CN111643666A - 蛋白质的琥珀酰化修饰在制备肿瘤细胞代谢调控剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蛋白质的琥珀酰化修饰在制备肿瘤细胞代谢调控剂中的应用，属于代谢工程技术领域。本申请通过对肝细胞蛋白组琥珀酰化修饰的鉴定，发现了琥珀酰化修饰同肿瘤细胞中各类代谢酶类的活性调控密切相关，而且代谢调控网络相互协作，从而适应了酸性、低氧和营养物质缺乏的肿瘤微环境。因此，蛋白质琥珀酰化修饰可以用于制备肿瘤细胞的代谢调控剂，既开辟了蛋白质琥珀酰化修饰新的应用领域，也提供了肿瘤细胞代谢调控剂新的药物靶点，具有广阔的应用空间。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质的琥珀酰化修饰在制备肿瘤细胞代谢调控剂中的应用，属于代谢工程技术领域。
背景技术
蛋白质琥珀酰化是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式。蛋白质琥珀酰化修饰主要通过琥珀酰基供体和琥珀酰基转移酶(或去琥珀酰化酶)进行调控。琥珀酰化修饰不仅使赖氨酸的价态从+1变成-1，而且引入的琥珀酰化基团的结构相对较大，因此，赖氨酸的琥珀酰化修饰能够改变蛋白质的构象、蛋白质复合物的形成和细胞定位，从而调控蛋白酶活性，影响细胞的生命活动，包括基因表达、细胞的增殖、发育和分化、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢、肿瘤发生等。
2004年，研究人员首次发现了大肠杆菌的高丝氨酸转琥珀酰酶的赖氨酸琥珀酰化修饰。其后研究人员对大肠杆菌的3个蛋白质的赖氨酸琥珀酰化修饰进行了验证。在结核杆菌中，研究人员不仅发现了去酰化酶CobB的去琥珀酰化功能，而且琥珀酰化修饰对中心代谢具有调控作用，比如，琥珀酰化修饰会负向调节乙酰辅酶合成酶的活性。土壤链霉菌的研究也证明了琥珀酰化修饰对碳代谢具有重要的调控作用。
研究人员报道了水稻的琥珀酰化修饰谱，并分析了氧化胁迫前后的水稻叶片的琥珀酰化修饰的变化，发现蛋白质的琥珀酰化修饰在乙醛酸及二羧酸代谢途径中发生显著变化。另一研究团队分析了水稻种子在不同发育时期的琥珀酰化修饰水平，生物信息学分析表明这些蛋白质的琥珀酰化修饰主要参与了应激响应和能量代谢等生命活动过程。
在哺乳细胞中，研究团队通过定量蛋白质组学方法对缺失Sirt5基因小鼠和对照小鼠之间进行了比较，发现Sirt5选择性地下调了140多个蛋白质的琥珀酰化修饰水平，并影响了蛋白质的活性。研究团队也发现了在去琥珀酰化酶Sirt5敲除的细胞中，丙酮酸激酶M2的琥珀酰化水平发生了上调，这导致了丙酮酸激酶M2由四聚体转化为二聚体。丙酮酸激酶M2二聚体可以进入细胞核与HIF1α相互作用，并激活IL-1β的表达，从而增强巨噬细胞的糖酵解作用，进而对结肠炎的发生产生了重要影响。
从以上描述可知，琥珀酰化修饰存在于几乎所有的生命体中，包括细菌、植物和哺乳动物，是一种保守且非常广泛的调控方式。这种修饰通过对代谢关键酶的活性微调，从而实现整体水平上的代谢调控。因此，这种修饰能对生理环境的变化做出应答，也是目前新药研发的重要热点之一。但是，目前系统性地研究肝细胞中的琥珀酰化修饰尚未作任何记载，以及将这种修饰作为制备肿瘤肝细胞代谢调控剂未作任何启示。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供蛋白质琥珀酰化修饰在制备肿瘤细胞代谢调控剂中的应用。本申请通过对肝细胞蛋白组琥珀酰化修饰的鉴定，发现了琥珀酰化修饰同肿瘤细胞中各类代谢酶类的活性调控密切相关，而且代谢调控网络相互协作，从而适应了酸性、低氧和营养物质缺乏的肿瘤微环境。因此，蛋白质琥珀酰化修饰可以用于制备肿瘤细胞的代谢调控剂，既开辟了蛋白质琥珀酰化修饰新的应用领域，也提供了肿瘤细胞代谢调控剂新的药物靶点，具有广阔的应用空间。
本发明解决上述问题的技术方案如下：蛋白质琥珀酰化修饰在制备肿瘤细胞代谢调控剂中的应用。
本发明的原理是：
本申请通过提取肝细胞蛋白质并用质谱鉴定了蛋白组层次上的琥珀酰化修饰。赖氨酸琥珀酰化修饰代表了一种在进化上保守、响应营养获取量和代谢状态的代谢调控机制。相比于正常肝组织，肿瘤微环境的特征是偏酸性、低氧和营养缺乏。为了响应肿瘤微环境，本申请进一步分析了肝癌细胞的琥珀酰化修饰的变化，发现发生琥珀酰化修饰水平变化的蛋白质参与了脂肪酸代谢、氨基酸代谢、糖酵解、三羧酸循环和核苷酸代谢等生命活动。琥珀酰化修饰的改变调控了细胞代谢，从而促进了肝肿瘤的发生发展。从另一方面讲，代谢活动产生了葡萄糖、氨基酸、脂肪酸、琥珀酸/琥珀酸盐和琥珀酰辅酶A等代谢产物和中间代谢物，这些代谢物也能直接或间接影响代谢酶的琥珀酰化水平。因此，通过调节本发明发现的代谢关键酶的活性，能改善或缓解脂肪酸代谢、氨基酸代谢、糖酵解、一碳代谢和糖原代谢等代谢相关的失调和肝癌疾病，对癌症的攻克具有举足轻重的意义。
本发明的蛋白质琥珀酰化修饰在制备肿瘤细胞代谢调控剂中的应用的有益效果是：
本申请通过对肝细胞蛋白组琥珀酰化修饰的鉴定，发现了琥珀酰化修饰同肿瘤细胞中各类代谢酶的活性调控密切相关，而且代谢调控网络相互协作，从而适应了酸性、低氧和营养物质缺乏的肿瘤微环境，因此，蛋白质琥珀酰化修饰可以用于制备肿瘤细胞代谢调控剂，既开辟了蛋白质琥珀酰化修饰新的应用领域，也提供了肿瘤细胞代谢调控剂新的药物靶点，具有广阔的应用空间。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，与正常肝细胞相比，在肿瘤肝细胞中，所述蛋白质琥珀酰化修饰的位点有122个，其中，有70个位点下调，52个位点上调。
采用上述进一步的有益效果是：本申请在正常肝细胞中，鉴定到697种蛋白质中的1195个琥珀酰化位点,这些琥珀酰化位点的鉴定有助于深入解析琥珀酰化修饰对蛋白质活性的调控机制及其在正常细胞生理活动中的功能作用。通过正常肝细胞和肿瘤肝细胞的对比，发现了122个位点的琥珀酰化修饰水平发生明显地变化，其中，有70个位点下调，52个位点上调。因此，肿瘤细胞通过改变底物蛋白的琥珀酰化水平，调控与代谢相关的蛋白酶的活性，适应代谢环境的变化，提供细胞生命活动所需的能量和物质，进而影响(促进或缓解)原发性肝癌的发生发展。因此，琥珀酰化修饰可用于制备肿瘤细胞代谢调控剂。
进一步，所述70个位点下调的基因分别为S27A2，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；S27A2，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；MAAI，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；UGDH、其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示；ARK73，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；FTCD，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；ADH1B，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；PH4H，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；AATM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；CAH2，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；CAH2，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；ASSY，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；ASSY，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；CO3，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；FIBA，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；CATA，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；ALDOB，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；ALDOB，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；PYGL，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；ADH1B，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示；ADH1G，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示；GSTA1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示；GSTA1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示；GSTA1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示；GSTA1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示；ADH4，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示；ADH4，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQID NO.27所示；F16P1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示；F16P1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示；F16P1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQID NO.30所示；MGST1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示；CP2D6，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示；PHKG2，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQID NO.33所示；CBR1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示；ACADS，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示；CP3A5，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.36所示；ACOC，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示；NLTP，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示；EST1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.39所示；GCSP，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示；GCSP，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示；PRDX6，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.42所示；ECHM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.43所示；ECHM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示；ACSL1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.45所示；HYES，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.46所示；SPRE，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.47所示；THIM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.48所示；KHK，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.49所示；GATM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.50所示；GATM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.51所示；KAD2，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.52所示；MTP，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.53所示；ADK，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.54所示；RET5，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.55所示；GSTM4，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.56所示；ADO，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.57所示；CP4F3，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.58所示；SPTN1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.59所示；PTGR1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.60所示；RGN，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.61所示；UGPA，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.62所示；CLYBL，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.63所示；AADAT，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.64所示；TTPAL，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.65所示；AL8A1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.66所示；GRHPR，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.67所示；CP8B1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.68所示；GUAD，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.69所示；S4A4，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.70所示。
采用上述更进一步的有益效果是：经研究发现，大多数下调的蛋白质位于细胞质和线粒体中。这些蛋白质的主要分子功能有氧化还原酶活性和酒精脱氢酶(NAD)活性以及参与单体代谢、小分子代谢、对异源生物刺激的应答和脂质代谢等生物过程。蛋白质ADH1B、ADH1G和ADH4是一组脱氢酶，能够以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为辅酶，催化伯醇和醛之间的可逆反应，是肝脏中代谢酒精的一条主要途径，这些蛋白质活性的失调与酒精性肝硬化的发生有极大的关联，可作为治疗酒精性肝硬化的潜在靶点。
更进一步，所述52个位点上调的基因分别为HMGN4，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.71所示；AK1BA，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.72所示；NDK8，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.73所示；IF2P，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.74所示；H2AY，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.75所示；CISY，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.76所示；CISY，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQID NO.77所示；PSIP1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.78所示；NDUS3，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.79所示；LMNA，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQID NO.80所示；LMNA，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.81所示；LMNA，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.82所示；FINC，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.83所示；FINC，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.84所示；FINC，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.85所示，AT1A1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.86所示；HMGN2，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.87所示；NPM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.88所示；HSP71，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.89所示；HSP71，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.90所示；PARP1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.91所示；CH60，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.92所示；XRCC6，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.93所示；IDE，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.94所示；RXRA，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.95所示；ROA2，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.96所示；PTBP1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.97所示；EF1G，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.98所示；DCK，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.99所示；ODPAT，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.100所示；CPSM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.101所示；PRS7，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.102所示；RBMX，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.103所示；SYIC，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.104所示；AK1C3，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.105所示；BAP31，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.106所示；TCP4，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.107所示；RL26，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.108所示；HNRPU，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.109所示；TRAP1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQID NO.110所示；DNJC3，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.111所示；NNTM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.112所示；CAPR1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQID NO.113所示；SYDM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.114所示；ENAH，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.115所示；STT3B，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQID NO.116所示；TM9S4，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.117所示；SYMPK，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.118所示；FUBP1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.119所示；SYNM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.120所示；TR150，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.121所示；SYYM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.122所示。
采用上述更进一步的有益效果是：经研究发现，大多数上调的蛋白质位于核仁、细胞质和线粒体中。上调的琥珀酰化修饰蛋白质主要参与细胞核相关功能和过程，如核酸结合、DNA结合、核酸代谢过程和基因表达等。在细胞核中，组蛋白和非组蛋白的赖氨酸残基均可发生琥珀酰化修饰，比如组蛋白有H2A.1，非组蛋白HMGN2、RBMX和DCK。组蛋白H2A.1能降低核小体的稳定性，影响核小体组装和分解的动态变化，因此，组蛋白H2A.1的琥珀酰化修饰能够影响基因的表达调控。脱氧胞苷激酶DCK参与嘌呤和嘧啶的代谢，是脱氧核苷酸生物合成补救途径中的关键酶，能够维持正常DNA的代谢，并通过磷酸化多种抗病毒和抗癌的核苷类似物药物，这提示脱氧胞苷激酶DCK的琥珀酰化修饰能够影响肿瘤的发生发展。因此，脱氧胞苷激酶DCK可作为不同类型癌症的潜在治疗靶标的代谢剂。
进一步，所述蛋白质琥珀酰化修饰的蛋白质分别定位于细胞质、线粒体和细胞核中。
采用上述进一步的有益效果是：经本申请研究发现，琥珀酰化修饰的蛋白质分别定位于细胞质(36.5％)、线粒体(24.5％)和细胞核(13.8％)。这些结果表明本申请发现的琥珀酰化修饰在细胞内普遍存在，在细胞代谢中很可能有很广泛的调控作用。线粒体是真核生物进行氧化代谢的部位和糖类、脂肪和氨基酸氧化释放能量的场所，因此，在琥珀酰化修饰蛋白质中，所含线粒体蛋白的比例要高于蛋白组所含线粒体蛋白质(14.3％)的比例。
进一步，所述蛋白质琥珀酰化修饰的蛋白质中含有1种琥珀酰化特异结合位点的motif类型，为·········LKP·········。
采用上述进一步的有益效果是：本申请经过研究发现，在赖氨酸琥珀酰化修饰位点左右3个氨基酸中，发现亮氨酸和脯氨酸出现频率较高；而丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺则出现频率较低。
进一步，所述肿瘤细胞代谢调控剂的剂型为外用制剂、口服制剂和注射制剂中的任意一种。
采用上述更进一步的有益效果是：肿瘤细胞代谢调控剂可以制成多种剂型的药物，适用于多种给药途径，如外用制剂、口服制剂或注射制剂，注射给药可以为皮内、皮下、肌内、局部或静脉内给药。
更进一步，所述外用制剂为喷雾剂或气雾剂。
更进一步，所述口服制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂和囊泡剂中的任意一种。
更进一步，所述注射制剂由蛋白质琥珀酰化修饰抑制剂/药物组合物、助溶剂、0.9％氯化钠溶液或注射用水组成，所述助溶剂选自吐温-80、丙二醇、甘油、乙醇和PEG-400中的任意一种或多种。
附图说明
图1为本发明的实施例1中，肝细胞蛋白组赖氨酸琥珀酰化修饰的分析流程图。
图2为本发明的实施例2中，肝细胞琥珀酰化修饰蛋白的功能注释中，亚细胞定位图。
图3为本发明的实施例2中，肝细胞琥珀酰化修饰蛋白的功能注释中，分子功能图。
图4为本发明的实施例2中，肝细胞琥珀酰化修饰蛋白的功能注释中，生物学过程图。
图5为本发明的实施例3中，琥珀酰化修饰水平上调，肿瘤肝细胞与正常肝细胞的Venn对比图。
图6为本发明的实施例3中，琥珀酰化修饰水平下调，肿瘤肝细胞与正常肝细胞的Venn对比图。
图7为本发明的实施例3中，琥珀酰化修饰位点下调的热图。
图8为本发明的实施例3中，琥珀酰化修饰位点上调的热图。
图9为本发明的实施例中，差异表达(上调或下调)的琥珀酰化修饰蛋白的亚细胞定位图。
图10为本发明的实施例中，琥珀酰化修饰水平上调的蛋白质GO功能注释图。
图11为本发明的实施例中，琥珀酰化修饰水平下调的蛋白质GO功能注释图。
图12为本发明的实施例中，差异表达的琥珀酰化修饰蛋白质的KEGG代谢途径分析图。
具体实施方式
以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本申请通过对肝细胞蛋白组琥珀酰化修饰的鉴定，发现了琥珀酰化修饰同肿瘤细胞中各类代谢酶类的活性调控密切相关，而且代谢调控网络相互协作，从而适应了酸性、低氧和营养物质缺乏的肿瘤微环境，为肿瘤细胞代谢调控剂的研发提供了新的药物靶点。
在实施方式上，可以分成四个方面：第一方面是琥珀酰化鉴定的方法；第二方面是肝细胞组织蛋白组的琥珀酰化修饰的分析；第三方面是肝癌细胞蛋白组的琥珀酰化修饰的分析；第四方面是代谢酶的具体代谢通路分析。以下具体介绍详细的实施方式。
实施例1：琥珀酰化多肽的富集
步骤1：人肝组织蛋白质的制备
如图1所示，首先将临床用的肝细胞快速冷冻于液氮中研磨粉碎，然后加入预冷的细胞裂解缓冲液(8M尿素、5mM二硫苏糖醇和1％蛋白酶抑制剂)，接着超声处理溶解蛋白质。在12,000g的转速下于4℃离心10分钟并收集上清液。测定蛋白质浓度之后，加入15％(v/v)三氯乙酸溶液，并在4℃中保存4小时。再用冰冷的丙酮清洗3次后，将蛋白质沉淀重新溶解在100mMTEAB缓冲液中，并在37℃下用胰蛋白酶(酶与底物的质量比为1:50)酶解12小时。然后，将多肽用二硫苏糖醇还原并用碘乙酰胺烷基化。最后为了确保完全酶解，在37℃下再次加入胰蛋白酶(酶与底物的质量比为1:100)酶解4小时。
步骤2：多肽的标记和分离
为了定量分析蛋白组和赖氨酸琥珀酰化多肽，使用同位素标签TMT(Thermo)对多肽混合物标记。为了降低多肽混合物的复杂性和提高定量准确性，使用Agilent 300Extend C18色谱柱(5μm颗粒，内径4.6mm，长度250mm)对多肽混合物进行反相分离。采用溶液A(水与乙腈的体积比为98:2、10mM甲酸铵，pH值为10)和溶液B(水与乙腈的体积比为98:2、10mM甲酸铵)。在80分钟内，液相流动梯度中的溶液A和B的比例从98:2(v/v)增加到40:60(v/v)，每分钟收集1个组分，共产生80个分离组分，分别依次合并为18个组分用于蛋白质组的质谱分析和8个组分应用于赖氨酸琥珀酰化修饰的分析。多肽样品通过真空离心干燥后保存在-20℃以下，以备质谱分析和表征。
步骤3：琥珀酰化多肽的纯化及分析
为了纯化和富集赖氨酸琥珀酰化修饰的多肽，将步骤2的8个应用于赖氨酸琥珀酰化修饰的分析的组分用同位素标记后，重新溶于缓冲液中(100mM NaCl、1mM EDTA、50mMTris-HCl和0.5％NP-40(w/v),pH值为8.0)中，并与偶联了抗琥珀酰化赖氨酸抗体的琼脂糖微珠一起孵育，在4℃中孵育过夜。再用上述缓冲液清洗微珠四次和用纯净水清洗两次后，将结合的多肽用1％(v/v)三氟乙酸洗脱，并在真空下干燥，以备质谱分析和表征。
实施例2：肝细胞的琥珀酰化修饰的分析
步骤1：琥珀酰化修饰的鉴定
在肝细胞中，利用质谱技术鉴定了来自681个不同蛋白质的1185条琥珀酰化修饰多肽。其中462个蛋白具有1个琥珀酰化修饰位点，114个蛋白质具有2个琥珀酰化修饰位点，以及37个蛋白质拥有5个以上的琥珀酰化修饰位点。琥珀酰化修饰的蛋白质分别定位于细胞质(36.5％)、线粒体(24.5％)和细胞核(13.8％)(具体见图2)。这些结果表明本申请发现的琥珀酰化修饰在细胞内普遍存在，在细胞代谢中很可能有很广泛的调控作用。线粒体是真核生物进行氧化代谢的部位和糖类、脂肪和氨基酸氧化释放能量的场所，因此，在琥珀酰化修饰蛋白质中，所含线粒体蛋白的比例要高于蛋白组所含线粒体蛋白质(14.3％)的比例。
步骤2：琥珀酰化位点的特异氨基酸鉴定
经MOTIF-X软件分析，琥珀酰化的特异结合位点的motif最显著的是·········LKP·········。在赖氨酸琥珀酰化修饰位点左右3个氨基酸中，发现亮氨酸和脯氨酸出现频率较高；而丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺则出现频率较低。
步骤3：琥珀酰化修饰蛋白的功能分析
为了研究肝细胞中琥珀酰化修饰蛋白质的生物学功能，分析了GO功能注释(具体见图3-4)。在生物过程中，这些蛋白质具有细胞过程、生物调节和对应激的反应等功能；在分子功能这一类别中，这些蛋白质具有结合和催化活性等功能。
实施例3：肝癌细胞中琥珀酰化修饰的变化
步骤1：琥珀酰化修饰的变化
当分析3组正常细胞核肝癌细胞样品时，发现了70个琥珀酰化位点的修饰水平发生了下调和52个琥珀酰化位点的修饰水平发生了上调(具体见图5-图8、表1和表2)。氨基酸序列中的琥珀酰化位点标记为su(琥珀酰化“succinylation”的英文缩写)。当对这些蛋白质的亚细胞定位进行分析时，大多数下调的蛋白质位于细胞质和线粒体中，而大多数上调的蛋白质位于核仁、细胞质和线粒体中。
表1琥珀酰化修饰水平下调的蛋白质
表2琥珀酰化修饰水平上调的蛋白质
步骤2：蛋白功能注释
当对蛋白质功能进行分析时(具体见图10-图11，上调的琥珀酰化修饰蛋白质主要参与核相关功能和过程，如核酸结合、DNA结合、核酸代谢过程和基因表达等；而下调的琥珀酰化修饰蛋白质，主要的分子功能有氧化还原酶活性和酒精脱氢酶(NAD)活性以及参与单体代谢、小分子代谢、对异源生物刺激的应答和脂质代谢等生物过程。
步骤3：KEGG代谢途径
当对琥珀酰化修饰下调的蛋白质进行KEGG代谢途径分析时(具体见图12)，这些蛋白质主要参与了细胞代谢、细胞色素P450主导的生物刺激的应答和脂肪酸代谢等代谢过程。
实施例4：琥珀酰化修饰蛋白质的代谢途径的具体分析
步骤1：氨基酸代谢
氨基酸的分解代谢主要在肝脏中进行，可通过脱氨、转氨、联合脱氨或脱羧作用，分解成α-酮酸、胺类及二氧化碳。肝脏将代谢产生的氨合成尿素，经肾脏排出体外。而氨基酸分解所生成的α-酮酸可以转变成糖、脂类或再合成某些非必需氨基酸，也可以经过三羧酸循环氧化成二氧化碳和水，并释放出能量。氨基酸的分解代谢也是一碳基团的来源，这些氨基酸包括甘氨酸、组氨酸、丝氨酸、蛋氨酸等。
在本实施例中，一共64个氨基酸代谢相关蛋白质发生琥珀酰化修饰，具体为：乙醇脱氢酶1B(ADH1B)、乙醇脱氢酶4(ADH4)、精氨酸琥珀酸合酶(ASSY)、醛氧化酶(ADO)、甲酰亚胺基转移酶-环脱氨酶(FTCD)、马来酸乙酰乙酸酯异构酶(MAAI)、天冬氨酸转氨酶(AATM)(线粒体)、短链特异性酰基辅酶A脱氢酶(ACADS)(线粒体)、烯酰辅酶A水合酶(ECHM)(线粒体)、3-酮酰基-CoA硫解酶(THIM)(线粒体)、甘氨酸脱氢酶(GCSP)(线粒体)、犬尿氨酸/α-氨基己二酸氨基转移酶(AADAT)(线粒体)、过氧化氢酶(CATA)、过氧化物还原酶-6(PRDX6)、苯丙氨酸-4-羟化酶(PH4H)、甘氨酸酰胺基转移酶(GATM)(线粒体)、乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)、氨甲酰磷酸合酶(CPSM)(线粒体)、4-氨基丁酸氨基转移酶(GABT)(线粒体)、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)、4-三甲基氨基丁醛脱氢酶(AL9A1)、乙醇脱氢酶3(ADHX)、醛脱氢酶X(AL1B1)(线粒体)、醛脱氢酶(ALDH2)(线粒体)、α-氨基己二酸半醛脱氢酶(AL7A1)、胺氧化酶[含黄素]A(AOFA)、δ-1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶(线粒体)(AL4A1)、脂肪醛脱氢酶(AL3A2)、谷氨酸脱氢酶1(DHE3)(线粒体)、谷氨酰胺合成酶(GLNA)、同去甲酸酯1,2-双加氧酶(HGD)、琥珀酸半醛脱氢酶(SSDH)(线粒体)、非特异性二肽酶(CNDP2)、富马酰乙酰乙酸(FAAA)、组氨酸氨裂解酶(HUTH)、ω-酰胺酶NIT2(NIT2)、丝氨酸丙酮酸转氨酶(SPYA)、二氢脂酰脱氢酶(HCDH)(线粒体)、3-酮酰基-CoA硫解酶(THIK)(过氧化物酶体)、羟酰辅酶A脱氢酶(DLDH)(线粒体)、中链特异性酰基辅酶A脱氢酶(ACADM)(线粒体)、甲基丙二酰辅酶A突变酶(MUTA)(线粒体)、过氧化物酶体双功能酶(ECHP)、三功能酶α亚基(线粒体)(ECHA)、三功能酶β亚基(线粒体)(ECHB)、丙酰辅酶A羧化酶α链(PCCA)(线粒体)、丙酰辅酶A羧化酶β链(PCCB)(线粒体)、谷氨酰辅酶A脱氢酶(GCDH)(线粒体)、2-氧代异戊酸脱氢酶亚基α(ODBA)(线粒体)、3-羟基异丁酸酯脱氢酶(3HIDH)(线粒体)、细胞色素P450 1A2(CP1A2)、D-氨基酸氧化酶(OXDA)、羟甲基戊二酰辅酶A合酶(HMCS2)(线粒体)、甲基巴豆酰辅酶A羧化酶β链(MCCB)(线粒体)、丙二酸甲酯-半醛脱氢酶[酰化](MMSA)(线粒体)、肌氨酸脱氢酶(SARDH)(线粒体)、短/支链特异性酰基辅酶A脱氢酶(ACDSB)(线粒体)、乙酰辅酶A乙酰转移酶(THIL)(线粒体)、支链氨基酸转氨酶(BCAT2)(线粒体)、胆碱脱氢酶(CHDH)(线粒体)、二甲基甘氨酸脱氢酶(M2GD)(线粒体)、甲基谷氨酰辅酶A水合酶(AUHM)(线粒体)、磷酸丝氨酸氨基转移酶(SERC)和丝氨酸羟甲基转移酶(GLYM)(线粒体)。
其中在肝癌细胞中琥珀酰化水平发生下调的有17个，具体为：乙醇脱氢酶1B、乙醇脱氢酶4、精氨酸琥珀酸合酶、醛氧化酶、甲酰亚胺基转移酶-环脱氨酶、马来酸乙酰乙酸酯异构酶、天冬氨酸转氨酶(线粒体)、短链特异性酰基辅酶A脱氢酶(线粒体)、烯酰辅酶A水合酶(线粒体)、3-酮酰基-CoA硫解酶(线粒体)、甘氨酸脱氢酶(线粒体)、犬尿氨酸/α-氨基己二酸氨基转移酶(线粒体)、过氧化氢酶、过氧化物还原酶-6、苯丙氨酸-4-羟化酶、甘氨酸酰胺基转移酶(线粒体)、乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶；发生上调的有1个，包括氨甲酰磷酸合酶(线粒体)。
步骤2：脂肪酸氧化
肝脏是脂肪运输的枢纽，也是体内脂肪酸、磷脂合成的主要器官之一。肝脏不仅合成脂肪酸，同时又进行脂肪酸的氧化。脂肪酸氧化是指油脂水解产生的甘油和脂肪酸在供氧充足的条件下，可氧化分解生成二氧化碳和水，并释放出大量能量供机体利用，在体内脂肪酸氧化以肝和肌肉最为活跃。脂肪酸氧化的方式有β-氧化和特殊氧化方式。脂肪酸β-氧化是体内脂肪酸分解的主要途径，脂肪酸氧化可以供应机体所需要的大量能量，脂肪酸β-氧化过程中生成的乙酰CoA是一种十分重要的中间化合物，乙酰CoA除能进入三羧酸循环氧化供能外，还是许多重要化合物合成的原料，如酮体、胆固醇和类固醇化合物。
在本实施例中，一共23个与脂肪酸β-氧化相关蛋白质发生了琥珀酰化修饰，具体为：5'-AMP激活的蛋白激酶α-2催化亚基(AAPK2)、短链特异性酰基辅酶A脱氢酶(ACADS)(线粒体)、烯酰辅酶A水合酶(ECHM)(线粒体)、超长链酰基辅酶A合成酶(S27A2)、长链脂肪酸-CoA连接酶1(ACSL1)、非特异性脂质转移蛋白(NLTP)、2,4-二烯酰辅酶A还原酶(DECR)(线粒体)、3-酮酰基-CoA硫解酶(THIK)(过氧化物酶体)、电子转移黄素蛋白-泛醌氧化还原酶(ETFD)(线粒体)、羟酰辅酶A脱氢酶(HCDH)(线粒体)、中链特异性酰基辅酶A脱氢酶(ACADM)(线粒体)、甲基丙二酰辅酶A突变酶(MUTA)(线粒体)、NADPH-细胞色素P450还原酶(NCPR)、过氧化物酶体双功能酶(ECHP)、三功能酶α亚基(ECHA)(线粒体)、三功能酶β亚基(ECHB)(线粒体)、肉碱O-乙酰基转移酶(CACP)、丙酰辅酶A羧化酶α链(PCCA)(线粒体)、丙酰辅酶A羧化酶β链(PCCB)(线粒体)、极长链特异性酰基辅酶A脱氢酶(ACADV)(线粒体)、肉碱O-棕榈酰转移酶1(CPT1A)、谷氨酰辅酶A脱氢酶(GCDH)(线粒体)和酰基辅酶A氧化酶1(ACOX1)(过氧化物酶体)。
其中在肝癌细胞中琥珀酰化水平发生下调的有5个，短链特异性酰基辅酶A脱氢酶(线粒体)、烯酰辅酶A水合酶(线粒体)、超长链酰基辅酶A合成酶、长链脂肪酸-CoA连接酶1和非特异性脂质转移蛋白。
步骤3：糖酵解途径
糖酵解与异常肝细胞的增殖密切相关。恶性肿瘤的迅速增殖往往伴随着葡萄糖摄入量剧增、糖酵解活性提高和乳酸堆积的现象。糖酵解作用是在无氧的条件下，葡萄糖进行分解，形成乳酸并提供能量。糖酵解作用是真核细胞以及细菌摄入体内的葡萄糖最初经历的酶促分解过程。这个过程被认为是生物最古老、最原始获取能量的一种方式。
在本实施例中，一共10个糖酵解相关的蛋白质发生琥珀酰化修饰，具体为：果糖二磷酸醛缩酶B(ALDOB)、1,6-双磷酸果糖酶1(F16P1)、丙酮酸脱氢酶E1α亚基(ODPAT)(线粒体)、2-氧戊二酸脱氢酶(ODO1)(线粒体)、磷酸葡萄糖突变酶1(PGM1)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、α-烯醇化酶(ENOA)、5'-AMP激活的蛋白激酶α-2催化亚基(AAPK2)和6-磷酸果糖激酶-1(K6PL)、乳酸脱氢酶A链(LDHA)和乳酸脱氢酶B链(LDHB)，其中在原发性肝癌中琥珀酰化水平发生变化。其中在肝癌细胞中琥珀酰化水平发生下调的有2个，具体为：果糖二磷酸醛缩酶B和1,6-双磷酸果糖酶1。发生上调的有1个，具体为：丙酮酸脱氢酶E1α亚基(线粒体)。
步骤4：三羧酸循环
三羧酸循环是需氧生物体内普遍存在的代谢途径，也是三大营养物质(糖、脂类和氨基酸)的最终代谢通路和枢纽。三羧酸循环是获得能量的最有效方式。
在本实施例中，一共13个三羧酸循环相关的蛋白质发生琥珀酰化修饰，具体为：丙酮酸脱氢酶E1亚基α(ODPAT)(线粒体)、细胞质乌头酸水合酶(ACOC)、柠檬酸合酶(CISY)(线粒体)、乌头水合酶(ACON)(线粒体)、二氢脂酰脱氢酶(DLDH)(线粒体)、苹果酸脱氢酶(MDHC)(胞质)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCKGC)(胞质)、丙酮酸羧化酶(PYC)(线粒体)、琥珀酸脱氢酶(DHSA)(线粒体)、富马酸盐水合酶(FUMH)(线粒体)、异柠檬酸脱氢酶[NADP](IDHP)(线粒体)、苹果酸脱氢酶(MDHM)(线粒体)和琥珀酰辅酶A连接酶α亚基(SUCA)(线粒体)。
其中在肝癌细胞中琥珀酰化水平发生下调的有1个，是细胞质乌头酸水合酶；发生上调的有2个，具体为：丙酮酸脱氢酶E1亚基α(线粒体)和柠檬酸合酶(线粒体)，这两个代谢蛋白酶是三羧酸循环的限速酶。
综上，本发明涉及琥珀酰化修饰在制备肿瘤代谢调控剂中的应用。具体地说是一种琥珀酰化多肽的特异性富集和纯化方法，应用于肝蛋白组琥珀酰化修饰的质谱鉴定。在正常肝细胞中，鉴定到697种蛋白质中的1195个琥珀酰化位点。通过正常肝细胞和肿瘤肝细胞的对比，发现了122个位点的琥珀酰化修饰水平发生明显地变化，其中70个位点下调和52个位点上调。因此，肿瘤细胞通过改变底物蛋白的琥珀酰化水平，调控与代谢相关的蛋白酶的活性，适应代谢环境的变化，提供细胞生命活动所需的能量和物质，进而影响(促进或缓解)原发性肝癌的发生发展。因此，琥珀酰化修饰可用于制备肿瘤细胞代谢调控剂。
所述肿瘤细胞代谢调控剂的剂型为外用制剂、口服制剂和注射制剂中的任意一种。
所述外用制剂为喷雾剂或气雾剂。
所述口服制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂和囊泡剂中的任意一种。
所述注射制剂由蛋白质琥珀酰化修饰抑制剂/药物组合物、助溶剂、0.9％氯化钠溶液或注射用水组成，所述助溶剂选自吐温-80、丙二醇、甘油、乙醇和PEG-400中的任意一种或多种。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 唐博
<120> 蛋白质的琥珀酰化修饰在制备肿瘤细胞代谢调控剂中的应用
<160> 122
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Tyr Asp Val Glu Lys Asp Glu Pro Val Arg Asp Glu Asn Gly Tyr Cys
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Val Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Met Leu Lys Pro Ala Phe Ile Phe Asp Gly Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ala Ile Pro Leu Phe Gly Asn Ser Leu Lys Pro Asp Ser Leu Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Asp Ile Thr Asp Glu Ala Phe Lys Asp Gln Ile His His Arg
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Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser Val Ser Tyr Asp Gln Ala Thr
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Ser Leu Arg
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Gln Lys Pro Asp Gly Val Phe Gln Glu Asp Ala Pro Val Ile His Gln
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<212> PRT
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Glu Val Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Asp Gln Gln Lys
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Ala Lys Val Phe Glu His Ile Gly Lys
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Arg
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<212> PRT
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Glu Ala Thr Gln Glu Ala Phe Met Lys Arg
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Asp Phe Ser Glu Leu Glu Pro Asp Lys Phe Gln Asn Lys
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Lys Phe Ser Leu Asp Ala Leu Ile Thr His Val Leu Pro Phe Glu Lys
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Lys Pro Phe Ser Ile Glu Glu Val Glu Val Ala Pro Pro Lys
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Tyr Phe Pro Ala Phe Glu Lys Val Leu Lys
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Ser Ala Glu Asp Leu Asp Lys Leu Arg
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His Ala Ile Ile Val Glu Pro Glu Lys Arg
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Met Lys Phe Leu Ser Leu Asp Leu Gln Gly Asp Pro Arg
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Glu Pro Met Lys Asp Asp Ile Thr Gly Glu Pro Leu Ile Arg
1 5 10
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
Lys Glu Glu Ile Leu Gln Ile Leu Lys
1 5
<210> 54
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
Tyr Ser Leu Lys Pro Asn Asp Gln Ile Leu Ala Glu Asp Lys
1 5 10
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
Ile Ala Leu Leu Leu Lys Pro Asp Lys
1 5
<210> 56
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
Lys Tyr Thr Met Gly Asp Ala Pro Asp Tyr Asp Arg
1 5 10
<210> 57
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
Lys Leu Glu Tyr Gly Asn Val Asp Glu Ala Phe Lys
1 5 10
<210> 58
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
Met Leu Thr Pro Ala Phe His Phe Asn Ile Leu Lys Pro Tyr Met Lys
1 5 10 15
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
Lys Phe Asp Asp Phe Gln Lys
1 5
<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
Thr Val Glu Ser Leu Glu Glu Thr Leu Lys Lys
1 5 10
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
Glu Gln Ser Ala Val Val Leu Ala Thr Val Asp Asn Asp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 62
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
Thr Tyr Asn Thr Asp Val Pro Leu Val Leu Met Asn Ser Phe Asn Thr
1 5 10 15
Asp Glu Asp Thr Lys Lys
20
<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
Gln Lys Ile Val Val Ile Ala Lys
1 5
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
Thr Ile Gln Phe Gly Glu Glu Met Met Lys Arg
1 5 10
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
Glu Glu Leu Gln Glu Lys Pro Glu Trp Arg
1 5 10
<210> 66
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
Val Pro Asn Ser Gly Lys Asp Glu Ile Glu Ala Ala Val Lys
1 5 10
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
Gly Glu Pro Met Pro Ser Glu Leu Lys Leu
1 5 10
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
Lys Phe Asp Leu Leu Phe Pro Arg
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
Glu Trp Cys Phe Lys Pro Cys Glu Ile Arg
1 5 10
<210> 70
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
Trp Ile Lys Phe Glu Glu Lys
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
Pro Ala Pro Pro Lys Pro Glu Pro Arg
1 5
<210> 72
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
Tyr Lys Pro Val Thr Asn Gln Val Glu Cys His Pro Tyr Leu Thr Gln
1 5 10 15
Glu Lys
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
Phe Lys Pro Glu Glu Leu Val Asp Tyr Lys
1 5 10
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
Lys Phe Glu Glu Glu Thr Val Lys
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
Asn Cys Leu Ala Leu Ala Asp Asp Lys Lys
1 5 10
<210> 76
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
Asp Ile Leu Ala Asp Leu Ile Pro Lys Glu Gln Ala Arg
1 5 10
<210> 77
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Pro Lys Ser Met Ser Thr Glu Gly Leu Met Lys
1 5 10
<210> 78
<211> 11
<212> PRT
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Asp Phe Lys Pro Gly Asp Leu Ile Phe Ala Lys
1 5 10
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
Tyr Asp Asp Glu Val Lys Arg
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu Glu Arg
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
Ala Gln His Glu Asp Gln Val Glu Gln Tyr Lys Lys
1 5 10
<210> 82
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
Leu Lys Asp Leu Glu Ala Leu Leu Asn Ser Lys
1 5 10
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
Gly Glu Trp Thr Cys Lys Pro Ile Ala Glu Lys
1 5 10
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
Gly Phe Asn Cys Glu Ser Lys Pro Glu Ala Glu Glu Thr Cys Phe Asp
1 5 10 15
Lys
<210> 86
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
Asp Lys Tyr Glu Pro Ala Ala Val Ser Glu Gln Gly Asp Lys
1 5 10
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
Pro Ala Pro Pro Lys Pro Glu Pro Lys
1 5
<210> 88
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
Ala Asp Lys Asp Tyr His Phe Lys
1 5
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
His Trp Pro Phe Gln Val Ile Asn Asp Gly Asp Lys Pro Lys
1 5 10
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
Tyr Lys Ala Glu Asp Glu Val Gln Arg
1 5
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
Met Val Asp Pro Glu Lys Pro Gln Leu Gly Met Ile Asp Arg
1 5 10
<210> 92
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
Cys Glu Phe Gln Asp Ala Tyr Val Leu Leu Ser Glu Lys Lys
1 5 10
<210> 93
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
Ala Leu Lys Pro Pro Pro Ile Lys
1 5
<210> 94
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
Lys Leu Ser Ala Glu Cys Ala Lys
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
His Lys Tyr Pro Glu Gln Pro Gly Arg
1 5
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
Glu Glu Ser Gly Lys Pro Gly Ala His Val Thr Val Lys
1 5 10
<210> 97
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
Leu His Gly Lys Pro Ile Arg
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
Lys Phe Ala Glu Thr Gln Pro Lys
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
Asp Ala Glu Lys Pro Val Leu Phe Phe Glu Arg
1 5 10
<210> 100
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
Met Glu Leu Lys Ala Asp Gln Leu Tyr Lys
1 5 10
<210> 101
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
Lys Glu Leu Ser Glu Pro Ser Ser Thr Arg
1 5 10
<210> 102
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
Glu Asp Glu Lys Asp Asp Lys Pro Ile Arg
1 5 10
<210> 103
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
Val Glu Gln Ala Thr Lys Pro Ser Phe Glu Ser Gly Arg
1 5 10
<210> 104
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
Phe Lys Glu Glu Gly Val Arg
1 5
<210> 105
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
Tyr Lys Pro Val Cys Asn Gln Val Glu Cys His Pro Tyr Phe Asn Arg
1 5 10 15
<210> 106
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
Lys Tyr Asp Asp Val Thr Glu Lys
1 5
<210> 107
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
Gln Val Ala Pro Glu Lys Pro Val Lys
1 5
<210> 108
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
Tyr Lys Glu Glu Thr Ile Glu Lys
1 5
<210> 109
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
Leu Leu Glu Gln Tyr Lys Glu Glu Ser Lys
1 5 10
<210> 110
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
Leu Ile Lys Phe Phe Ile Asp Gln Ser Lys
1 5 10
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
Asp Glu Lys Pro Val Glu Ala Ile Arg
1 5
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
Gly Thr Val Val Met Lys Asp Gly Lys
1 5
<210> 113
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
Glu Lys Pro Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys
1 5 10
<210> 114
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
Lys Leu Pro Phe Glu Ile Lys
1 5
<210> 115
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
Leu Lys Gln Asp Ile Leu Asp Glu Met Arg
1 5 10
<210> 116
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
Glu Thr Leu Asp His Lys Pro Arg
1 5
<210> 117
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
Glu Lys Asp Val Gln Phe Glu His Gly Tyr Arg
1 5 10
<210> 118
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
Leu Leu Ser Gly Leu Gln Glu Lys Pro Asp Gln Lys
1 5 10
<210> 119
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
Ile Gln Phe Lys Pro Asp Asp Gly Thr Thr Pro Glu Arg
1 5 10
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
Thr Glu His Glu Lys Tyr Leu Val Lys
1 5
<210> 121
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
Thr Asp Ser Glu Lys Pro Phe Arg
1 5
<210> 122
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
Leu Ala Ala Glu Val Thr Lys Leu Val His Gly Arg
1 5 10
Claims (10)
1.蛋白质琥珀酰化修饰在制备肿瘤细胞代谢调控剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，与正常肝细胞相比，在肿瘤肝细胞中，所述蛋白质琥珀酰化修饰的位点有122个，其中，有70个位点下调，52个位点上调。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述70个位点下调的基因分别为S27A2，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；S27A2，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；MAAI，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；UGDH、其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；ARK73，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQID NO.5所示；FTCD，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；ADH1B，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；PH4H，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示；AATM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；CAH2，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；CAH2，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；ASSY，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；ASSY，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；CO3，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；FIBA，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；CATA，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；ALDOB，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；ALDOB，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；PYGL，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；ADH1B，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示；ADH1G，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示；GSTA1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示；GSTA1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示；GSTA1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示；GSTA1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示；ADH4，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示；ADH4，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示；F16P1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示；F16P1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示；F16P1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示；MGST1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示；CP2D6，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示；PHKG2，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示；CBR1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示；ACADS，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示；CP3A5，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示；ACOC，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示；NLTP，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示；EST1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示；GCSP，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示；GCSP，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示；PRDX6，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示；ECHM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.43所示；ECHM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示；ACSL1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.45所示；HYES，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.46所示；SPRE，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.47所示；THIM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.48所示；KHK，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.49所示；GATM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.50所示；GATM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.51所示；KAD2，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.52所示；MTP，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.53所示；ADK，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.54所示；RET5，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.55所示；GSTM4，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.56所示；ADO，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.57所示；CP4F3，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.58所示；SPTN1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.59所示；PTGR1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.60所示；RGN，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.61所示；UGPA，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.62所示；CLYBL，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.63所示；AADAT，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.64所示；TTPAL，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.65所示；AL8A1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.66所示；GRHPR，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.67所示；CP8B1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.68所示；GUAD，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.69所示；S4A4，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQID NO.70所示。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述52个位点上调的基因分别为HMGN4，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.71所示；AK1BA，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.72所示；NDK8，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.73所示；IF2P，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.74所示；H2AY，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQID NO.75所示；CISY，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.76所示；CISY，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.77所示；PSIP1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.78所示；NDUS3，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.79所示；LMNA，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.80所示；LMNA，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.81所示；LMNA，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.82所示；FINC，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.83所示；FINC，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.84所示；FINC，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.85所示，AT1A1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.86所示；HMGN2，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.87所示；NPM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.88所示；HSP71，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.89所示；HSP71，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.90所示；PARP1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.91所示；CH60，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.92所示；XRCC6，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.93所示；IDE，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.94所示；RXRA，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.95所示；ROA2，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.96所示；PTBP1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.97所示；EF1G，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.98所示；DCK，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.99所示；ODPAT，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.100所示；CPSM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.101所示；PRS7，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.102所示；RBMX，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.103所示；SYIC，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.104所示；AK1C3，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.105所示；BAP31，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.106所示；TCP4，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.107所示；RL26，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ IDNO.108所示；HNRPU，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.109所示；TRAP1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.110所示；DNJC3，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQID NO.111所示；NNTM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.112所示；CAPR1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.113所示；SYDM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQID NO.114所示；ENAH，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.115所示；STT3B，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.116所示；TM9S4，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQID NO.117所示；SYMPK，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.118所示；FUBP1，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.119所示；SYNM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.120所示；TR150，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.121所示；SYYM，其琥珀酰化修饰的氨基酸序列如SEQ ID NO.122所示。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白质琥珀酰化修饰的蛋白质分别定位于细胞质、线粒体和细胞核中。
6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述蛋白质琥珀酰化修饰的蛋白质中含有1种琥珀酰化特异结合位点的motif类型，为·········LKP·········。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞代谢调控剂的剂型为外用制剂、口服制剂和注射制剂中的任意一种。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述外用制剂为喷雾剂或气雾剂。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述口服制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂和囊泡剂中的任意一种。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述注射制剂由蛋白质琥珀酰化修饰抑制剂/药物组合物、助溶剂、0.9％氯化钠溶液或注射用水组成，所述助溶剂选自吐温-80、丙二醇、甘油、乙醇和PEG-400中的任意一种或多种。
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