中的相对应的袋更大。而且，Sirt5中的袋被CHES缓冲分子束缚。CHES的硫酸酯基团和Sirt5中的Tyr102和Arg105相互作用，且离硫代乙酰基团只有约(图2A)。被报道的被HEPES约束的Sirt5结构中(A.Schuetz etal.,Structure 15:377(2007))，来自HEPES的硫酸酯也会和Arg105和Tyr102相互作用。
实施例2
脱乙酰，脱丙二酰，脱琥珀酰活性实验，和kcat，Km的测定
人Sirt1，Sirt2，Sirt3，Sirt5，Sirt6和Sirt7的脱乙酰活性通过使用LCMS检测由酰化肽产生的脱乙酰肽进行测定。纯化的Sirtuin与0.3mM酰化肽，在含1.0mM NAD和1mMDTT的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)的60μL反应液中37℃下孵育2小时。所述反应用60μL10％TFA停止反应并用LCMS检测。
为检测kcat和Km，人Sirt1，Sirt2，Sirt3和Sirt5通过使用HPLC检测由H3K9酰化肽产生的脱乙酰肽进行测定。纯化的去乙酰化酶与1.0mM NAD，在含酰化肽(0–750μM)和1.0mMDTT的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)的60μL反应液中在37℃下孵育。所述反应用100mMHCl和160mM乙酸停止，然后HPLC分析，用反向C18色谱柱(250×4.6mm,90A,10μm,GraceVydac,Southborough,MA),用0％到20％B相线性梯度洗脱10min(1mL/min)。产物量是根据在215nm波长下检测到的吸收面积计算的，假设酰基的水解不影响吸收。kcat和Km值是通过使用KaleidaGraph曲线拟合Vinitial/[E]比[S]的曲线得到的。对于Sirt5R105M，因为其非常弱的脱乙酰活性，所以检测了二阶速率常数，kobs(rate/([Sirtuin][NAD]))而不是kcat和Km。进行了重复实验。
相比于脱乙酰化，Sirt5对不同肽骨架(结果见表2)，组蛋白H3，GDH和C末端有两个色氨酸残基的ACS2肽的脱丙二酰和脱琥珀酰活性可以使用HPLC更好的检测和定量。如上所述，经轻微的修改，kcat和Km的检测基本上可以进行。所述反应可以用60μL 10％TFA停止反应。用0％到50％B相色谱梯度洗脱20min(1mL/min)。所述肽通过LC检测和定量，吸收波长为280nm。
O-Ma-ADPR和O-Su-ADPR的HPLC纯化和MS分析
Sirt5或Sirt1(1μM)和0.5mM丙二酰或琥珀酰肽，1.0mM NAD在含有1mM DTT的20mMTris-HCl缓冲液(pH 7.5)的60μL反应液中37℃孵育2小时。所述反应通过加入60μL10％TFA停止。在离心除去沉淀的蛋白后，上层清液用HPLC分析，使用50mM醋酸铵等度洗脱，SpriteTARGA C18色谱柱(40×2.1mm,5μm,Higgins Analytical,Inc.)。收集产物O-Ma-ADPR(保留时间1.6min)和O-Su-ADPR(保留时间2.3min)，其分子量通过MALDI-MS确认(图7)。ADPR(保留时间1.2min)和NAD(保留时间5min)通过MALDI-MS确认。
来自牛肝脏线粒体肽混合物的O-Su-ADPR用上述方法纯化，然后通过Agilent1100高效液相色谱与ABI 4000 Q-trap质谱联用，在IDA负离子模式下检测。液相系统由HILIC column(Nest Group，5μm，聚羟基乙基A，1×150mm)和A(乙腈)比B(10mM醋酸铵)梯度洗脱，流速0.05ml/min。这个额外的LC步骤是需要的，因为样品比仅使用合成肽的反应更复杂。
结果：Sirt5更倾向于水解丙二酰和琥珀酰肽
基于上述结构分析，如果用带有负电荷的羧酸盐的酰化基团取代乙酰基团，所述酰化肽比乙酰肽能更好地结合Sirt5，那么它就是Sirt5更好的底物(图2C)。在细胞中，含有羧酸盐基团的最常见的酰基CoA是丙二酰-CoA，琥珀酰-CoA。丙二酰CoA是乙酰-CoA通过乙酰-CoA羧化酶(ACC)制备，它是脂肪酸生物合成的前体(K.-H.Kim,Ann.Rev.Nutr.17:77(1997)；D.Saggerson,Ann.Rev.Nutr.28:253(2008))。哺乳动物有两种ACC酶，ACC1存在于细胞溶质中，ACC存在于线粒体中(K.-H.Kim,Ann.Rev.Nutr.17:77(1997))。琥珀酰-CoA是在Kreb循环中的中间体，它存在于线粒体中。鉴于乙酰化-CoA可以在细胞中被用于修饰蛋白，那么就有可能丙二酰或琥珀酰-CoA也可以被用于修饰蛋白。因此，可以合成H3K9丙二酰和琥珀酰肽用来检测Sirt5的水解作用。
LC-MS被用于检测反应。Sirt1，具有强的脱乙酰活性，被用作对照物。Sirt1催化乙酰肽的水解，但是不催化丙二酰和琥珀酰肽(图3A-C和5A-C)。用Sirt2和Sirt3也能获得相似的结果。相反，用Sirt5的话，观察到很少有乙酰肽水解，但是丙二酰和琥珀酰肽水解显著(图3D-F)。脱丙二酰/脱琥珀酰肽与合成的非修饰的H3K9肽具有相同的质量。在实验条件下，没有检测出Sirt6和Sirt7对乙酰，丙二酰或琥珀酰肽的活性。因此，Sirt5是一个NAD依赖的脱琥珀酰酶和脱丙二酰酶。
去乙酰化酶的脱乙酰机制已经被很好地研究过(图6B)(A.A.Sauve,et al.,Annu.Rev.Biochem.75:435(2006)；A.A.Sauve et al.,Biochemistry 40:15456(2001)；W.F.Hawse et al.,Structure 16:1368(2008))。如果Sirt5使用相同的机制来催化脱丙二酰和脱琥珀酰，O-丙二酰-ADPR(O-Ma-ADPR)或O-琥珀酰-ADPR(O-Su-ADPR)应该能在反应中产生。这些产物确实可通过质谱检测到(图7A-7D)。作为对照，Sirt1和丙二酰，琥珀酰肽的反应不能产生这些产物(图7A-7B，灰线)。如图4A所述的，使用32P-NAD也能检测到O-Ma-ADPR和O-Su-ADPR的形成。因此，Sirt5催化脱琥珀酰、脱丙二酰的机制(图8)和第一类的去乙酰化酶的脱乙酰机制相似。
Sirt5催化三个不同的肽序列的脱乙酰，脱丙二酰和脱琥珀酰的kcat和Km值被检测出来(表2)。
表2.Sirt5对不同序列的乙酰，丙二酰和琥珀酰肽的动力学参数
*在HPLC实验中，将两个色氨酸残基加入到肽的C末端，便于UV-Vis吸收的检测。
**没有活性。基于检测限估计的值。
对所有三个肽序列，脱丙二酰和脱琥珀酰活性的催化效力(kcat/Km从520到6100s- 1M-1)比脱乙酰活性更高(高29到1000倍)。Sirt5的脱丙二酰/琥珀酰的效力与Sirt1的脱乙酰效力是可比的(kcat/Km 1000s-1M-1，表1)。这些动力学研究进一步提供了证据表明，Sirt5的脱琥珀酰和丙二酰活性比它的脱乙酰化活性更强。
为获得关于识别琥珀酰/丙二酰基团的结构信息，得到了琥珀酰肽、NAD和Sirt5的混合晶体。所述结构(图2D)表明琥珀酰中的羧酸酯和Tyr102，Arg105相互作用，与基于CHES结合的Sirt5结构的预测相一致(图2C)。把Arg105改变成Met显著地降低了kcat/Km，增强了Sirt5脱琥珀酰的Km(表3)。把Tyr102改变成Phe不会怎么影响kcat/Km，但是显著地增加了脱琥珀酰的Km。相反，对脱乙酰活性没有影响。这些数据表明，Tyr102和Arg105对结合琥珀酰和丙二酰基团是重要的。
表3.突变的Sirt5对H3K9乙酰化和琥珀酰化肽的动力学参数
*kcat和Km值没法检测是因为V比[S]的曲线是线性的(Km比所测底物最高浓度还高，750μM)。所以只有kcat/Km值可以获得。
实施例3
使用32P-NAD实验检测牛肝脏中线粒体蛋白的琥珀酰赖氨酸
牛的肝脏线粒体通过文献方法分离得到(C.Frezza,et al.,Nat.Protoc.2:287(2007))。从5g牛肝脏获得的线粒体放到冰冷的含有蛋白酶抑制剂(P8340,Sigma)的溶解缓冲液(25mM Tris-HCl pH 8.0,50mM NaCl,0.1％Triton X-100)中，在4℃下溶解30分钟。收集上清液，将其与含有50mM NaCl的25mM Tris-HCl(pH 8.0)交换，使用离心过滤器(MILLIPORE,Billerica,MA)除去内源的NAD。提取物保存在-80℃。为了胰蛋白酶的消化，1.5mg的牛肝脏线粒体蛋白或BSA(作为对照)溶解于6M尿素，60mM Tris-HCl(pH 8.0)，15mMDTT的450μL反应体积中。所述溶液在95℃下加热15min，然后冷却到室温。然后加入22.5μL的1M碘乙酰胺(最终浓度约50mM)，使混合物在室温下温和搅拌，孵育1小时。然后加入3.6mL的50mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM CaCl2到反应混合物中，使尿素的浓度降到0.75M。最后，加入150μL的100μg/mL修饰后的胰蛋白酶(Promega Corporation,Madison,WI)，然后将反应混合物在37℃下孵育12小时。加入65μL 10％TFA使pH达2-3，使反应终止后，被消化的蛋白质通过使用Sep-Pak C18 cartridge 1cc/50mg(Waters Corporation,Milford,MA)脱盐，冻干。
为了检测在sirtuin催化的脱酰基反应中形成的酰基-ADPR化合物，反应在10μL的溶液中进行，所述溶液中含有1μCi32P-NAD(ARC Inc.,ARP 0141,800Ci/mmol,0.125μM)，50mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，10mM DTT。使用的酰基肽底物是100μM H3K9乙酰基，丙二酰，或琥珀酰肽，2μg小牛胸腺组蛋白(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)，20μg牛肝脏线粒体蛋白，或20μg BSA肽。所述反应物用1μM Sirt5或Sirt1在37℃下孵育1小时。CD38催化域被用于产生作为对照的ADPR。取每个反应液的0.5μL点到TLC硅胶板上，然后用7：3的乙醇：碳酸氢铵(1M水溶液)展开。展开后，硅胶板在空气中干燥，然后暴露在PhosphorImaging screen中(GE Healthcare,Piscataway,NJ)。使用STORM860磷光成像仪(GE Healthcare,Piscataway,NJ)检测信号。
赖氨酸琥珀酰肽的亲和纯化和蛋白鉴定
4℃下，Flag-Sirt5(25μg)在NETN缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 8.0,100mM NaCl,1mM EDTA,0.5％NP40)中孵育2小时，被结合到100μL anti-Flag M2亲和凝胶(A2220,Sigma)上(S.C.Kim et al.,Mol.Cell 23:607(2006))。除去上清液，凝胶用NETN缓冲液洗涤3次。上述获得的胰蛋白酶线粒体肽(大约1mg)在0.5mL NETN缓冲液中再溶解，10,000×g10分钟离心除去不溶颗粒。然后进行亲和纯化，在4℃下，温和摇晃，所述肽和结合有Flag-Sirt5的anti-Flag M2亲和凝胶孵育3小时。所述凝胶用1mL NETN缓冲液洗涤3次，用ETN缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 8.0,100mM NaCl,1mM EDTA)洗涤2次。结合的肽用100μL的0.1％TFA洗脱3次。所述洗脱液进行合并后冻干。在康奈尔大学的蛋白质组学和质谱部门进行LC-MS/MS分析之前，根据厂商的说明，获得的肽用C18 ZipTips(Millipore,Bedford,Massachusetts)纯化。通过MASCOT搜索引擎(Matrix Science,London,UK)，使用乙酰，丙二酰，和琥珀酰赖氨酸作为修饰物，在NCBI-nr database中检索串联质谱图谱。
用32P-NAD实验检测CPS1肽上的赖氨酸琥珀酰化
从牛肝脏线粒体溶解产物的SDS-PAGE凝胶中切出CPS1条带。蛋白在凝胶中被胰蛋白酶消化，然后按如下提取和脱盐。这种凝胶条带用100μL水洗5分钟，然后用100μL的100mM碳酸氢铵：乙腈(1：1)的溶液洗10分钟，最后用50μL的乙腈洗5分钟。乙腈随后除去，凝胶带被允许在通风的通风橱中干燥5-10分钟。凝胶片在冰上用15μL的胰蛋白酶溶液(10g/mL改性胰蛋白酶溶在1mM HCl中)再水化30分钟。将上述胰蛋白酶溶液加到含有10％乙腈的10μL50mM的酸酸氢铵中。消化反应在30℃下保持12小时。由此产生的溶液用甲酸(最后浓度为1％)酸化。被胰蛋白酶消化的肽用30μL含0.2％TFA的50％乙腈提取两次(在室温孵育45min后超声5min)。第三次萃取用30μL含0.2％的TFA的90％乙腈(5min)。所有的提取物合并后冻干。当干燥后，肽被溶解在12μL的0.1％TFA溶液中，然后用ZipTips(Millipore，Bedford，Massachusetts)脱盐。脱盐后的肽再次冻干，然后在水中复溶。来自在凝胶中消化的GDH肽和来自在溶液中消化的组蛋白肽由如上所述方法制备出来。32P-NAD实验如上所述进行。为了使检测极限更低，更高浓度的Sirtuins被使用。Sirt5的最终浓度为52μM，Hst2的使用浓度是24μM。样品肽的使用浓度是0.3μg/μl，对照肽的浓度是20μM。
结果：蛋白赖氨酸的琥珀酰化存在于哺乳动物的蛋白中
之前蛋白赖氨酸丙二酰化尚未报告过。蛋白赖氨酸琥珀酰化据报道发生于大肠杆菌高丝氨酸的反式-琥珀酰酶上(R.Rosen et al.,FEBS Letters 577:386(2004))。正如上面提到的，Sirt5催化的脱丙二酰/脱琥珀酰产生O-Ma-ADPR或O-Su-ADPR。当从细胞中提取出来的蛋白质/肽用Sirt5和32P-NAD孵育，如果产生32P标记的O-Ma-ADPR或O-Su-ADPR，这将表明丙二酰/琥珀酰赖氨酸的存在。
为了测试Sirt5催化引起的O-Ma-ADPR和O-Su-ADPR的形成是否可以用32P-NAD检测，在32P-NAD存在下，H3K9乙酰，丙二酰和琥珀酰肽，和Sirt5或Sirt1进行孵育。生成的小分子产物之后采用薄层色谱(TLC)分离，用放射自显影法检测。丙二酰基和琥珀酰肽存在下，Sirt5在1h内消耗所有的NAD分子(图4A，条带2和3)。然而，在乙酰肽存在下，基本上没有NAD被消耗(条带1)。用Sirt1和乙酰肽或全长度小牛胸腺组蛋白进行孵育，会引起O-Ac-ADPR的形成(图4A，条带4和8)。和短肽相比，组蛋白是Sirt1更好的底物，因为当组蛋白被用于反应时，O-Ac-ADPR点更强(条带8)。O-Su-ADPR点与O-Ac-ADPR和O-Ma-ADPR点分离开。这些结果表明，Sirt5催化引起的源于琥珀酰肽水解的O-Su-ADPR的形成可以用32P-NAD检测。
32P-NAD实验被用来检测琥珀酰赖氨酸是否存在于牛肝脏线粒体蛋白质中。牛肝脏线粒体被使用的原因是因为已知Sirt5集中于线粒体中(E.Michishita,et al.,Mol.Biol.Cell 16:4623(2005))。当用Sirt5和32P-NAD处理牛肝线粒体肽时，O-Su-ADPR的形成可被检测到(图4A，条带9)，与用合成的琥珀酰肽得到相类似(条带3)，这表明牛肝线粒体蛋白质含有琥珀酰赖氨酸。含有Sirt1(图4A，条带10)，没有Sirtuins蛋白(条带11)，或有BSA肽(条带12)的对照反应没有产生O-Su-ADPR或O-Ac-ADPR。当用Sirt5和NAD孵育牛肝线粒体肽时，O-Su-ADPR的形成进一步通过LC-MS/MS(m/z 657,[M-2H]-)证实。
为识别琥珀酰蛋白，使用FLAG-标记的Sirt5(Sirt5-FLAG)将来自牛肝脏线粒体的琥珀酰肽亲和纯化，然后用LC-MS/MS检测。三种琥珀酰蛋白被鉴定出：HMG-CoA合成酶2(HMGCS2)，硫代硫酸盐的硫转移酶，和天冬氨酸转氨酶。通过MS/MS鉴定琥珀酰修饰的位置。为识别更多的琥珀酰蛋白，采购了四种纯化自动物组织的线粒体酶：GDH，苹果酸脱氢酶，柠檬酸合成酶，丙酮酸脱氢酶。使用LC-MS/MS，赖氨酸琥珀酰化被发现存在于四个酶中的三个：GDH，苹果酸脱氢酶和柠檬酸合成酶(表4)。因此，赖氨酸琥珀酰化存在于哺乳动物线粒体蛋白质中。
表4.来自线粒体提取物中的乙酰，丙二酰和琥珀酰肽的例子
存在于哺乳动物蛋白中的蛋白赖氨酸丙二酰化
无论是32P-NAD试验(图4A)还是Sirt5-FLAG亲和纯化后进行的LC-MS/MS都没有检测到任何丙二酰肽。然而，LC-MS/MS检测出存在于来自商业购买的牛肝脏GDH中的三种丙二酰赖氨酸残基，和来自商业购买的苹果酸脱氢酶的两种丙二酰基赖氨酸残基(表4)。有趣的是，丙二酰化被发现出现在相同的被琥珀酰化和/或乙酰化的赖氨酸残基上(见表4，肽2-3和4–6)。这些数据表明，蛋白赖氨酸丙二酰化存在于哺乳动物细胞中。
Sirt5能从CPS1中除去琥珀酰基
为证明Sirt5的脱琥珀酰或脱丙二酰活性和生理活动相关，研究集中在已报道的Sirt5靶点，氨甲酰磷酸合酶1(CPS1)。据报道，Sirt5可以通过Sirt5的脱乙酰活性调节CPS1的活性(T.Nakagawa,et al.,Cell 137:560(2009))。鉴于Sirt5的脱琥珀酰或脱丙二酰的活性比脱乙酰酶的活性高的多，Sirt5的脱琥珀酰或脱丙二酰化活性更可能是与生理活动有关。与此一致的，通过32P-NAD实验发现来自牛肝脏线粒体的胰蛋白酶消化的CPS1肽含有琥珀酰赖氨酸。
实施例4
Sirt5缺陷的小鼠系的产生
Sirt5+/+和-/-小鼠培养自Institut Clinique de la Souris(斯特拉斯堡，法国)。简单地说，使用标准基因工程和基因打靶步骤，使Sirt5位点的外显子4位于loxP位置的旁边。由此产生的Sirt5敲除小鼠与CMV-Cre转基因小鼠繁殖产生生殖系Sirt5缺陷(Sirt5-/-)的小鼠和对照组Sirt5+/+小鼠。经Q-RT-PCR分析证实，Sirt5-/-小鼠的不同组织中没有Sirt5mRNA，并通过使用anti-Sirt5抗体(Abcam ab62740)的免疫印迹确认Sirt5蛋白表达缺失。使用32P-NAD实验检测来自Sirt5wt和KO小鼠肝脏的CPS1的琥珀酰化水平
将29周大的同窝出生的Sirt5+/+和-/-雄性小鼠禁食过夜(从早上6点至晚上10点)，然后在处死之前四个小时自由进食。肝脏组织被迅速摘除，用液氮快速冷冻，并存储在-80℃中待分析。所述肝脏样本先被破碎成小块，然后在1mL的溶解缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，2mM EDTA，0.1％NP-40，10％glycerol)中剪切。粗溶解产物在振荡器上保持4℃孵育30分钟，然后在4℃下以10000g离心10分钟。溶解产物的浓度是通过Bradford实验测定。
200μg总蛋白的溶解产物用3μl的CPS1抗体(Abcam ab3682)在4℃下孵育60min。然后加入40μl的蛋白质A/G琼脂糖珠(Santa Cruz Biotechnology sc-2003)，在4℃下孵育过夜。所述珠子用Tris缓冲剂(25mM Tris-HCl pH 8.0，50mM NaCl，0.1％NP-40)洗3次。带有免疫纯化的CPS1的珠子在1μCi32P-NAD和50mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，10mM DTT中孵育。Sirt5的使用浓度为10μM，Hst2的使用浓度为1μM。所有使用的对照肽的浓度是20μM。反应液在37℃孵育1小时。将1.8μL的样品加到TLC板上。如上文所述，使用TLC分离和使用放射自显影法进行检测。
结果。为确认Sirt5的脱丙二酰化/脱琥珀酰化确实在体内存在，使用标准技术生成Sirt5敲除(KO)小鼠。与先前的报告相一致(T.Nakagawa,et al.,Cell 137:560(2009))，在Sirt5KO小鼠中没有观察到明显的临床表型。从野生型和Sirt5KO小鼠肝脏提取物中经免疫沉淀出的CPS1，用重组Sirt5和32P-NAD孵育。与来自野生型小鼠的CPS1产生的O-Su-ADPR(图4B，条带5)相比，来自Sirt5KO小鼠的CPS1产生更多的O-Su-ADPR(图4B，条带7)。这些结果表明，Sirt5缺失增加了体内CPS1上赖氨酸琥珀酰化水平，因此脱琥珀酰活性与体内的生理活动有关。
实施例5
一般的方法。试剂购自Aldrich或Acros，购买可能获得的最高纯度的试剂，以购买时的形式使用。LCMS在SHIMADZU LCMS-QP8000α上进行，用Sprite TARGA C18色谱柱(40×2.1mm,5μm,Higgins Analytical,Inc.,Mountain View,CA)，检测波长是215和260nm。LCMS使用的溶剂是含有0.1％甲酸的水和含有0.1％甲酸的乙腈。
合成Fmoc-Lys(succinyl)-AMC。Fmoc-Lys(Boc)-OH(1g,2.14mmol)和7-氨基-4-甲基香豆素(AMC,380mg,2.14mmol)溶于吡啶(12mL)。在-20℃时磷酰氯(0.4mL)被添加到上面的混合物中，之后将混合物加热到室温(RT)。在室温下1小时后，将反应液注入冰水中(120mL)。混合物用乙酸乙酯(100ml×3)萃取。将合并后的有机层是先后用水洗，2N HCl洗，水洗，5％NaHCO3溶液洗和盐水洗，再用无水Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩生成黄色的残留物。粗Fmoc-Lys(Boc)-MCA溶解在二氯甲烷(6mL)，然后添加TFA(6mL)以去除Boc。经过在室温下十分钟的搅拌，反应液真空浓缩。随后，薄荷醇被添加到混合物中，将混合物再次真空浓缩直到去除多余的TFA，生成黄色残留物。粗Fmoc-Lys-AMC和琥珀酸酐溶于吡啶(20mL)。这个反应在室温下搅拌2小时。反应浓缩，然后1N HCl添加到生成的残留物中。混合物用乙酸乙酯(100ml×3)萃取。合并后的有机层用盐水洗，用无水Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩生成黄色残留物。使用快速制备色谱(9％MeOH/CH2Cl2)分离残渣，获得一个白色固体，Fmoc-Lys(Succinyl)-MCA(1.3g,从Fmoc-Lys(Boc)-OH到产物的产率为75％)。LCMS(ESI)计算其分子式为C35H35N3O8[MH+]＝626.5，观察值＝626.0。
AMC琥珀酰肽的合成。Fmoc-Lys(succinyl)-AMC(125mg,0.2mmol)先被耦合到三苯甲基氯树脂上(100mg,0.1mmol)。肽的合成通过使用标准的Fmoc化学合成方法，用O-苯并三唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸/1-羟基苯并三唑(HBTU/HOBt)进行的。为使肽从固体支持上分开，所述树脂在室温下悬浮在1/1/8(按体积)混合乙酸/三氟乙醇/CH2Cl2中30分钟。树脂过滤除去，滤液真空浓缩。为了除去保护基团，上述残留物用TFA(2mL)处理4小时。粗肽通过反相高效液相色谱纯化，用BECKMAN COULTER System Gold 125P溶剂模块，168检测器，TARGA C18色谱柱(250×20mm,10μm,Higgins Analytical,Inc.,Mountain View,CA)，检测波长215nm。所使用的流动相是0.1％TFA水溶液(溶剂A)和含0.1％的TFA的乙腈(溶剂B)。肽用流速为10mL/min的梯度洗脱:0％溶剂B 5分钟，然后0％到25％溶剂B 25分钟。肽的鉴定和纯度通过LCMS验证。KQTAR(SuK)-AMC肽(SEQ ID NO:10)，LCMS(ESI)计算为C44H69N13O13[MH+]＝988.5，观察值＝987.8。ISGASE(SuK)-AMC肽(SEQ ID NO:11)，LCMS(ESI)计算其分子式为C42H61N9O16[MH+]＝948.4，观察值＝948.0。
AMC乙酰肽的合成。Fmoc-Lys(acetyl)-OH(82mg,0.2mmol)先被耦合到三苯甲基氯树脂上(100mg,0.1mmol)。肽的合成通过使用标准的Fmoc化学合成方法，用O-苯并三唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸/1-羟基苯并三唑(HBTU/HOBt)进行的。为使肽从固体支持上分开，所述树脂在室温下用1/1/8(按体积)混合乙酸/三氟乙醇/CH2Cl2处理30分钟，然后真空浓缩。残余的醋酸作为与己烷一起的共沸混合物被除去，使被保护的肽形成自由的C末端羧酸。残留物溶解在二氯甲烷(2mL)和吡啶(50μL)中。AMC(63mg,0.36mmol)和DCC(N,N’-二环己基碳化二亚胺，64mg，0.31mmol)被添加到上述混合物中。在室温下隔夜搅拌后，反应液过滤后，滤液真空浓缩。为了除去保护基团，上述肽用TFA(2mL)处理4小时。粗肽通过反相高效液相色谱纯化，用BECKMAN COULTER System Gold 125P溶剂模块，168检测器，TARGA C18色谱柱(250×20mm,10μm,Higgins Analytical,Inc.,Mountain View,CA)，检测波长215nm。所使用的流动相是0.1％TFA水溶液(溶剂A)和含0.1％TFA的乙腈(溶剂B)。肽用流速为10mL/min的梯度洗脱：0％溶剂B 5分钟，然后0％到25％溶剂B 25分钟。肽的鉴定和纯度通过LCMS验证。KQTAR(AcK)-AMC肽(SEQ ID NO:12)，LCMS(ESI)计算为C42H67N13O11[MH+]＝930.5，观察值＝930.7。ISGASE(AcK)-AMC肽(SEQ ID NO:13)，LCMS(ESI)计算其分子式为C40H59N9O14[MH+]＝890.4，观察值＝890.5。
不带AMC的赖氨酸肽的合成。Fmoc-Lys(Boc)-OH(94mg,0.2mmol)先被耦合到三苯甲基氯树脂上(100mg,0.1mmol)，然后剩余的合成同合成AMC-乙酰肽类似。KQTARK-AMC肽(SEQ ID NO:14)，LCMS(ESI)计算为C40H65N13O10[MH+]＝888.5，观察值＝888.0。ISGASEK-AMC肽(SEQ ID NO:15)，LCMS(ESI)计算为C38H57N9O13[MH+]＝848.4，观察值＝848.7。
用KQTAR(SuK)-AMC进行Sirt5荧光试验。SirT5(1μM)和KQTAR(SuK)-AMC(SEQ IDNO:10)肽(0.3mM)，NAD(0.5mM)，在包含二硫苏糖醇(DTT,1mM)的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4,20mM)的60μL反应液中37℃孵育16小时。然后添加胰蛋白酶(1μg)和CaCl2(1mM)，37℃下孵育14个小时。反应被50μL水稀释。所述混合物(100μL)被转移到96孔板，荧光被Synergy HT酶标仪记录下来(光学位置：顶部,敏感度：50,360nm的波长下激发和在460nm的波长下发射)。
通过LCMS监控胰蛋白酶催化的无AMC的赖氨酸肽的水解。KQTARK-AMC(SEQ ID NO:14)肽(0.3mM,60μL反应液)与不同量的胰蛋白酶(0μg,1μg,2μg或5μg)，在Tris-HCl缓冲液(pH 7.4,50mM)和CaCl2(1mM)中37℃下孵育14个小时。用200mM HCl和320mM乙酸停止反应，用LCMS分析。用痕迹检测KQTARK-AMC(SEQ ID NO:14)肽(m/z 808.0)，KQTAR(SEQ ID NO:16)肽(m/z 603.0)和赖氨酸－AMC(m/z 304.0)的质量。其结果显示所述KQTARK-AMC(SEQID NO:14)肽被裂解为KQTAR(SEQ ID NO:16)和赖氨酸－AMC，但是赖氨酸－AMC的裂解无效。
通过HPLC监测Sirt5催化的ISGASE(SuK)-AMC的脱琥珀酰化。Sirt5与ISGASE(SuK)-AMC(SEQ ID NO:11)肽(0.3mM)，NAD(0.5mM)，在含有DTT(1mM)的Tris-HCl缓冲液(pH7.4,20mM)的60μL反应液中37℃下孵育4小时。用200mM HCl和320mM乙酸停止反应，用HPLC和反相C18色谱柱(250×4.6mm,90A,10μm,GraceVydac,Southborough,MA)分析，用0％到20％的B线性梯度洗脱10min(1mL/min)。产品的量是基于在215nm检测的吸收面积，假定琥珀酰基的水解不影响所述吸收。
用荧光测定法在ISGASE(SuK)-AMC上做Sirt5活性试验。Sirt5(1μM)与ISGASE(SuK)-AMC(SEQ ID NO:11)肽(0.3mM)，NAD(0.5mM)在含有DTT(1mM)的Tris-HCl缓冲液(pH7.4,20mM)的60μL中37℃下孵育4小时。加入胰蛋白酶(1μg)和CaCl2(1mM)，在37℃下孵育3个小时。反应液用50μL水稀释。将混合物(100μL)转移到96孔板，荧光被SynergyHT酶标仪记录(光学位置：顶部,敏感度：50，在360nm的波长下激发和在460nm的波长下发射)。
在荧光测定法中用ISGASE(SuK)-AMC筛选Sirt5抑制剂。这步骤和上述的相同(用荧光测定法在ISGASE(SuK)-AMC上做Sirt5活性试验)，除了反应中包含了不同的化合物(30μM)。在脱琥珀酰的步骤中，最后添加Sirt5来启动脱琥珀酰反应。
在荧光测定法中测试ISGASE(AcK)-AMC上的Sirt1,2,3和5活性。这步骤和上述的相同(用荧光测定法在ISGASE(SuK)-AMC上做Sirt5活性试验)，除了使用不同的酰基肽和用不同的去乙酰化酶的孵育时间是10个小时。
使用Sirt2和ISGASE(AcK)-AMC对Sirt5特异性抑制剂的二次筛选。SirT2(1μM)与ISGASE(AcK)-AMC(SEQ ID NO:13)肽(0.3mM)，抑制剂(30μM)，NAD(0.5mM)在包含二硫苏糖醇(DTT,1mM)的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4,20mM)的60μL反应液中37℃下孵育4个小时。然后添加胰蛋白酶(1μg)和CaCl2(1mM)，反应在37℃中孵育3个小时。这反应用50μL水稀释。将混合物(100μL)转移到96孔板上，荧光用Synergy HT记录(光学位置：顶部,敏感度：50，在360nm的波长下激发，在460nm的波长下发射)。
结果。硫代琥珀酰和硫代丙二酰肽被认为应该通过形成一个稳定的共价中间物来抑制Sirt5脱琥珀酰和脱丙二酰的活性。因为其它去乙酰化酶不会识别丙二酰和琥珀酰赖氨酸肽，硫代琥珀酰和硫代丙二酰肽应该为Sirt5特异性抑制剂。为了验证这个假设，合成H3K9硫代琥珀酰(H3K9 TSu)肽。硫代琥珀酰基被挑选出来因为对于Sirt5来说琥珀酰赖氨酸有更低的Km值
合成H3K9 TSu肽之前先合成一个受保护的硫代琥珀酰赖氨酸化合物(Figure 9)。然后所述硫代琥珀酰赖氨酸化合物被用于标准的Fmoc固相多肽合成，生成所需的H3K9 TSu肽，KQTAR(TSuK)STGGKA(SEQ ID NO:17)。作为对照物，H3K9硫代乙酰肽(H3K9 TAc)也被合成。
图10显示AMC-琥珀酰肽的合成路线。合成带有AMC H3K9琥珀酰肽(KQTAR(SuK)-AMC)(SEQ ID NO:10)。H3K9琥珀酰肽被挑选出来是因为起初一个相似的琥珀酰肽用来测定Sirt5的活性。最初分析这个荧光琥珀酰肽显示，与没有Sirt5的对照反应相比，所述荧光(360nm激发,480nm发射)在Sirt5存在下才增加3倍(有或没有Sirt5的反应的相对的荧光单位分别为3600和1200)。为了分析为什么KQTAR(SuK)-AMC用来在荧光试验中测定的Sirt5时是一个效率低的底物，所以合成KQTARK-AMC肽，检测用胰蛋白酶进行的水解作用。结果显示，胰蛋白酶能很快裂解在精氨酸残基后所述肽，产生Lys-AMC，但它只能被胰蛋白酶缓慢水解来释放荧光物质AMC。
基于上述发现，另一个AMC琥珀酰肽，ISGASE(SuK)-AMC(SEQ ID NO:11)，使用源于谷氨酸脱氢酶的肽序列制作成。这个肽在琥珀酰赖氨酸残基之前没有精氨酸和赖氨酸残基，因此一旦琥珀酰基被除去所述肽就会有效地被胰蛋白酶消化。合成ISGASE(AcK)-AMC(SEQ ID NO:13)和ISGASEK-AMC(SEQ ID NO:15)作为对照组。ISGASEK-AMC肽首先用来确认它是否能被胰蛋白酶有效消化来释放AMC分子荧光。结果显示1μg胰蛋白酶在4小时内能水解释放基本上所有的AMC分子。使用HPLC监测Sirt5催化的300μM ISGASE(SuK)-AMC的脱琥珀酰的能力。在2个小时内，7.3％,17％,和36％的琥珀酰肽分别被1,2,和5μM的Sirt5脱琥珀酰化。相比之下，KQTAR(SuK)-AMC(SEQ ID NO:10)肽用Sirt5水解有相似的效率(在3小时内用1和5μM的Sirt5能够得到10％和60％的水解)。
已确认ISGASE(SuK)-AMC(SEQ ID NO:11)是一个对Sirt5和胰蛋白酶很好的底物，然后它在荧光实验中被测试。与没有Sirt5的对照相比，在用1μM Sirt5孵育4小时后，用1μg胰蛋白酶孵育3小时，能增强荧光强度11倍。增加Sirt5的浓度到5μM导致荧光强度增强26倍(图11)。相比之下，当Sirt1,2,或3被用来替代Sirt5，没有观察到有荧光增强(图12)。这些结果证明ISGASE(SuK)-AMC肽是一个在Sirt5活性试验中适宜的荧光底物。
接下来，用荧光试验来识别能抑制Sirt5的化合物(图13)，将报道过的乙酰化酶的抑制剂，包含苏拉明(L.Gao et al.,Journal of Chromatography B 853:303(2007))；AGK2(E.Michishita,et al.,Mol.Biol.Cell 16:4623(2005))；sirtinol(K.-H.Kim,Ann.Rev.Nutr.17:77(1997))；和splitomicin，用它们进行测试。除了这些报道的化合物外，硫代琥珀酰肽，H3K9 TSu，它能有选择性地抑制Sirt5，测试的IC50是5μM。苏拉明被报道可抑制Sirt5的脱乙酰活性，IC50是22μM(L.Gao et al.,Journal of Chromatography B853:303(2007))。使用HPLC检测的苏拉明抑制Sirt5的脱琥珀酰活性的IC50的值是相似的。其他化合物在抑制Sirt5方面无效，IC50大于100μM。使用30μM浓度，在荧光试验中测试这些化合物抑制Sirt5的能力。就像在图13中显示，在30μM的H3K9 TSu和苏拉明存在下，荧光接近背景水平。相比之下，其他化合物没有显著的降低荧光。这些结果和这些化合物对Sirt5的IC50的值是一致的。因此，H3K9 TSu肽不但是第一个Sirt5特异性抑制剂，而且是迄今报导的最有效的Sirt5抑制剂。
测试H3K9 TSu肽和H3K9 TAc肽对Sirt1,2,3,和5的抑制作用。IC50的值如表5中所示。所有的试验在同样的酶(1μM)和底物(0.3mM酰基肽，0.5mM NAD)浓度下进行。
表5：H3K9 TSu和TAc肽对不同的去乙酰化酶的IC50值
*在100μM没有抑制力。
ND：在这个研究中没测定。然而，一些对Sirt1-3的抑制剂的IC50值已经被报导。可获得的报导值显示在括号中。
甚至在100μM浓度下，H3K9 TSu不抑制Sirt1-3，但是抑制Sirt5的IC50值为5μM。相比之下，H3K9 TAc肽抑制Sirt1-3的IC50值为1-2μM，但是在100mM下不抑制Sirt5。这些结果表明H3K9 TSu肽是一个Sirt5特异性抑制剂。
采用AMC琥珀酰肽的Sirt5实验可以和采用AMC乙酰肽的Sirt1/2/3的二次试验相结合，来排除那些也能抑制Sirt1/2/3的化合物。ISGASE(AcK)-AMC(SEQ ID NO:13)肽，用来测试H3K9 TSu和苏拉明是否能抑制Sirt1/2/3。ISGASE(AcK)-AMC肽是Sirt2的底物(图14)。使用Sirt2和ISGASE(AcK)-AMC，对两个从Sirt5与ISGASE(SuK)-AMC(SEQ ID NO:11)实验得到的抑制剂进行测试。结果(图15)显示H3K9 TSu没有明显减少Sirt2制造的荧光，然而苏拉明使荧光减少几乎到接近背景水平。这结果与发现H3K9 TSu是Sirt5特异性抑制剂是一致的，证明用AMC-琥珀酰肽的Sirt5实验与用AMC-乙酰肽的Sirt1/2/3实验结合能被用来筛选选择性调节Sirt5活性的化合物。

Claims (9)

1.一种抑制Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性的化合物，所述化合物具有下式：
其中：
R1选自羧酸盐、羧基或硫代羧酸盐；
R2是S；
X0、X1、X2和X3独立地选自-CH2-、-NR5-、-O-或-S-；X4是-NR5-；X5、X6和X7独立地选自-CH2-或键，条件是X5-X7中至少一个不是键，并且X0-X3中至少三个是-CH2-；其中R5是H、甲基、乙基、异丙基、苯基或苄基；
R3和R4独立地选自二肽、三肽和寡肽，其中所述寡肽具有4到50个氨基酸残基。
2.一种抑制Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性的化合物，所述化合物具有下式：
其中：
R1选自羧酸盐、羧基或硫代羧酸盐；
R2是S；
X0、X1、X2和X3独立地选自-CH2-、-NR5-、-O-或-S-；X4是-NR5-；X5、X6和X7独立地选自-CH2-或键，条件是X5-X7中至少一个不是键，并且X0-X3中至少三个是-CH2-；其中R5是H、甲基、乙基、异丙基、苯基或苄基；
R3是–C(O)R或–C(O)NHR基团，并且R4是–OR、-NHR或–NC(O)R基团，其中R是烃基。
3.如权利要求1或2所述的化合物，其中X0、X1、X2和X3是-CH2-。
4.如权利要求1或2所述的化合物，其中X4为-NH-，并且X0、X1、X2和X3是-CH2-。
5.如权利要求1或2所述的化合物，其中所述化合物是硫代琥珀酰赖氨酸衍生物。
6.一种化合物，所述化合物是H3K9硫代琥珀酰肽。
7.如权利要求1或2所述的化合物，其中所述化合物抑制Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性，IC50小于或等于5μM。
8.如权利要求7所述的化合物，其中所述化合物抑制Sirt 1、2或3脱乙酰化活性，IC50大于100μM。
9.根据权利要求1或2所述的化合物在制备用于治疗或预防紊乱的药物中的用途，所述紊乱的特征在于，Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性异常。
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