CN105025942B - 肽‑白蛋白水凝胶的性能及其应用 - Google Patents

肽‑白蛋白水凝胶的性能及其应用 Download PDF

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Abstract

描述了一种肽‑白蛋白水凝胶，具有自组装的、三维纳米纤维基质。所述纳米纤维基质包含两亲性的肽和白蛋白。所述肽包含末端疏水区域，中央转动区域和末端亲水区域。还描述了制备所述凝胶的方法，以及使用所述水凝胶作为组织工程支架，作为三维细胞培养物，进行药物传递，活性剂(治疗性细胞，分子，药物以及化合物)的包裹，细胞移植，细胞储存，病毒培养和储存的方法。

Description

肽-白蛋白水凝胶的性能及其应用
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年12月7日递交的，发明名称为肽-白蛋白水凝胶的性能及其应用的美国临时专利申请No.61/734,708的权益，其全部内容以全文参考的方式引入本文。
序列表
本发明含有计算机可读形式(CRF)的序列表，在2013年12月4日以名称为“序列表”的17.6KB的ASCII格式文本文件递交。CRF的内容以全文参考的方式引入本文。
技术领域
本发明涉及自组装的肽-白蛋白水凝胶。
背景技术
使用肽水凝胶作为可注射的材料，用于组织工程以及其他生物工程的应用，是过去几十年重要的发现。由于肽水凝胶具有高含水量和聚合物网络，是用于存储和转移蛋白质而不显著损失其生物活性的很有前途的材料。溶胶-凝胶转变发生在肽分子自组装成能聚拢水分子的结构明确的纳米纤维网时。因为这种转变发生在特定的温度和pH值下，肽水凝胶前体可以液相注入人体内，并且当在生物体内生理条件(例如，pH，温度)变化时转变成水凝胶，这对可注射应用非常重要。
特别需要具有剪切稀化特性且具有快速恢复特性的可注射的水凝胶。这种水凝胶应具有在剪切力的作用下急剧下降的储能模量，但当除去所述力后可以恢复。也需要形成肽水凝胶的改进的方法，该方法避免了需要对水凝胶溶液进行化学或环境修饰来诱导水凝胶的形成。
发明内容
本发明广义地涉及自组装的、具有三维纳米纤维基质的肽-白蛋白水凝胶。所述纳米纤维基质包含两亲性的肽和白蛋白(基本上由两亲性的肽和白蛋白组成或由两亲性的肽和白蛋白组成)。两亲性的肽包含一个末端疏水区域，一个中央转动区域以及一个末端亲水区域。
描述了形成肽-白蛋白水凝胶的方法。所述方法包括提供含有肽分散、溶解或悬浮在溶剂体系中的肽溶液，以及在室温下混合白蛋白源与所述肽溶液，以形成肽-白蛋白溶液。所述肽是两亲性的且包括一个末端疏水区域，一个中央转动区域和末端亲水区域。所述肽和白蛋白自组装成肽-白蛋白水凝胶而不需要调节肽-白蛋白溶液的pH值、温度、盐或离子成分。
本文也描述了使用肽-白蛋白水凝胶的方法，包括传递活性剂至患者的方法。所述方法包括向患者施用本文描述的任何实施例的肽-白蛋白凝胶，其中所述活性剂被包裹在水凝胶基质中。
附图说明
图1显示了肽-白蛋白混合物的TEM图像:图1a.h9e/BSA混合物，图1b.h9e/HSA混合物；
图2显示了h9e/BSA水凝胶的机械性能的图；
图3显示了h9e/HAS水凝胶的机械性能的图；
图4显示了在MEM中的肽的水凝胶化。A:提出了MEM-诱导的h9e肽自组装水凝胶化的机理(SEM图像显示了水凝胶基质的纳米纤维支架)。B和C:在37℃的条件下凝胶化的1mM、2mM、和3mM的肽水凝胶的储能模量G'。D:1mM肽水凝胶的SEM图像。E:3mM肽水凝胶的SEM图像；
图5显示了h9e水凝胶的动态流变学研究。A:1mM、2mM、和3mM的肽水凝胶的剪切稀化和恢复试验的储能模量G’。B:剪切应变从1％至500％且间隔为1分钟、5分钟和10分钟的四次振幅扫描试验。C:用移液管多次转移肽水凝胶；水凝胶被剪切稀化，但快速重新组装，而不永久性破坏水凝胶结构。D:在4℃和50℃之间的1mM、2mM、和3mM的肽水凝胶温度曲线试验；
图6显示了h9e-MSC水凝胶的动态流变学研究。A:水凝胶形成过程中1mM，2mM和3mM的h9e-MSC水凝胶的G’。B:2mM h9e-MSC水凝胶的剪切稀化和恢复试验的G'和G”。C:稀释20倍后的2mM的h9e-MSC水凝胶的G’和G”；
图7显示了h9e-2i水凝胶的动态流变研究。A:水凝胶形成过程中1mM，2mM和3mM的h9e-2i水凝胶。B:2mM h9e-2i水凝胶的剪切稀化和恢复试验的G'和G'。C:稀释20倍后的2mMh9e-2i水凝胶的G’和G”；以及
图8显示了h9e-2水凝胶和h9e溶液的稳定性。A.从第1天至第7天的h9e-2i水凝胶的G’。在所述h9e溶液在4℃的冰箱储存1、6、18和24天后h9e-2i混合物形成水凝胶。
具体实施方式
本发明涉及自组装的水凝胶及其制备和使用方法。水凝胶基质网络包括构成三维纳米纤维网络的水凝胶结构的肽和白蛋白。肽-白蛋白水凝胶的特征是水凝胶基质是“可逆”的，即在三维纳米纤维基质被剪切稀化(即，随着作用在凝胶上的剪切应力的速度增加粘度降低)，凝胶破坏之后可以迅速恢复，如下面更详细讨论的。所述水凝胶在多种应用中有用，包括用于组织工程的支架，三维(3-D)的细胞培养物，药物传递，以及包裹治疗剂(细胞，分子，药物，化合物)，可注射剂(包括原位凝胶，如止血组合物)，伤口敷料，药物载体或赋形剂，细胞移植，细胞储存，病毒培养，病毒储存等应用。
肽-白蛋白水凝胶具有多孔结构和通孔的均匀互联网络形态。在扫描电子显微镜下观察到，水凝胶基质的平均孔尺寸为约10μm至约80μm，优选约20μm至约60μm，且更优选约30μm至约50μm。平均孔尺寸的范围为约50nm至约200nm。在透射电镜(Transmissionelectron microscope)下测量，水凝胶肽以具有平均直径为约3nm至约30nm，优选约5nm至约20nm，并且更优选约8nm至15nm的肽纳米纤维的形式存在。所述肽纳米纤维具有约0.3μm至约5μm，优选约0.8μm至约3μm，更优选约1μm至约2μm的平均长度。
肽-白蛋白水凝胶的储能模量(与凝胶强度有关)至少约50Pa，优选至少约100Pa，更优选为约100Pa至约10,000Pa。可以理解通过改变所述肽和白蛋白的浓度，调节到特定的水凝胶强度以用于期望的凝胶应用。例如，对于可注射的水凝胶，水凝胶基质将具有约50Pa至约3000Pa，优选为从约70Pa至约1000Pa的储能模量。在一些实施例中，例如支架，可以形成很强的水凝胶，具有至少约300Pa，优选为约500Pa至约10,000Pa，并更优选为约1000Pa至约5000Pa的储能模量。这些凝胶强度是基于中性pH值(约为7)和室温的温度(又称为“常温”或约20-25℃)。
如上所述，水凝胶基质是可逆的。这意味着，用足够强的机械力(例如，剪切稀化)破坏凝胶之后，所述水凝胶在少于10分钟，优选少于约5分钟，更优选少于约2分钟(从破坏的凝胶除去剪切应力后)的时间内具有至少约60％，优选至少约80％，更优选至少约90％，甚至更优选约100％的恢复。如本文所使用的，水凝胶的“％恢复”是当破坏凝胶后然后重新水凝胶化得到的原始储能模量(凝胶破坏前)的百分比。换句话说，剪切稀化仅暂时破坏凝胶结构或架构。剪切稀化可以使用多种能在水凝胶上施加剪切应变或剪切应力的机械力，例如吹打，离心，震荡，注射，喷涂，过滤等来进行。如上所述，剪切稀化和破坏胶体结构后(即，去除或停止作用在所述破坏的凝胶上的机械力后)，凝胶的重组装或水凝胶化迅速地再次发生。即使多次破坏凝胶后，这种恢复特性仍然存在。有利的是，剪切稀化后破坏的基质也可以用溶剂稀释为基本上的液体溶液(例如，G'<0.2Pa)从而停止恢复过程。换句话说，当肽-白蛋白溶液稀释到肽浓度小于约0.1％重量，肽-白蛋白溶液保持在低粘度液化形式，并且不发生迅速重新组装。这种技术利于从水凝胶中分离，例如从细胞的液态肽-白蛋白溶液中分离(例如，通过离心)细胞或其他成分。这个过程可以通过在分离过程将液化的和稀释的肽-白蛋白溶液保持在低的温度(约4℃)来增强。
本发明的凝胶是水溶性的且在高达约90℃下温度稳定。如本文所用，“水溶性”指凝胶在形成后可用水稀释，而“温度稳定”指该水凝胶在从约1℃至约90℃的温度范围内不会变性。有利的是，不同于其他类型的凝胶，本发明的肽-白蛋白水凝胶的储能模量随温度上升而增加。
水凝胶是由肽与白蛋白源相结合而制备的。如本文所使用的，“白蛋白源”指一种或多种类型的可以直接与肽结合的(纯化的)白蛋白、含有一种或多种类型的白蛋白的组合物，以及白蛋白衍生物。
根据本发明，在一个或多个实施例中，该方法包括形成或提供肽溶液。该肽溶液包括(基本上由以下肽组成或甚至由以下肽组成)，以至少约0.1％，优选为约0.1％至约5％(重量)，更优选约0.3％至约3.5％(重量)，并且甚至更优选为约0.5％至约2％(重量)悬浮、分散、或溶解在溶剂体系中的肽，基于溶液的总重量按重量计为100％。干燥的(例如，冷冻干燥)肽适用于本发明，并且可以与溶剂体系形成肽溶液。所述肽溶液具有从约6至约8，优选为约6.5至约7.5，更优选为约7至约7.5，并且甚至更优选为约7的pH值。适合的溶剂体系包括碱性水溶液，如碳酸氢钠、氢氧化钠，氢氧化钾，及其混合物的水溶液。
所述肽溶液与白蛋白源例如包括白蛋白的成分(基本上由白蛋白组成或甚至由白蛋白组成的成分)组合。适合本发明使用的白蛋白的种类包括从植物或动物来源分离、提取、和/或纯化的白蛋白、以及合成的白蛋白，如重组/转基因白蛋白(例如，在植物系统中表达的人白蛋白)及其衍生物(例如，修饰的白蛋白，如生物素标记的，乙酰化的，糖基化的，硝化的等)。白蛋白本身可直接加入到肽溶液，或者它可以作为包含白蛋白的成分的一部分进行提供。这种成分的例子包括血清，含血清细胞培养基(例如，最低必需培养基(MinnimumEssential Medium,MEM)，Dulbecco氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s modified Eagle’smedium,DMEM)，罗斯韦尔公园纪念研究所培养基(Roswell Park Memorial Institutemedium,RPMI)以及Leibovitz培养基，CMRL 1066(Sigma)中以及和类似培养基。在一个或多个实施例中，白蛋白源可以和溶剂体系混合，例如水，以形成含有白蛋白(或白蛋白源)的溶液。然后将该溶液与肽溶液混合，优选在约室温下进行。所得的肽-白蛋白溶液具有基本上约6至约8，优选约6.5至约7.5，更优选约7至约7.5，并且进一步优选约7的中性pH值。
白蛋白的用量至少为约0.1％(重量)，优选约0.5％至约20％(重量)，更优选约1％至约10％(重量)，基于肽-白蛋白溶液的总重量(重量)为100％。肽的用量根据所需的水凝胶的功能而变化。在一个或多个实施方案中，肽的浓度为约0.1％至约10％(重量)，更优选为约0.15％至约5％(重量)，进一步更优选约0.2％至约1％(重量)，基于以肽-白蛋白溶液作为按重量计的100％。然而，用于伤口愈合或止血应用，更优选1％以上(例如3％至5％重量)的较高的肽浓度，以促进血液凝固并止血。该凝胶一般包含约0.1％至约3％(重量)的肽，优选约0.25％至约1.5％(重量)的肽，更优选约0.5％至约1％(重量)的肽，基于凝胶的总重量为100％。无论溶液或凝胶，肽与白蛋白的重量比优选为约100:1至约1:100，更优选为约10:1至约1:10，并且进一步优选为约2:1至约1:2。
可以理解水凝胶的所需性质可以通过改变肽和白蛋白在肽-白蛋白溶液中的相对浓度而变化。例如，较高的白蛋白浓度可以用于诱导快速形成凝胶，而较高浓度的肽可用于形成较高强度的凝胶。无论如何，一旦G'(储能模量)大于G”(储存损失)时，所述水凝胶形成。换言之，当成分达到自支撑的强度且不易仅由于其自身内部力量而变形时，认为该成分为水凝胶。当肽和白蛋白结合后小于约120分钟，优选小于约60分钟，更优选约15至约30分钟后形成水凝胶。再次，应当理解的是，这些参数可以通过改变白蛋白和肽的浓度而改变。
有利的是，水凝胶化在混合白蛋白溶液和肽溶液时诱导，而不需要对体系进行任何进一步的改变。即，所述制备方法不需要并且优选基本上不需要改变或调整体系pH值(例如，通过添加缓冲液)，化学成分(例如，通过添加离子)，或体系的温度。换句话说，不像其他水凝胶化技术，本发明的方法是优选基本上不含对肽-白蛋白溶液的化学或环境修饰来进行水凝胶形成。如这里使用的，“基本上不含”是指省略的成分或步骤并非有意添加或进行实施以实现凝胶化，可以理解，可以含有不会改变所述水凝胶的偶然的杂质或附属的步骤，也包含在本发明内。将所得水凝胶也优选基本上不含合成聚合物、多糖、脂类、不希望的缓冲剂(例如，柠檬酸盐/乳酸盐缓冲液等)以及类似物中的一种或多种。
如上所述，水凝胶有多种用途，包括用于组织工程的支架，药物传递等。有利的是，活性剂，包括治疗剂例如小分子药物和/或生物制剂(例如，酶和其他蛋白质和肽，以及DNA和RNA片段)，可以简单地被包裹在所述水凝胶中通过将活性剂加入至肽-白蛋白溶液中，使得在水凝胶化过程中包裹原位发生。由于肽-白蛋白溶液的中性pH(生理pH)，以及不在体系中进行化学和/或环境修饰以诱导水凝胶化，这种包裹技术特别适合包裹需要生理条件的生物治疗剂。水凝胶可以用在药物学上可接受的组合物中作为将活性剂施用给受试者的传递载体(例如，通过口服，静脉内，皮下，肌内，经鼻等)。
所述水凝胶也可用作止血组合物以止血和促进血液凝固并在患者伤口部位(例如，内部或外部的裂伤，擦伤，切口，穿刺等部位)凝胶化。有利的是，水凝胶可通过对患者施用所述肽-白蛋白溶液进行原位形成。另外，肽溶液可以单独被施用于患者，其中在患者的血液和/或血流中的天然(体内)白蛋白可以引发水凝胶在伤口部位原位形成。
所述水凝胶也可以被用作三维细胞培养物。例如，可以将要培养的细胞与肽-白蛋白溶液混合，并且特别地可以将要培养的细胞作为含血清细胞培养基的一部分添加到体系中。在水凝胶化过程中，细胞被包裹到水凝胶基质内。然后，水凝胶可以被应用(涂覆，接种等)到细胞培养板或微孔用于细胞培养。在一个或多个实施例中，可用额外的细胞培养基覆盖水凝胶以防止干燥，且可以在细胞培养条件下(即取决于细胞类型，用于细胞维持和/或生长的适当的条件)培养含有细胞的水凝胶。因为水凝胶的可逆性质，培养的细胞以后可以从该水凝胶中分离。例如，对水凝胶上施用机械力结合对水凝胶进行稀释(例如，用另外的细胞培养基或其他溶剂)破坏水凝胶基质。所得的液化肽-白蛋白和细胞混合物可以被分离以分离培养的细胞。这种技术适用于各种类型的细胞，包括干细胞，癌细胞，原代细胞，正常细胞，神经元细胞等。
线性且自组装的肽被用于形成该水凝胶。适用的肽在WO2011/112856中描述，并且与本发明不相抵触的内容以参考的方式全部引用。所述肽包含三个段或区域(基本上由三个段或区域组成或甚至由三个段或区域组成)：一个末端疏水区域，一个中央转动区域和一个末端亲水区域。该转动区域位于疏水区域和亲水区域之间，并优选直接连接该疏水区域和亲水区域。因此，该肽是两性的，一端的肽段是相对亲水的(又名“亲水性”)，而另一端的肽段是相对疏水的(又名“疏水性”)，并且该中央转动区域提供转动和折叠的灵活性。如果肽的一个区域比相应的肽的疏水区域有更大的亲水性，则该区域在本文所公开的内容中被认为是“亲水性的”。同样地，如果肽的一个区域比相应的肽的亲水段有更大的疏水性，则该区域在本文所公开的内容中被认为是“疏水性的”。相应地，可以理解为，疏水区域可仍然包括一个或多个亲水性氨基酸残基，只要该区域的整体性质为比肽的相应亲水区域更疏水。类似地，亲水区域可以包括一个或多个疏水性氨基酸残基，只要该区域的整体性质仍为较该肽的相应疏水区域更亲水。如本文所使用的，应当理解为，当提到的氨基酸作为肽的一部分时，所述氨基酸是实际上的氨基酸残基，不管是否“残基”被特别指出。
疏水区域是优选为弹性的，且能够结合第I族和第II族的金属(特别是钙)。优选的疏水区域包含约2至约15个氨基酸残基，优选约4至约9个氨基酸残基，并且更优选为约5个氨基酸残基(所述疏水区域基本上由以上氨基酸残基组成或甚至由以上氨基酸残基组成)。氨基酸残基优选选自F，L，I，V和A。在一个或多个实施例中，疏水区域选自FLIVI(SEQ IDNO:2)，GLIVI(SEQ ID NO:5)，PLIVI(SEQ ID NO:6)，DLIVI(SEQ ID NO:7)，VLIVI(SEQ IDNO:8)，ILIVI(SEQ ID NO:9)，LLIVI(SEQ ID NO:10)，ALIVI(SEQ ID NO:11)，FGIVI(SEQ IDNO:12)，FPIVI(SEQ ID NO:13)，FDIVI(SEQ ID NO:14)，FVIVI(SEQ ID NO:15)，FIIVI(SEQID NO:16)，FAIVI(SEQ ID NO:17)，FLGVI(SEQ ID NO:18)，FLPVI(SEQ ID NO:19)，FLDVI(SEQ ID NO:20)，FLVIV(SEQ ID NO:21)，FLAVI(SEQ ID NO:22)，FLIGI(SEQ ID NO:23)，FLIPI(SEQ ID NO:24)，FLIDI(SEQ ID NO:25)，FLIII(SEQ ID NO:26)，FLILI(SEQID NO:27)，FLIAI(SEQ ID NO:28)，FLIVG(SEQ ID NO:29)，FLIVP(SEQ ID NO:30)，FLIVD(SEQ IDNO:31)，FLIVV(SEQ ID NO:32)，FLIVL(SEQ ID NO:33)，和FLIVA(SEQ ID NO:34)。在一个或多个实施例中，所述疏水性区域是FLIVI(SEQ ID NO:2)。
优选的亲水区域包含约5至约20个氨基酸残基，优选约5至约10个氨基酸残基，更优选为约10个氨基酸残基(所述亲水区域基本上由以上氨基酸残基组成或甚至由以上氨基酸残基组成)。更优选地，亲水区域包含选自G，P，D，V，I，L和A的氨基酸残基。在一个或多个实施例中，亲水区域选自[GPXXD]n(SEQID NO:35)，[GXXPD]n(SEQ ID NO:36)，[GXPXD]n(SEQID NO:37)及其组合，其中n＝1-6，并且每个X单独选择选自G，A，D，R，Q，E，S，T，K和P。在一个实施例中，亲水区域包括，优选由以下组成，任何顺序的GPGX1DGPGX1D(SEQ ID NO:38)的氨基酸残基，其中X1选自G和A。另一个的实施例中，亲水区域包括，优选由以下组成，任何顺序的GPGX1DGPGX1D(SEQ ID NO:38)的氨基酸残基，其中X1选自G和A。进一步的实施例中，亲水区域包括，优选由以下组成，顺序为或任何顺序的GPGX2DGX3X2X2D(SEQ ID NO:39)的氨基酸残基，其中每个X2各自选自A、G、V、I和L，并且X3为选自P、A、G、V、I和L。另一个实施例中，所述亲水区域包括GPGX2D(SEQ ID NO:40)的氨基酸残基，其中X2同如上所定义。此外，亲水区域可以选自[GPGX2DGX3X2X2D]n(SEQ ID NO:39)和[GPGX2D]n(SEQ ID NO:40)的氨基酸残基，其中n为1至10，且更优选为1至5，和X2和X3定义如上。
最优选的亲水区域包括GPGGDGPGGD(SEQ ID NO:4)(以任何顺序，但优选以该顺序)，或与该序列具有至少约60％的同源性，并保留其功能特性的片段或变体。更优选地，与该序列的同源性％为至少约80％，进一步优选为至少约90％，并保留其功能特性。
对于本设计中的功能性水凝胶-形成的肽，疏水区域不直接连接亲水区域，但两者之间包括一个转动区域。该转动区域提供结构的灵活性，使亲水性残基的潜在带电的侧链接近并帮助隔离疏水性和非疏水性侧链。因此，可以理解的是，因为中央区域由具有小的侧链的氨基酸组成，该小的侧链使其具有灵活性且可以在肽的所述区域“转动”，所以该中央区域被认为是在本发明的上下文中的“转动”区域。
优选的转动区域包括约1至约12个氨基酸残基，优选约4至约8个氨基酸残基，优选4个氨基酸残基。本发明的肽的转动区域优选包括选自G、L、I、V、A、S和T的氨基酸残基。在一个或多个实施例中，转动区域选自G，GG，GGG，GGGG(SEQ ID NO:41)，GSX4X4(SEQ ID NO:42)，X4GSX4(SEQ ID NO:43)，X4X4GS(SEQ ID NO:44)，SGX4X4(SEQ ID NO:45)，X4SGX4(SEQ ID NO:46)，X4X4SG(SEQ ID NO:47)，GX4SX4(SEQ ID NO:48)，X4GX4S(SEQ ID NO:49)，SX4GX4(SEQ IDNO:50)，X4SX4G(SEQ ID NO:51)，GX4X4S(SEQ ID NO:52)和SX4X4G(SEQ ID NO:54)，其中每个X4各自选自G，I，V，A，L，S(其中在列出的所有序列中S可以被T取代)。一个优选的转动区域包括，优选由以下氨基酸残基组成，X5SX6X6(SEQ ID NO:54)的氨基酸残基，以任何顺序(甚至更优选以该顺序)，其中X5选自G、I和V，G为特别优选的，并且每个X6是独立地选自G，I，V，A和L，I是特别优选的。优选地，X5或X6中的至少一个是G，特别优选的是至少X5是G。在一个实施例中，X5SX6X6的S(SEQ ID NO:54)能够被T取代。在一个或多个实施例中，转动区域为GSII(SEQ ID NO:3)。
所述肽优选短肽。即优选的是，所述肽具有少于大约30个的氨基酸残基，更优选少于约20个氨基酸残基，并且进一步优选具有19个氨基酸残基。根据本发明，最优选的肽包括(基本上由以下氨基酸序列组成或甚至由以下氨基酸序列组成)FLIVIGSIIGPGGDGPGGD(SEQID NO:1)的氨基酸序列，或其片段或变体，所述片段或变体与该序列具有至少约60％的同源性，更优选与该序列具有至少约80％同源性，且更进一步优选为与该序列具有至少约90％的同源性，并保留其功能特性。
最后，该肽将具有分子量为约600Da至约4500Da的平均重量，更优选约1000Da至约3000Da，且进一步优选约1740Da。
所述肽可以通过微波合成器，微生物合成(microbiosynthesis)，发酵，或遗传工程技术来制备。一种优选的方法包括结合来自蜘蛛丝的弹性段和人肌肉L型钙通道的跨膜片段的两个天然序列。更具体地，最优选的亲水区域GPGGDGPGGD(SEQ ID NO:4)，优选是由蜘蛛拖丝蛋白的β-螺旋模体设计而来，并且最优选的疏水区域FLIVI(SEQ ID NO:2)和转动区域GSII(SEQ ID NO:3)衍生自二氢吡啶敏感是人肌肉的L型钙离子通道的亚基IV的第三跨膜片段。沉淀和洗涤后，为了储存直至使用，肽可以冷冻干燥(冻干)。
本领域的技术人员在阅读所公开的以及如下实例时，本发明的各种实施例的其他优点是显而易见。应当理解为，这里描述的各种实施例不一定是相互排斥的，除非本文另有说明。例如，在一个实施例中描述或描绘的特征也可以被包括在其他实施例中，但不是一定包括在内。因此，本发明包括各种所描述的具体实施例的组合和/或集合。
如本文所用的，当“和/或”用于两个或两个以上项目时，是指所列出的项的任何一个可以单独或所列项目两个或多个以任意组合结合使用。例如，如果一个组分被描述为含有或不含组分A，B和/或C，则组分可以只含有或只不含有：单独A；单独B；单独C；A和B的组合；A和C的组合；B和C的组合；或A，B和C的组合。
本说明书中还使用数值范围以量化关于本发明的各种实施例的某些参数。应当理解的是，当提供数值范围时，此范围应理解为提供了对仅记载了范围的最小值的权利要求限定，以及仅记载了范围的最大值的权利要求限定的字面上的支持。例如，当公开了约10至约100的数值范围提供了对记载了“大于约10”(无上限)和“小于约100”(无下限)的权利要求的字面支持。
示例
如下实施例阐述了根据本发明的方法。然而应当理解为，这些实施例仅以说明的方式提供，不应作为对本发明的总的范围的限制。
示例I
肽-白蛋白水凝胶的形成和性质
背景介绍
由于肽水凝胶独特的三维网络，其不仅为三维细胞培养提供了一种模拟细胞外基质条件的体外环境，也可以作为靶向药物或基因传递以及生物分子的控制释放的辅助载体。随着肽水凝胶在生物医学应用中快速发展，利用温和的方法引发肽溶液变成水凝胶以应用这些材料吸引了越来越多的关注。在我们最近的研究中，我们发现，在牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)的引发下，不添加任何其它金属离子或调节环境的pH值或温度的条件下，h9e肽在可以自发地组织到可注射的水凝胶材料里。这是首个发现的合理设计的肽通过与白蛋白分子结合自组装成水凝胶。本研究的目的是要了解白蛋白如何引发h9e肽自组装成水凝胶。水凝胶的储能模量以及水凝胶形成速率受到肽和白蛋白的浓度的影响。因为白蛋白是人血清中最丰富的蛋白质，被认为对分子运输，酸碱平衡以及维持渗透压的最重要的蛋白质，通过与白蛋白结合形成水凝胶具有巨大潜力用于广泛的应用。
方法和材料
1.肽合成和水凝胶的制备
利用基于自动碱不稳定的9-芴甲氧羰基(Fmoc)策略及Fmoc-保护的氨基酸(EMDBiosciences公司，圣地亚哥，CA)的CEM自由微波肽合成仪(CEM公司，马修斯，NC)合成肽。用95％三氟乙酸(Sigma-Aldrich公司，密尔沃基，WI)、2.5％三异丙基硅烷(Sigma)以及2.5％去离子水裂解肽。用无水乙醚(Fisher Biotech公司，费尔劳恩，新泽西州)将粗肽洗涤三次。之后，将肽溶于乙腈和蒸馏水(DI)(50/50体积/体积)中。在-80℃冷冻柜中，将肽溶液冷冻过夜，然后使用Labconco冷冻干燥系统(Labconoco，堪萨斯城，密苏里州)将所述溶液冷冻干燥48小时。水溶液中的肽的pH值是3.6。合成肽的分子量用Ultraflex II设备上的基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(Bruker Daltronics公司，Billerica，MA)确认。肽的纯度用Beckman系统金高效液相色谱仪(HPLC，贝克曼库尔特公司，富勒顿，CA)在phenomenex synergi 4μHydro-RP柱上(Phenomenex，公司，Torance，CA)，使用以下梯度确认，10-90％B 20分钟:(A：99.9％水，0.1％三氟乙酸；B：90％乙腈，9.9％水，0.1％三氟乙酸)。
白蛋白引发水凝胶的形成，10mM肽(1.74重量％)首先溶解在100mM碳酸氢钠溶液中。BSA和HSA以5％(重量)的浓度溶于水中。肽溶液和白蛋白溶液，即1、2、3mM的h9e肽与0.1-5重量％的白蛋白以不同的比例混合形成最终混合物。
2.透射电子显微镜(TEM)
肽溶液用负应变方法制备，其中将20μl的肽溶液置于用福尔瓦/碳包覆(Formvar/carbon-coated)的200目的铜格上(电子显微镜科学，华盛顿堡，PA)1分钟。在常温条件下，将多余的溶液除去并且将TEM格浮在2％(重量/体积)乙酸双氧铀(拉德研究工业公司，伯灵顿，VT)的上表面60秒。在成像前，TEM格被除去并干燥。样品用CM100TEM(FEI公司，希尔斯伯勒，OR)在100千伏的条件下进行观察。
3.流变
具有不同的肽/白蛋白比例的h9e水凝胶的储能模量(G')和损耗模量(G”)，用具有直径20mm平行板测试系统的流变仪系统C-VOR(马尔文仪器，马尔文，伍斯特郡WR141XZ，英国)测定。所有的流变试验在37℃的条件下进行。为了确定水凝胶的形成速率，肽和白蛋白混合物制备后立即放入测量系统里并用具有稳态剪切应变(1％)的单一频率(1Hz)方法测试1小时。
4，水凝胶性能
我们发现细胞培养基中的血清是帮助水凝胶形成的重要因素：在没有任何额外的化学添加或调节环境的条件下，h9e肽溶液可被直接加入到具有10％血清的最低必需培养基(MEM)中，并在1分钟内转移至自支撑水凝胶基质内。然而，如果不含血清的MEM不能有效地诱导该溶液到凝胶的转变。在其它细胞培养基中，如Dulbecco氏修饰的Eagle’s细胞培养基(DMEM)、罗斯韦尔公园纪念研究所培养基(RPMI)以及Leibovitz培养基(L-15)，这种现象被进一步观察到。因为血清有极其复杂的组成，因此确定引发水凝胶形成的主要因子是困难的。筛选大量血清的化合物后，我们关注血清中最丰富的蛋白质之一，即白蛋白，其含有带电基团和多个表面结合结构域。有意思的是，h9e肽在具有1wt％白蛋白的不含血清的N2B27补充性2i培养基中形成水凝胶证实了我们的假设。
为了证明由白蛋白诱导的肽自组装路径，制备h9e/BSA和h9e/HSA混合物并在TEM下观察。图1显示了肽纳米纤维结合在所述两个白蛋白的表面上。图1a显示了BSA连接到该肽纳米纤维上并沿纤维生长方向存在。类似地，图1b显示了肽纳米纤维接触HSA的表面的一个点到另一个。这些可见数据证实h9e肽和白蛋白分子的相互作用。此外，该水凝胶形成过程可由流变测试监测。图2a显示了3mM h9e肽溶液在混合5％BSA后储能模量(G')立即变化。在30分钟的测试过程，与牛顿液体3mM h9e溶液或5％BSA溶液不同，所述h9e/BSA混合物的机械强度在第一个500秒内一直增加，并达到稳定的G'约为200Pa。
通过测试机械强度以及3mM h9e与0.1％-5％(重量)BSA的水凝胶形成速率，h9e肽与BSA的关系进一步探讨。图2b显示了令人关注的现象：用相同肽浓度形成的h9e/BSA的水凝胶的最终强度与BSA浓度不相关。例如，经过2个小时的试验后，用0.1重量％BSA的肽的G'为约110Pa。而用0.5重量％的BSA形成的肽水凝胶的G'增加至超过900Pa，但在使用1重量％和5重量％的BSA时，分别逐渐减少至680Pa和200Pa。另一方面，在第500秒放大图(图2c)显示了G'的增加率与BSA的浓度相关，这表明白蛋白帮助肽分子自组装成水凝胶；同时，正如我们以前的研究所建议的，动力学是肽自组装的一个关键因素，相对较低的BSA浓度使肽的组装速率变慢，且导致了具有更强机械强度的更好的纳米结构布置。
还研究了不同的肽浓度(1-3mM)与具有恒定的BSA浓度(1重量％)的混合物。较高的肽浓度会使水凝胶更强和更快的生长。经过2个小时的试验，1mM的肽溶液与1％(重量)BSA的溶液表现类似于牛顿液体，表明存在对水凝胶形成过程重要的肽与BSA浓度。类似现象也在h9e/HSA混合物中发现(图3)：当3mM h9e肽与5％(重量)HSA混合时形成水凝胶(图3a)，与h9e/BSA混合物相比，水凝胶的强度和形成速率对HSA的浓度更加敏感。当肽浓度为1mM或者HSA的浓度为0.5％(重量)，不形成水凝胶，这再次表明形成h9e/HAS水凝胶需要两种化合物的临界浓度(图3b,c)。
示例II
各种细胞培养基中的肽h9e水凝胶性质
背景介绍
二维(2D)基板，例如组织培养聚苯乙烯和组织类似物的表面，对现代的体外细胞研究了做了巨大的贡献；然而，传统的2D平台不能准确地模仿复杂的天然细胞驻留的细胞外基质(ECM)的复杂的三维结构。在2D培养中，单层细胞在均匀的营养物和生长因子的浓度下诱发非天然的细胞环境以及细胞-细胞相互作用下，得到平坦且拉伸形态。最近的研究表明，细胞在二维和三维培养下具有形态差异，且表现出多种微妙的细胞过程显著不同：如在增殖，凋亡，分化，基因表达，迁移和药物敏感性方面。另一方面，所述生物体内的三维系统，例如动物模型，既昂贵又费时。因此，需要先进的体外3D模型系统以填补不准确的2D系统和动物模型之间的空缺以模仿ECM的复杂性与体内的生物系统的生理相关性。
在过去的几十年中，为了试图模拟细胞培养的体内条件具有高含水量的水凝胶支架及交联的网络吸引了越来越多的关注。具有较高的水含量交联的聚合物链的网状结构引入了许多满足需要的细胞微环境特性：三维空间用于支持细胞生长；孔隙用于细胞迁移；以及使氧气，营养物质，废物和可溶性因子的易于运输。水凝胶可以由一系列的天然来源的和合成的材料形成。从ECM组分以及其它生物来源，如胶原，纤维蛋白，透明质酸，壳聚糖和藻酸盐得到的天然凝胶具有生物相容性及促进多种细胞类型的细胞存活，增殖，分化和细胞功能的内在生物活性。然而，天然水凝胶具有不同的生化表达和难以控制的材料性质，这增加了在此培养系统进行细胞研究的风险性和复杂性。另一方面，合成的凝胶可以很好的以一致的组分和可预测操纵的性质重新制备。然而，合成的聚合物如聚丙交酯和聚乙交酯具有过大的纤维直径和孔径，表现出不好的支架结构和机械性能，因而不能准确地模仿细胞生长的天然环境的全部复杂性。随着作为生物材料合理设计的肽的快速发展，由于氨基酸组成、结构和机械性与天然ECM相似，基于肽的水凝胶被认为是用于三维细胞培养的最具潜力的材料之一。
此外，对于体外三维细胞培养，细胞包裹和分离分别是引入三维空间支持用于细胞生长，以及从支架基质中回收嵌入的细胞用于下游研究的两个关键步骤。为了方便、有效和安全的包裹，细胞应在起始水凝胶化的同时加入。因此，优选温且细胞兼容水凝胶形成的条件，以确保在凝胶形成的过程中，细胞容易存活。然而，目前使用的肽/蛋白质的水凝胶(即puramatrix凝胶，hydromatrix肽水凝胶，和基质胶(matrigel))的溶胶-凝胶转变通过调节pH或温度引发(见表1)。
表1.比较不同三维细胞培养水凝胶的材料性能、细胞包裹/恢复及处理
当细胞与预凝胶溶液直接混合时，不希望的预凝胶溶液的低pH值或冷温可能会导致细胞死亡。为了pH值的平衡而改变细胞培养基或需要低温实验工具时，水凝胶制备过程变得复杂(见表1)。在凝胶形成过程中，在细胞培养基加入前，保持在没有营养成分的蔗糖溶液或凝胶形成缓冲液中的细胞可以维持几小时。而且，从水凝胶基质中分离细胞是对三维细胞培养的另一项挑战。在大多数情况下，将环境因素改变为极端条件或添加不希望的缓冲液使水凝胶降解是在细胞能被分离之前起始凝胶-溶胶转变所必须的(见表1)。这个过程会威胁培养的细胞的存活，并可能导致整个下游研究的失败。因此，有必要开发一种水凝胶，不仅可以方便且有效的包裹细胞，而且还可以为进一步的细胞生理学和病理生理学的研究简单提供安全的细胞分离。
材料和方法
在癌细胞培养基中的肽-基质水凝胶
h9e溶液在中性pH(～7)下制备并在室温下与最小必需培养基(MEM，含10％FBS(白蛋白源))混合。混合后，h9e肽自组装入水凝胶基质中，最终的肽浓度低至1mM(0.17％)。在不加入任何额外的凝胶形成缓冲液或不调节pH值或温度的情况下，该肽提供了方便且温和的水凝胶形成过程并且使细胞在细胞包裹过程中被培养基包围(见表1)。更令人关注的是，这种水凝胶基质的机械强度呈现出特殊的可变形和重新组装的能力，这允许通过反复吹打进行凝胶-溶胶转变。
乳腺癌细胞系MCF-7被选为在3D h9e-MEM中进行生长的模型。对细胞形态、生存能力和增殖的研究表明，细胞在水凝胶基质中呈现三维的细胞结构，并能在分离后仍保持高生物活性以用于进一步的研究。
1.肽的合成和凝胶化
基于先前发表的方法来合成该h9e肽。简要地，在自动CEM自由微波肽合成仪(CEM公司，马修斯，NC)上根据碱不稳定的9-芴甲氧羰基(Fmoc)策略用Rink酰胺树脂和Fmoc保护的氨基酸合成肽。当最终N-末端Fmoc基团去保护后，对所述树脂结合的肽的侧链去保护，并用TFA/TIS/水(95/2.5/2.5体积比)切断。肽用无水乙醚沉淀和洗涤三次，溶于乙腈和去离子水(50/50体积比)中，然后冷冻干燥。合成肽的分子量和纯度用基质辅助激光解吸/电离飞行质谱与高效液相色谱联用仪确定。
将冻干的肽加入到100mM碳酸氢钠中，并通过磁力搅拌3小时至完全溶解，最终肽的浓度为10mM。对于水凝胶化，将肽溶液加入到具有10％FBS的MEM中，将混合物手工摇动约10秒钟。肽水凝胶在室温下15分钟内形成，其中最终肽的浓度为1mM、2mM和3mM。
2.流变试验
h9e水凝胶的储能模量和损耗模量(G'和G”，分别地)用具有直径为20mm的平行板几何形状和500μm间隙大小的C-VOR150流变仪系统(马尔文仪器，马尔文，伍斯特郡WR141XZ，英国)确定。为了模仿细胞生理条件，除非另有规定，所有的流变试验均在37℃进行。在凝胶形成速率试验中，肽和MEM的混合物在混合后立即放入测量系统。选择单一频率(1Hz)和稳定的剪切应变(1％)进行1小时试验。为了确定水凝胶重新组装的能力，肽和MEM的混合物在室温下过夜进行培育以水凝胶化，然后将其转移到较低的测量板进行10分钟的单一频率试验(1Hz，1％应变)以稳定化。在1Hz的频率和500％的剪切应变的条件下1分钟将水凝胶破坏。用1分钟重置仪器参数，在1小时的1Hz的频率和1％的剪切应变下测量重新组装期间的水凝胶模量。多次进行振幅扫描试验(应变从1至500％，1Hz频率)以确定水凝胶每次被破坏后其重新组装的能力。测定中应用四个测试周期，每两个周期之间的水凝胶恢复时间为1、5和10分钟。此外，为了测试对不同环境温度的反应，用具有稳定振荡频率(1Hz)和应变(1％)的温度分布试验对肽水凝胶进行测定。在两个测试周期中，将温度从4℃调整到50℃。对于每一个周期，仪器的加热或冷却过程为5分钟，然后用另外的5分钟以达到设定温度(4℃或50℃)。为了确定在细胞分离过程中水凝胶的G'和G”，3mM的肽水凝胶用MEM稀释15倍。彻底搅拌后，将稀释的溶液在1Hz的频率、1％的剪切应变以及4℃的条件下测试1小时。
3.扫描电子显微镜(SEM)
在SEM下观察水凝胶支架的纳米纤维网络以及在3D培养的细胞的表面特征。水凝胶样品用从50％至100％(体积/体积)增高的乙醇浓度进行脱水，每步增加5％，每步为15分钟。然后将乙醇用临界点干燥器(Samdri-790B，Tousimis Research公司，美国马里兰州罗克维尔)除去。在脱水和临界点干燥前，将含细胞的水凝胶样品在2％多聚甲醛和2％戊二醛的混合物中固定30分钟。然后样品用100％的铅溅射镀膜(Desk II溅射/刻蚀单元，丹顿真空，莫里斯敦，NJ)3次(每次12秒)。用FEI,NanoSEM 430(希尔斯伯勒，ON)，在5千伏的条件下通过透镜探测器进行SEM观察。
结果与讨论
1.MEM中的肽凝胶化
为了引发凝胶的形成，将100μL的10mM的h9e肽溶液(pH 7-8)加到900μL的最低必需培养基(MEM，10％FBS(白蛋白源))中，以形成含有1mM(0.17％重量/体积)肽浓度的1mL的混合物(图4A)。水凝胶基质的纳米级形态通过SEM图像呈现(图4A)。混合中性pH的肽溶液与MEM直接引发的肽水凝胶化，不仅避免了复杂的化学凝胶的交联过程，而且还利用在生物和医学研究中常用的介质，为细胞包裹提供了生理条件。
在凝胶形成过程中直接装载药物、蛋白质或细胞是最方便和有效的进行包裹的方式。为了确保嵌入分子的均匀分布，肽应在相对短的时间内装配为纳米纤维网络并具有合理的强度以在悬浮的分子沉淀前起到支撑的作用。为了确定肽凝胶的形成速率，我们制备1mM(0.17％重量/体积)，2mM(0.34％重量/体积)和3mM(0.51％重量/体积)三个浓度的水凝胶的MEM溶液。经充分混合后，该溶液的储能模量立即在37℃的条件下测定。图4B显示了分别具有约100、400和700Pa的稳定储能模量的h9e肽水凝胶的形成。凝胶形成速率随肽浓度的增加而增加(图4B的插图)，并且所有三个水凝胶在15分钟内达到了自支撑强度(接近或高于100Pa)。SEM图像(图4C、D)表明，该水凝胶结构是由20nm宽的纳米纤维缠绕构建而成；然而，较低浓度的水凝胶(1mM，图4C)与较高浓度的具有紧凑结构的水凝胶(3mM,图4D)相比，具有相对松散的基质结构。这种可见证据进一步支持不同浓度的水凝胶强度不同。2.h9e水凝胶的动态流变学研究
用动态流变试验对MEM诱导的h9e水凝胶的可变形性和重新组装能力进行了评估：将1-3mM的肽水凝胶在室温下储存过夜，然后将其转移到测定系统并稳定10分钟。在500％应变1分钟下进行剪切稀化，所有三个水凝胶均转化为液态，G'低于0.2Pa(图5A)。然后停止剪切稀化，在1分钟的等待时间后，重置仪器参数，使用1％的剪切应变1小时监测水凝胶的恢复。图5A显示了在1小时的试验中水凝胶G'的恢复。为了确定在进行了多次的剪切稀化后该水凝胶是否仍具有重组能力，用多次振幅扫描试验对水凝胶进行测定。试验应用了四个测试周期，每个周期剪切应变在5分钟内从1％增加至500％。之后，对于水凝胶的恢复，分别等待1、5和10分钟。图5B表明，虽然该水凝胶的结构在每个周期结束时被完全破坏成液态，即使经过多次剪切稀化后，其快速重组的能力仍然存在。该结果还表明，G'的恢复百分比随等待时间以及与水凝胶的浓度相关的水凝胶重新组装速率的增加而增加。例如，在1分钟时，1、2和3mM的水凝胶，凝胶强度可以分别恢复约73％、76％和88％，但经过3个剪切稀化周期和10分钟的等待后，凝胶强度可以恢复83％(1mM)，84％(2mM)和100％(3mM)(图5B)。较高的重组率很可能是由于较高的肽浓度(3mM)使水凝胶产生更紧凑的基质结构而引起的(图4D)。在高肽浓度的溶液中，一些非共价凝胶网络的交联保持完好且破坏后的纳米纤维团彼此接近，使得重建该交联很容易。基于这些流变性质，可以通过多次移液传递所述MEM诱导的h9e水凝胶而不会永久破坏水凝胶的结构(图5C)。水凝胶的这种特殊剪切稀化和恢复性质提供了一种替代的用于通过机械剪切和稀释从水凝胶基质分离细胞的方法。
对于生物学研究，介于4℃和37℃之间的温度是多种体外标准操作程序通常使用的；因此，理解水凝胶材料对这些温度变化的响应对其实际应用有很大的影响。进行流变温度分布试验来应对这个挑战。在两个测试周期中，将温度从4℃调整到50℃。图5D显示了水凝胶的G'随温度变化，在50℃比4℃高2-3倍。根据水凝胶加热和冷却周期，这种热反应是可逆的(图5D)。该结果为使用这种肽水凝胶作为三维细胞培养的基质提供了支持：当保持在37℃时，该水凝胶基质可变硬用于细胞包裹，但在4℃使用标准离心法分离细胞时该水凝胶基质可变软。
B.干细胞培养基中的肽-培养基水凝胶
两种不同类型的干细胞培养基被选择用于此试验。一种用于间充质干细胞的含2％(体积/体积)胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)的低葡萄糖DMEM培养基(MSC培养基)。另一种是用于小鼠胚胎干细胞的含0.5％(体积/体积)牛血清白蛋白(BSA)的N2B27补充性的无血清2i培养基(ESC,2i培养基)。在时间扫描流变测试下监控水凝胶形成过程1小时。并测试了h9e肽水凝胶的特殊剪切稀化和自愈性能。当水凝胶稳定后，加入更多的细胞培养基以稀释水凝胶20倍；储能模量(G')的数据被用来证明这种水凝胶体系的细胞恢复能力。此外，测试了水凝胶以及水凝胶形成之前的肽溶液的稳定性。
1.肽合成和水凝胶化
该h9e肽根据上述方法合成。将冻干的肽加入至100mM碳酸氢钠中，通过磁力搅拌3小时至完全溶解，最终肽的浓度为10mM。对于水凝胶化，将肽溶液加入到MSC培养基或2i培养基中并将混合物手工摇动约10秒或轻轻吹打混合3次。最终的肽浓度为1mM、2mM和3mM。
2.流变试验
h9e水凝胶的储能模量和损耗模量(G'和G”，分别地)在37℃用具有20mm直径的平行板几何形状和500μm间隙大小用C-VOR150流变仪系统(马尔文仪器，马尔文，伍斯特郡WR141XZ，英国)进行测定。用于水凝胶形成试验和剪切稀化及自愈试验的方法与上述癌细胞培养基的方法相同。水凝胶形成后24小时，通过加入细胞培养液将2mM的肽水凝胶稀释20倍，并用移液器使其充分混合。将稀释液移至流变仪系统并在1Hz的频率和1％的剪切应变及4℃的条件下，测试1小时。
测试h9e-2i培养基水凝胶的稳定性。放置一塑料托盘在孔板的底部。然后，1％(重量)h9e溶液与2i培养基以1:1(体积：体积)的比例放入离心管中，然后转移到孔板中。每个孔含500μL肽水凝胶。然后将此孔板放置在培养箱中1小时。当水凝胶稳定后，缓慢地向水凝胶的顶部加入另外500μL的2i培养基。每天更换顶端培养基。对于机械试验，除去该顶端2i培养基，并用托盘将水凝胶转移到动态流变仪中。使用存储在4℃冰箱中高达24天的1wt％的肽溶液用于测定肽溶液的稳定性。在第1，6，18和24天，将部分肽溶液取出并与2i培养基以1:1(体积：体积)混合。在使用1％的剪切应变的单频监测(1Hz)流变试验下，监测水凝胶的形成过程1小时。
结果与讨论
1.MSC培养基中的肽水凝胶形成
将10mM h9e溶液与MSC细胞培养基以1:9，2:8和3:7(V/V)的比例混合，制备三种浓度(1mM，2mM和3mM)的h9e-MSC水凝胶。混合后立即测定肽-培养基混合物的G'。图6a显示了水凝胶的G’随肽浓度的增加而增加。1mM，2mM和3mM的h9e-MSC的水凝胶的稳定的G'分别为70Pa，350Pa和800Pa。选择2mM的h9e-MSC水凝胶进行剪切稀化和重新愈合试验(图6b)。将样品在室温下保存过夜，并在测量系统上稳定10分钟。在500％的剪切应变条件下，水凝胶被破坏成G'低于0.2Pa的液体形式。当剪切停止1分钟后，大于90％的凝胶强度得以恢复。在后续1小时的1％剪切应变恢复试验中，水凝胶的机械强度在几分钟内100％恢复(图6b)。为确定该h9e-MSC水凝胶的细胞恢复能力，将细胞培养基加入到一个稳定的水凝胶中。用移液器彻底搅拌后，水凝胶中的肽浓度由2mM至0.1mM被稀释20倍。然后将稀释后的溶液转移到流变仪中进行单一频率的测试。图6c显示了在1个小时的测试中，所述溶液的G'和G”均低于4Pa，表现为粘性极低的溶液。这种现象保证h9e-MCS水凝可转化为液体形式，并允许三维细胞培养后分离细胞。
2.在2i培养基中形成肽水凝胶
三种浓度(1mM，2mM和3mM)的h9e-2i水凝胶的制备方法与h9e-MSC水凝胶的制备方法相同。图7a显示了1mM的G'约为100Pa。在2i培养基中，肽浓度为2mM和3mM的水凝胶各自具有相似的稳定的G'为600Pa。选择2mM的h9e-2i水凝胶使用如h9e-MSC水凝胶描述的相同的方法进行剪切稀化和重新修复试验(图7b)。当水凝胶剪切成液态后(G'<0.2Pa)，水凝胶的G'在剪切力停止后迅速恢复。在1小时的1％剪切应变恢复试验中，在几分钟内水凝胶的机械强度可以恢复为100％(图7b)。此外，我们还将2mM的h9e-2i的水凝胶稀释至0.1mM浓度，并表明该方法可以将h9e-2i的水凝胶转换成液体形式用于细胞恢复(图7c)。
此外，也测定了h9e-2i水凝胶的稳定性。图8a显示h9e-2i水凝胶的G'可以稳定在约为130-160Pa下7天。另一方面，在h9e溶液在4℃储存1,6，18和24天后，通过监测h9e-2i混合物的水凝胶形成来测定h9e溶液的稳定性。图8b显示了经过24天储存后，当与2i培养基混合时，所述h9e溶液仍然可以形成水凝胶，并表现出相同的水凝胶形成速率和稳定的G'值。最近的一项研究表明，h9e液的稳定性可超过2个月。

Claims (25)

1.一种肽-白蛋白水凝胶，具有白蛋白引发的、自组装的、三维纳米纤维基质，所述纳米纤维基质包括线性两亲性的肽和白蛋白，其特征在于，所述纳米纤维基质包含由所述两亲性的肽和所述白蛋白构成的三维纳米纤维网络，所述肽包含末端疏水区域，中央转动区域和末端亲水区域。
2.根据权利要求1所述的肽-白蛋白水凝胶，其特征在于，所述水凝胶是可逆的。
3.根据权利要求2所述的肽-白蛋白水凝胶，其特征在于，在通过剪切稀化破坏所述三维纳米纤维基质后少于10分钟内，所述水凝胶具有至少60％的恢复。
4.根据权利要求1所述的肽-白蛋白水凝胶，其特征在于，所述水凝胶在7的pH下和20至25℃的温度条件下，具有50Pa至10000Pa的储能模量。
5.根据权利要求1所述的肽-白蛋白水凝胶，其特征在于，所述肽与白蛋白的重量比为100:1至1:100。
6.根据权利要求1所述的肽-白蛋白水凝胶，其特征在于，所述亲水区域源自蜘蛛拖丝蛋白的β-螺旋模体，并且所述疏水区域和转动区域源自二氢吡啶敏感的人肌肉的L-型钙通道中的亚基IV的第三跨膜片段。
7.根据权利要求1所述的肽-白蛋白水凝胶，其特征在于，进一步包括包裹在所述三维纳米纤维基质中的活性剂。
8.根据权利要求1所述的肽-白蛋白水凝胶，其特征在于，进一步包含细胞培养基和在所述三维纳米纤维基质中培养的细胞。
9.一种形成肽-白蛋白水凝胶的方法，所述方法包括：
提供含有线性肽分散、溶解或悬浮在溶剂体系中的肽溶液，其中所述肽是两亲性的且包括末端疏水区域，中央转动区域，和末端亲水区域；以及
在室温下混合白蛋白源与所述肽溶液以形成肽-白蛋白溶液，其中在不调节所述肽-白蛋白溶液的pH、温度、盐或离子成分的条件下，所述肽和白蛋白自组装成为所述肽-白蛋白水凝胶，其中所述水凝胶具有包含所述肽和所述白蛋白的纳米纤维基质，其中所述纳米纤维基质包含由所述肽和所述白蛋白构成的三维纳米纤维网络。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述肽溶液的pH为6到8。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述溶剂体系包括溶解在水中的选自碳酸氢钠，氢氧化钠，氢氧化钾及其混合物的溶剂。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述水凝胶在混合后少于120分钟内形成。
13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述白蛋白选自从植物或动物来源分离、提取或纯化的白蛋白、合成的白蛋白、其衍生物以及其混合物。
14.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述白蛋白源选自纯化的白蛋白、血清、含血清细胞培养基以及其组合。
15.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，将所述白蛋白源与溶剂体系混合，以在与所述肽溶液混合前形成含有所述白蛋白的溶液。
16.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述肽-白蛋白溶液具有基本中性的pH。
17.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述白蛋白源为含血清细胞培养基，所述细胞培养基包含细胞，其中所述细胞被所述肽-白蛋白水凝胶包裹，所述方法进一步包含在所述水凝胶中对所述细胞进行培养。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，进一步包括将所述水凝胶应用到细胞培养板或微孔中用于细胞培养。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，进一步包括用细胞培养基覆盖所述水凝胶并在细胞培养条件下培养含有所述细胞的水凝胶。
20.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，进一步包括从所述水凝胶中分离培养的细胞。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述分离包括：
对所述水凝胶施加机械力，以破坏所述水凝胶基质；
用额外的细胞培养基稀释所述水凝胶；以及
从所述水凝胶中分离所述培养的细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述机械力选自吹打、离心、震荡、注射、过滤、喷雾及其组合。
23.根据权利要求9所述的方法，进一步包括混合活性剂、所述肽溶液以及所述白蛋白源，在自组装后所述活性剂被包裹在所述肽-白蛋白水凝胶中。
24.一种肽-白蛋白水凝胶，根据权利要求9所述的方法形成。
25.一种活性剂在制备权利要求1-8中任一项所述的肽-白蛋白水凝胶中的用途，其特征在于，所述活性剂被包裹在所述水凝胶基质中。
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Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010033726A2 (en) 2008-09-17 2010-03-25 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Drug delivery composition comprising a self-assembled gelator
US20130280334A1 (en) 2010-09-24 2013-10-24 Massachusetts Institute Of Technology Nanostructured Gels Capable of Controlled Release of Encapsulated Agents
US9943592B2 (en) 2011-05-26 2018-04-17 Kansas State University Research Foundation Vaccine adjuvants from self-assembling peptides
BR112016019510A2 (pt) 2014-03-10 2017-10-24 3 D Matrix Ltd esterilização e filtração de composições de peptídeos
AU2015288635B2 (en) * 2014-07-11 2018-07-26 Menicon Co., Ltd. Visibility-ensuring material, and device for discharging visibility-ensuring material
CN105062965A (zh) * 2015-08-06 2015-11-18 深圳爱生再生医学科技有限公司 间充质干细胞的三维培养方法
US9962339B2 (en) 2015-10-08 2018-05-08 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Stabilized assembled nanostructures for delivery of encapsulated agents
US20170319500A1 (en) * 2016-05-06 2017-11-09 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Self-assembled gels for controlled delivery of biologics and labile agents
CN109310775B (zh) 2016-05-06 2022-11-18 布里格姆及妇女医院股份有限公司 用于向软骨中受控递送被囊封的药剂的二元自组装凝胶
IT201600099380A1 (it) * 2016-10-04 2018-04-04 Univ Bologna Alma Mater Studiorum Composizioni, dispositivi e metodi per il controllo in vitro del microambiente chimico in colture cellulari
US11174288B2 (en) 2016-12-06 2021-11-16 Northeastern University Heparin-binding cationic peptide self-assembling peptide amphiphiles useful against drug-resistant bacteria
WO2018144991A1 (en) 2017-02-03 2018-08-09 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Self-assembled gels formed with anti-retroviral drugs, prodrugs thereof, and pharmaceutical uses thereof
US10881745B2 (en) 2017-05-08 2021-01-05 Alivio Therapeutics, Inc. Formulation of nanostructured gels for increased agent loading and adhesion
CN111615401B (zh) * 2018-01-19 2024-03-22 株式会社目立康 免疫原性组合物及其制造方法
CN108315307A (zh) * 2018-02-09 2018-07-24 遵义医学院 纳米自组装短肽三维细胞培养技术在病毒分离培养中的应用
CN108543116B (zh) * 2018-05-02 2021-04-27 深圳市华异生物科技有限责任公司 海藻酸钠与明胶复合水凝胶3d胰岛支架及其制备方法
KR102112539B1 (ko) * 2018-06-28 2020-05-19 에스케이바이오랜드 주식회사 2액형 지혈제 조성물 및 그 제조방법
CN113825495A (zh) 2018-10-11 2021-12-21 阿利维奥治疗学股份有限公司 用于智能释放的不可注射水凝胶调配物
US20230190820A1 (en) * 2020-05-27 2023-06-22 The University Of Melbourne Cell harvest method
US20230295550A1 (en) 2020-07-30 2023-09-21 The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services Insert for preparing cell culture chambers
CN114249814B (zh) * 2021-12-23 2023-06-23 重庆大学 具自组装性能的白蛋白HSA-Hydrophobic-IIIB及其应用
CN114262373B (zh) * 2021-12-23 2023-06-23 重庆大学 具自组装性能的白蛋白HSA-Hydrophobic-IIB及其应用
CN114249813B (zh) * 2021-12-23 2023-06-23 重庆大学 具自组装性能的白蛋白HSA-Hydrophobic-IB及其应用
WO2024131926A1 (zh) * 2022-12-23 2024-06-27 矩阵(天津)生物科技有限公司 蛋白质响应性自组装肽及其应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6231881B1 (en) * 1992-02-24 2001-05-15 Anton-Lewis Usala Medium and matrix for long-term proliferation of cells
ATE215106T1 (de) * 1993-12-01 2002-04-15 Bioartificial Gel Technologies Inc Hydrogel auf basis von albumin
US6113629A (en) * 1998-05-01 2000-09-05 Micrus Corporation Hydrogel for the therapeutic treatment of aneurysms
DE60230593D1 (de) * 2001-02-06 2009-02-12 Massachusetts Inst Technology Peptidgerüstverkapselung von gewebszellen und verwendungen davon
MX2007001667A (es) * 2004-08-11 2007-10-02 Johnson & Johnson Aparato y metodo para el suministro transdermico de peptidos natriureticos.
US20100015226A1 (en) * 2005-06-21 2010-01-21 Antoine Turzi Bioresorbable hydrogel
JP5496671B2 (ja) * 2006-09-26 2014-05-21 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 修飾自己組織化ペプチド
WO2009012449A1 (en) * 2007-07-18 2009-01-22 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Temporal release of growth factors from 3d micro rod scaffolds for tissue regeneration
EP2229960B1 (en) * 2007-12-05 2015-04-08 3-D Matrix, Ltd. Wound healing/skin reconstruction material
KR101091028B1 (ko) * 2009-07-02 2011-12-09 아주대학교산학협력단 체내 주입형 하이드로젤 및 이의 생의학적 용도
US8835395B2 (en) * 2010-03-10 2014-09-16 Kansas State University Research Foundation Protein peptide hydrogels
JP6343147B2 (ja) * 2010-08-30 2018-06-13 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ 狭窄病変および血栓溶解療法のための剪断による制御放出

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