CN105031722B - 用于骨修复支架的改性细菌纤维素及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种用于骨修复支架的改性细菌纤维素及其制备方法。本申请的改性细菌纤维素由羧基化细菌纤维素和羟基磷灰石组成，羟基磷灰石与羧基化细菌纤维素的羧基形成螯合键，羟基磷灰石通过螯合键原位复合于羧基化细菌纤维素上，形成改性细菌纤维素。本申请的改性细菌纤维素，创造性的采用羧基化细菌纤维素的羧基与羟基磷灰石螯合，通过该螯合键减弱细菌纤维素纳米纤维之间的氢键，降低羧基化细菌纤维素的结晶度，从而使得改性细菌纤维素在体内具备可降解性，为其在骨修复支架中的应用奠定了基础。

Description

用于骨修复支架的改性细菌纤维素及其制备方法

技术领域

本申请涉及骨修复支架材料领域，特别是涉及一种用于骨修复支架的改性细菌纤维素及其制备方法。

背景技术

长期以来，骨修复材料主要都是采用自体或异体骨移植；但是，无论是自体骨移植，还是异体骨移植，都存在材料来源缺陷，以及失败率高的问题。为了克服自体骨移植和异体骨移植的不足，目前已经通过各种方法、途径，制备出了许多用于骨修复的替代材料，包括天然骨材料，如牛松质骨制得的骨裂片、牛骨煅烧制备的矿质骨等，此外，还包含很多无机非金属骨修复材料、无机高分子骨修复材料、复合骨代用材料等。无论是天然骨材料，还是合成的复合骨材料，其生物相容性、机械耐受性和生物降解性都是骨材料的首先必须具备的特性。

细菌纤维素(缩写BC)是很有前途的生物医用材料；特别是本申请人的一篇专利中，专利公告号CN103157515B，授权公告日2015.03.25，提供了一种效果良好的对细菌纤维素C6进行羧基化的方法，大大改善了细菌纤维素的加工性能；使得C6羧基化的细菌纤维素能够很好的制备成各种形状的支架材料或海绵材料等。并且，细菌纤维素具备良好的生物相容性，不同改性的细菌纤维素也能够满足各种骨修复支架的机械耐受性需求。

但是，细菌纤维素被普遍认为在人体内是不能降解的，因为人体缺乏细菌纤维素酶来使分子中的β-(1→4)-糖苷键断裂，这成为细菌纤维素在骨修复支架应用中的一个重要障碍，也是细菌纤维素用于骨修复支架研究的技术难题。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的用于骨修复支架的改性细菌纤维素及其制备方法。

本申请采用了以下技术方案：

本申请公开了一种用于骨修复支架的改性细菌纤维素，该改性细菌纤维素由羧基化细菌纤维素(缩写TBC)和羟基磷灰石(缩写HA)组成，羟基磷灰石与羧基化细菌纤维素的羧基形成螯合键，羟基磷灰石通过螯合键原位复合于羧基化细菌纤维素上，形成所述改性细菌纤维素。

需要说明的是，现有技术中，虽然也有少量的关于羟基磷灰石与羧基化细菌纤维素复合产物的研究报道，但是，其都是在细菌纤维素薄膜或支架的表面进行羟基磷灰石沉淀，形成类似珊瑚结构的产物，羟基磷灰石是静电吸附于细菌纤维素薄膜或支架的表面；而本申请的关键之一在于，羟基磷灰石与羧基化细菌纤维素的羧基形成螯合键，两者通过螯合键固定。相比而言，本申请的羟基磷灰石与羧基化细菌纤维素通过羧基螯合，能够有效的减弱纳米纤维间的氢键，降低羧基化细菌纤维素的结晶度，从而使得改性细菌纤维素成为可降解的材料。

优选的，羟基磷灰石原位复合于羧基化细菌纤维素的纳米纤维上，羧基化细菌纤维素为C6羧基化的细菌纤维素。

需要说明的是，本申请的关键在于，通过羟基磷灰石与羧基化细菌纤维素的羧基螯合，来减弱细菌纤维素纳米纤维间的氢键，从而达到使其可降解的目的，因此，两者结合的单位越小，效果越好。例如，本申请的一种优选的实现方式中，将羧基化细菌纤维素打成碎片，制成悬浮液，然后再使羟基磷灰石原位复合于其上。

优选的，羧基化细菌纤维素和羟基磷灰石的重量比为，羧基化细菌纤维素:羟基磷灰石＝1:0.5-2。

本申请的另一面公开了本申请的用于骨修复支架的改性细菌纤维素的制备方法，包括将细菌纤维素在无溴体系中进行表面氧化，制成羧基化细菌纤维素，然后再用原位复合的方法，把羟基磷灰石复合在羧基化细菌纤维素的纳米纤维上，获得改性细菌纤维素。

优选的，原位复合的方法包括，将羧基化细菌纤维素制成悬浮液，然后采用不同的滴定管，同时向悬浮液中滴加可溶性的钙源和磷酸根源，并保持反应悬浮液在pH值大于或等于10的碱性条件下进行反应，生成羟基磷灰石，羟基磷灰石与羧基化细菌纤维素的羧基形成螯合键，通过该螯合键原位复合于羧基化细菌纤维素上。

优选的，钙源包括但不仅限于Ca(NO₃)₂和/或CaCl₂，磷酸根源包括但不仅限于为(NH₄)₂HPO₄和/或H₃PO₄。

需要说明的是，钙源和磷酸根源，采用常规使用的合成羟基磷灰石的可溶性钙源或磷酸根源即可，本申请的实现方式中，钙源分别采用了Ca(NO₃)₂和CaCl₂，磷酸根源分别采用了(NH₄)₂HPO₄和H₃PO₄。

优选的，钙源和磷酸根源的滴定速度为0.5-2.5ml/min。

优选的，，制备方法还包括，在进行滴定时，边滴定边对反应悬浮液进行搅拌，以使生成的羟基磷灰石均匀的原位复合于羧基化细菌纤维素上，搅拌的速度为速1500-3500rmp。

优选的，保持反应悬浮液在pH值大于或等于10的碱性条件，具体为，向悬浮液中滴加碱液，使反应悬浮液保持在pH10-pH11，碱液包括但不仅限于NaOH溶液和/或KOH溶液。

需要说明的是，羟基磷灰石是在碱性条件下生成的，通常只要保障反应液的pH值大于等于10即可，本申请的实现方式中控制pH值在pH10-pH11，至于调节pH值，可以采用实验室常规使用的碱液，只要不直接参与或影响羟基磷灰石的生成反应即可，本申请的实现方式中分别采用了NaOH溶液和KOH溶液。

优选的，本申请的制备方法还包括，反应结束后，真空抽滤、洗涤，然后将产物装入骨修复支架模具中，在-25℃至-30℃温度下结冻，然后取出样品，在冻干机中冷冻干燥，获得多孔支架。

需要说明的是，冻结温度直接影响多孔支架的孔径，因此，优选的在-25℃至-30℃温度下结冻，至于冻结的时间，只要支架完全冻结即可，根据不同的配比，有些微不同，在此不做具体限定。

本申请的有益效果在于：

本申请的改性细菌纤维素，创造性的采用羧基化细菌纤维素的羧基与羟基磷灰石螯合，通过该螯合键减弱细菌纤维素纳米纤维之间的氢键，降低羧基化细菌纤维素的结晶度，从而使得改性细菌纤维素在体内具备可降解性，为其在骨修复支架中的应用奠定了基础。

附图说明

图1是本申请实施例中改性细菌纤维素的一种制备装置的结构示意图；

图2是本申请实施例中以改性细菌纤维素为材料制备的多孔支架的图片；

图3是本申请实施例中改性细菌纤维素的扫描电镜图；

图4是本申请实施例中改性细菌纤维素的杨氏模量数据图；

图5是本申请实施例中改性细菌纤维素的X射线衍射图谱；

图6是本申请实施例中采用改性细菌纤维素制备骨修复支架进行大鼠体内降解试验的组织切片染色图，A为手术后四周的切片图，B为手术后八周的切片图，C为手术后十六周的切片图，三个图中S区域为植入的骨修复支架，B图中，三角形区域是肌肉组织，矩形区域是结缔组织；

图7是本申请实施例中采用改性细菌纤维素制备骨修复支架，植入大鼠体内一段时间后，取出骨修复支架，测定的聚合度统计图。

具体实施方式

细菌纤维素是一种性能优良的生物医用材料，本申请的申请人曾经对其进行深入研究，并提出了对其C6进行羧基化的方法和试剂，大大提高了细菌纤维素的加工性能，从而拓展了其应用，详见专利CN103157515B。本申请中涉及到的羧基化细菌纤维素，其羧基化处理方法可以参考专利CN103157515B。本申请在之前研究的基础上进一步研究发现，细菌纤维素具备良好的生物相容性和机械耐受性，是制备骨修复支架的绝好材料；但是，存在一个问题就是，细菌纤维素在体内不降解。

在采用细菌纤维素作为骨修复支架的研究中，也有少量的研究报道指出，可以在细菌纤维素骨修复支架或薄膜上生物矿化羟基磷灰石，其中羟基磷灰石能够诱导骨的分化形成，对骨形态具有较强的亲和性。但是，这并没有从根本上解决细菌纤维素骨修复支架在体内不降解的问题。并且，现有的在细菌纤维素骨修复支架上生物矿化羟基磷灰石，通常是在细菌纤维素薄膜或者骨修复支架上矿化形成的类似珊瑚状结构，细菌纤维素和羟基磷灰石之间呈静电吸附。

本申请创造性的发现，在细菌纤维素羧基化处理后，即采用羧基化细菌纤维素与羟基磷灰石原位复合，控制反应条件，使羟基磷灰石与羧基化细菌纤维素的羧基螯合，形成螯合键，从而形成一种新的改性细菌纤维素。由于螯合键的存在，减弱了细菌纤维素纳米纤维之间的氢键，减低了细菌纤维素的结晶度，使得改性细菌纤维素成为可以降解的材料。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

本例以Ca(NO₃)₂为钙源，(NH₄)₂HPO₄为磷酸根源，对制备的羧基化细菌纤维素悬浮液进行滴定，原位复合制备本例的改性细菌纤维素。详细如下：

1.在三口烧瓶中加入，1克冻干后的细菌纤维素，以及300毫升的磷酸缓冲溶液，磷酸缓冲液的浓度为0.05摩尔/升，pH＝6.86，搅拌均匀。

2.搅拌中再依次加入0.016克2，2，6，6－四甲基－N－羟基哌啶(缩写TEMPO)，和1.5克NaClO₂，搅拌均匀。

3.取0.64ml分析纯NaClO溶液，加入到1mL去离子水中，混合均匀后，将其加入到步骤2的混合液体系中。其中，分析纯NaClO溶液的相对密度为1.10g/ml，10％有效氯，相对密度按照水＝1计算。

4.将步骤3制备好的混合液体系，即加入了分析纯NaClO溶液的混合液体系密封好，搅拌，加热到60℃。

5.加热24小时后，停止加热，向其中倒入50ml乙醇，10000r/min离心15分钟，获得溶胶状产品，放入-78℃冰箱，24小时。

6.从冰箱取出样品，冷冻干燥，冷阱温度-50℃，真空度0.05atm，冷冻干燥3天，获得纤维状干燥物料，即羧基化细菌纤维素，缩写TBC。

7.将(NH₄)₂HPO₄和Ca(NO₃)₂分别配成0.5M和1M水溶液。同时称取1g的TBC，将其放入200mL的清水中，用IKA均浆机在25000rmp转速下，分散均匀，获得悬浮液；然后，如图1所示，(NH₄)₂HPO₄和Ca(NO₃)₂溶液分别装入不同的滴定管中，第一滴定管1中装(NH₄)₂HPO₄溶液，第二滴定管2中装Ca(NO₃)₂溶液，控制两个滴定管的滴定速度为2ml/min，(NH₄)₂HPO₄和Ca(NO₃)₂溶液同时滴入TBC的悬浮液3中，在滴定的同时，TBC悬浮液在磁力搅拌器4上边搅拌边滴定，其搅拌速度为2000rmp，反应温度为室温。同时，在第三滴定管5中装入0.5M的NaOH溶液，向反应液中滴加NaOH，保持体系pH值为10.0。

需要说明的是，本例采用的是自己制备的羧基化细菌纤维素悬浮液，在一些特定情况下，例如购买的片状或块状的细菌纤维素或羧基化细菌纤维素时，还需要将细菌纤维素或者羧基化细菌纤维素打碎后制成悬浮液。

8.分别滴定反应1分钟-1小时，获得羧基化细菌纤维素和羟基磷灰石的重量比，羧基化细菌纤维素:羟基磷灰石＝1:0.25～1:10的改性细菌纤维素，此时改性细菌纤维素仍然以悬浮液形式存在，然后再将反应产物进行真空抽滤，并用清水洗涤3遍，将其装入圆柱形模具中，放入-30度冰箱中，冷冻48小时。需要说明的是，滴定反应的时间，根据(NH₄)₂HPO₄和Ca(NO₃)₂的浓度和滴定速度而定，考虑到反应效率，控制滴定反应时间在1分钟-1小时内，可以分别获得重量比羧基化细菌纤维素:羟基磷灰石＝1:0.25～1:10的改性细菌纤维素，本例具体分别制备了TBC:HA质量比为1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1:5、1:10的改性细菌纤维素用于试验。还需要说明的是，在冰箱中冷冻是为了后续的冻干后获得多孔支架，其中在冰箱冷冻的温度决定了多孔支架的孔径，因此，在本例的深入试验中，优选在-25℃至-30℃温度下冷冻的效果较好，能够获得孔径合适的多孔支架；至于冷冻时间，以将材料完全冻结为止，通常在48-72小时。

9.将将圆柱形样品放入冻干机中，冷冻干燥，冷阱温度-50℃，真空度0.05atm，冻干3天，得到多孔支架，多孔支架图片如图2所示。

采用扫描电镜观察本例制备的多孔支架，结果如图3所示，图3为放大5万倍的电镜扫描照片，可见，羟基磷灰石呈球形颗粒附着在羧基化细菌纤维素的纳米纤维上。

本例将TBC:HA质量比为1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1:5、1:10的改性细菌纤维素，分别制成支架；作为对比，本例还分别采用单纯的TBC和BC制成支架；利用万能力学测试机分别对各支架进行压缩实验，获得杨氏模量数据，将其制成图表，如图4所示，结果显示，BC和TBC制备的支架强度相当，而原位复合HA后，支架的强度降低了很多，但是，弹性增加，具有更好的柔韧性。因此，本例的改性细菌纤维素制备的骨修复支架更适合于除了承重骨以外的骨修复支架。综合考虑，本例制备的重量比羧基化细菌纤维素:羟基磷灰石＝1:0.5-2的改性细菌纤维素适合用于除承重骨以外的骨修复支架；羟基磷灰石含量太低无法达到改性的作用，即体内降解效果不佳，而羟基磷灰石含量太高又不能充分发挥羧基化细菌纤维素的性能。

另外，本例还分别对纯HA、纯TBC、TBC:HA质量比为1:0.5的改性细菌纤维素以及TBC:HA质量比为1:1的改性细菌纤维素，进行X射线衍射分析，X射线衍射图谱如图5所示。结果显示，纯TBC和纯HA的峰型尖锐，显示较高的结晶度；而复合TBC和HA后，峰型粗糙，为无定形态峰型典型特点，复合材料的结晶度明显降低，而降解都是从高分子的无定形态的结构部分开始的，因此，从理论上分析，复合TBC和HA后，具备了体内降解的可能性。

动物体内降解试验

以本例制备的TBC:HA质量比为1:0.5的改性细菌纤维素制备骨修复支架，将该支架植入大鼠大腿内侧，观察植入后不同时期的情况，具体的采用组织切片对植入后的支架进行观察。组织切片染色图如图6所示，图中A为手术后四周的切片图，B为手术后八周的切片图，C为手术后十六周的切片图，三个图中S为植入的骨修复支架。可见，支架植入大鼠大腿内侧4周后，材料周围被结缔组织包围，中间是材料间隙；8周后中间部分也被结缔组织包覆；16周时材料完全给结缔组织包覆，同时体积明显缩小。

将植入后不同时期的材料取出，洗去包覆在材料上的结缔组织，将支架溶于氢氧化钠，获得澄清溶液，在凝胶色谱中测试材料的分子量，通过分子量得到聚合度；具体的，本例分别测量了植入后1周、4周、6周、8周和16周的支架材料。结果如图7所示，可见，支架材料的聚合度下降，并且，用于试验的改性细菌纤维素支架材料在16周内在大鼠体内的确发生了降解。

在以上试验的基础上，本例分别对不同的钙源和磷酸根源进行了试验，除可以采用Ca(NO₃)₂和(NH₄)₂HPO₄以外，钙源还可以使用CaCl₂，磷酸根源还可以使用H₃PO₄。此外，对于钙源和磷酸根源的滴定速度，必须要在比较慢的速度下滴定，才能获得更好的反应产物，试验结果显示，滴定速度在0.5-2.5ml/min，所制备的改性细菌纤维素都能够满足使用需求。在滴定时进行搅拌是为了使反应更加充分的进行，试验结果显示，搅拌速度在1500-3500rmp即可。至于反应液的pH值，由于羟基磷灰石必须在碱性条件下才能生成，本例对不同的碱性条件进行了试验，结果显示，反应悬浮液保持在pH10-pH11效果更佳；而调节反应液酸碱性的方法，除可以采用NaOH溶液以外，还可以使用KOH溶液。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于骨修复支架的改性细菌纤维素，其特征在于：所述改性细菌纤维素由羧基化细菌纤维素和羟基磷灰石组成，所述羟基磷灰石与所述羧基化细菌纤维素的羧基形成螯合键，羟基磷灰石通过螯合键原位复合于羧基化细菌纤维素上，形成所述改性细菌纤维素；

所述羟基磷灰石原位复合于羧基化细菌纤维素的纳米纤维上；

所述原位复合的方法包括，将所述羧基化细菌纤维素制成悬浮液，然后采用不同的滴定管，同时向悬浮液中滴加可溶性的钙源和磷酸根源，并保持反应悬浮液在pH值大于或等于10的碱性条件下进行反应，生成羟基磷灰石，羟基磷灰石与羧基化细菌纤维素的羧基形成螯合键，通过该螯合键原位复合于羧基化细菌纤维素上。

2.根据权利要求1所述的用于骨修复支架的改性细菌纤维素，其特征在于：所述羧基化细菌纤维素为C6羧基化的细菌纤维素。

3.根据权利要求1或2所述的用于骨修复支架的改性细菌纤维素，其特征在于：所述羧基化细菌纤维素和羟基磷灰石的重量比为，羧基化细菌纤维素:羟基磷灰石＝1:0.5-2。

4.根据权利要求1-3任一项所述的用于骨修复支架的改性细菌纤维素的制备方法，其特征在于：包括将细菌纤维素在无溴体系中进行表面氧化，制成羧基化细菌纤维素，将所述羧基化细菌纤维素制成悬浮液，然后采用不同的滴定管，同时向悬浮液中滴加可溶性的钙源和磷酸根源，并保持反应悬浮液在pH值大于或等于10的碱性条件下进行反应，生成羟基磷灰石，羟基磷灰石与羧基化细菌纤维素的羧基形成螯合键，通过该螯合键原位复合于羧基化细菌纤维素上，获得所述改性细菌纤维素。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述钙源包括但不仅限于Ca(NO₃)₂和/或CaCl₂，所述磷酸根源包括但不仅限于为(NH₄)₂HPO₄和/或H₃PO₄。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述钙源和磷酸根源的滴定速度为0.5-2.5ml/min。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述制备方法还包括，在进行滴定时，边滴定边对反应悬浮液进行搅拌，以使生成的羟基磷灰石均匀的原位复合于羧基化细菌纤维素上，所述搅拌的速度为速1500-3500rmp。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述保持反应悬浮液在pH值大于或等于10的碱性条件，具体为，向悬浮液中滴加碱液，使反应悬浮液保持在pH10-pH11，所述碱液包括但不仅限于NaOH溶液和/或KOH溶液。

9.根据权利要求4-8任一项所述的制备方法，其特征在于：还包括，反应结束后，真空抽滤、洗涤，然后将产物装入骨修复支架模具中，在-25℃至-30℃温度下结冻，然后取出样品，在冻干机中冷冻干燥，制成多孔支架。