CN105018358B - 长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用，其解决了现有长链二元酸菌种改造效果不显著的技术问题，其分类命名为假丝酵母菌(Candida sp.)TDTC025，其保藏编号为：CGMCC No.8930。本发明可广泛用于长链二元酸的制备领域。

Description

长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种菌种及其制备方法和应用，具体说是一种长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用。

背景技术

长链二元酸是重要化工原料，具有极其广泛的用途，能够合成香料、特种尼龙、高级润滑油等一系列高附加值的化学品。长链二元酸可应用在军用领域、航空航天器的涂层、管路、汽车的表面涂层及油管等；在民用领域，可应用于汽车、日化香料、工程塑料、尼龙行业等十多个高新科技行业，可开发出更多的下游产业，形成新兴的产业链。

以往，长链二元酸采用化学合成法生产，其专利技术被国外所拥有。化学合成法生产长链二元酸，不仅产品种类单一，且合成工艺复杂、成本高、污染大。我国是世界上唯一能够采用微生物发酵技术实现多种长链二元酸大规模工业化生产的国家。此前，我国二元酸生产菌种的改良均是通过不同方式诱变等传统育方法实现的。传统育种方法具有很大随机性，筛选复杂。通过传统育种的方法已经很难进一步提高菌株的性能。当前长链二元酸工业化生产过程中仍有许多瓶颈问题，如底物转化率有待提高、生产能耗非常巨大等等。

代谢工程技术可以在基因水平上有针对性的进行菌种分子改造，获得性能更加优良的新菌株。如图1、图2所示，二元酸代谢途径主要包括ω-氧化途径和β-氧化途径，其中前者为二元酸合成途径，后者涉及二元酸降解途径。代谢工程的目的是通过分子改造手段来提高ω-氧化活性，并降低β-氧化活性。国际上，Henkel公司(后来的Cognis公司)有专利报道(US005254466A)，用基因敲除方式来优化二元酸生产菌株，依次将4个POX基因敲除，达到完全阻断β-氧化，使底物转化率提高为100％。在此基础上，该公司进一步通过代谢工程手段共表达CYP单加氧酶和还原酶，以达到增强ω-氧化的目的，产量提高30％(World PatentWO/91/06660)。

但是利用该菌株进行批式发酵实验，其工艺仍无法与当时其他二元酸生产工艺竞争，而最终没有进行规模化生产。Henkel公司对菌种进行分子改造所使用的筛选标记为尿嘧啶营养缺陷型。Henkel公司发明专利的缺点为：1、出发菌株不是工业化生产所用的高产菌株；2、发酵法生产长链二元酸所用的假丝酵母为二倍体，即每个细胞具有两套染色体，每个基因都有对应的等位基因，而且催化每步体内生化反应的酶往往由多个基因编码。因此，通过代谢工程手段来增强或减弱某个体内生化反应的活性，需要对编码该酶的关键基因进行分子改造才有显著效果。否则，改造后效果也不会显著。

发明内容

本发明就是为了解决现有菌株生产长链二元酸效果不显著的技术问题，提供一种生产效率高的长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用。

为此，本发明提供一种长链二元酸生产菌株，其分类命名为假丝酵母菌(Candidasp.)TDTC025，所述菌株于2014年3月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；其保藏编号为：CGMCC No.8930。

本发明中的长链二元酸生产菌株所述假丝酵母菌中的pex5基因已被敲除一个拷贝，所述pex5基因的碱基序列如序列表中的序列5所示。其为该菌株基因组中编码该酶的多个基因中对于长链二元酸生产最为关键的一个。

本发明同时提供一种长链二元酸生产菌株的制备方法，其包括如下步骤：(1)准备引物PEX5-F和PEX5-R；(2)准备长链二元酸生产菌株感受态细胞，长链二元酸生产菌株为假丝酵母(Candida sp.)DC12；(3)使用步骤(1)中的引物进行扩增clonNAT抗性基因，利用扩增的产物对菌种中的基因pex5被敲除一个拷贝，所述pex5基因的碱基序列如序列表中的序列5所示；(4)通过PCR扩增、纯化、电转、筛选、鉴定，得到长链二元酸生产菌株。

优选地，本发明中长链二元酸生产菌株的制备方法，筛选步骤中使用的筛选标记为clonNAT。

本发明同时提供长链二元酸生产菌株在生产长链二元酸中的应用。

优选地，发酵结束后，将发酵液加热至70～80℃；再将pH调至9～9.5，除去菌体沉淀，保留上清；脱色，温度保持在70～90℃，得到滤清液，用酸酸化至pH2.5，70～90℃保温，冷却，离心或压滤，水洗，清洗后的沉淀取出后真空干燥，得到长链二元酸。

本发明中的长链二元酸是指含有十个以上碳原子的直链二羧酸，是一种重要的精细化工中间原料，特别是十二碳二元酸(DC12)、十四碳二元酸(DC14)、十六碳二元酸(DC16)和十八碳二元酸(DC18)。

本发明的有益效果是，为了突破生产菌种遗传改造的瓶颈，本发明通过解析生产菌株的基因组学和转录组学特征，分析ω-氧化和β-氧化代谢途径，在基因组全局水平上确立了二元酸代谢相关的一些关键靶位点，再通过代谢工程手段对这些位点进行分子改造，并经过发酵实验验证，获得了性能更加优良的菌株。本发明的TDTC025菌株(保藏号：CGMCCNo.8927)，相比DC12菌株，转化率得到明显提高，为规模化生产带来有益效果。

附图说明

图1为本发明涉及到的长链二元酸合成相关ω-氧化代谢途径；

图2为本发明涉及到的长链二元酸降解相关β-氧化代谢途径；

图3为本发明涉及到的基因敲除流程图；

图4为HPLC分析DC12发酵生产的长链二元酸；

图5为HPLC分析TDTC025发酵生产的长链二元酸。

本发明的长链二元酸生产菌株，其分类命名为假丝酵母菌(Candida sp.)TDTC025；其保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2014年3月18日，保藏号编号为：CGMCC No.8930。

具体实施方式

序列表中序列的名称如下：序列1：PEX5-F；序列2：PEX5-R；序列3：PEX5-U；序列4：PEX5-D；序列5：CandidaA01322。

以下实施例中观察到的菌落及菌体形态归纳如下：

固体培养基平板上，菌落奶酪状，表面光滑，乳白色，饱满凸起，菌落直径约为2mm。酵母样单细胞,大小约为10x6μm。大多情况下，以酵母样单细胞形式，同时会有假菌丝体形成，如在某些生长阶段或某种外界条件刺激下，假菌丝比例会显著增加。

以下实施例中使用了下面所列的培养基：

1、YPD培养基，其配方为：1％的酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，若制固体培养基，加入2％琼脂粉。上述百分比为质量体积百分比，即每100毫升培养基所需该组分的克数。若要添加抗生素，液体培养基在使用时加入至相应终浓度。固体培养基在高压灭菌后冷却至50摄氏度左右时，加入抗生素至相应终浓度，混匀后立刻倒如无菌的培养皿中，待凝固后倒置，放于4摄氏度冰箱，两周内使用。

2、种子培养基的配方：酵母膏1～8g/L，玉米浆1～8g/L，蔗糖5～25g/L，KH₂PO₄ 4～12g/L，尿素0.5～4g/L，重蜡40～70g/L，121℃灭菌30分钟。其中，蔗糖和尿素分开单独110℃灭菌20分钟，灭菌后再合并混匀。

3、发酵罐培养基配方：酵母膏1～8g/L，玉米浆1～8g/L，蔗糖5～30g/L，KH₂PO₄ 4～15g/L，尿素0.5～4g/L，KNO₃ 5～15g/L，NaCl 0.5～2.5g/L，121℃灭菌30分钟。其中，蔗糖和尿素分开单独灭菌，110℃灭菌20分钟，灭菌后再合并混匀。另外配制75％葡萄糖溶液，105℃灭菌20分钟，发酵初期进行流加。

以下实施例中使用了下面所列的菌体培养及发酵液处理方式：

1、平板培养：在YPD平板上划线或涂布后倒置于30℃培养箱内，2-3天即可观察到大而饱满的乳白色菌落形成。

2、摇床培养：平板上接种单菌落至液体培养基中，或从液体培养基转接过来，30℃摇床培养，转速保持在220转/分钟。

3、发酵罐培养：可以比较实时精确控制发酵条件，如补料控制、pH控制、溶氧控制和通气搅拌强度控制等等。第一阶段，发酵液pH控制在5～6.8，同时流加葡萄糖溶液，为菌体生长阶段；第二阶段，发酵液pH控制在7.0～7.8，同时流加底物(烷烃、脂肪酸或脂肪酸衍生物，如甲酯或乙酯等)，以发酵产酸为主，也生长部分菌体；第三阶段，只产酸，不产菌体，根据发酵情况继续流加底物(烷烃、脂肪酸或脂肪酸衍生物，如甲酯或乙酯等)。整个发酵过程用10M NaOH溶液自动流加控制pH，同时通过转速的调整使溶解氧保持在20～40％。

4、发酵液处理：发酵结束后，将发酵液加热至70～80℃，并维持60分钟；再加入10MNaOH将pH调至9～9.5，用管式离心机或压滤除去菌体沉淀，保留上清；加入适量活性炭脱色，温度保持在70～90℃，保温时间为60分钟；除去活性炭后，得到滤清液，用浓盐酸或浓硫酸连续酸化至pH2.5，70～90℃保温2小时，冷却至30℃，离心或压滤，清水洗一遍，清洗后的沉淀取出后真空干燥，得到白色二元酸。

实施例1：菌株代谢工程改造

1)基因组测序

利用宝生物工程有限公司的基因组提取试剂盒(Yeast DNAiso Kit)制备长链二元酸生产菌株假丝酵母基因组DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。基因组DNA再经过文库构建、新一代测序技术测序分析和数据组装等步骤。通过基因组注释和数据分析，获得了生产菌株在二元酸生产相关的基因信息，挖掘了该菌在ω-氧化和β-氧化代谢途径相关基因的编码序列。对于酵母，β-氧化主要发在在过氧化物酶体内，特别是长链脂肪酸的β-氧化，只发生于过氧化物酶体这种细胞器里。有研究表明(Annu.Rev.Cell Dev.Biol.17:701-52,2001)，定位到过氧化物酶体的蛋白往往在末端含有特征性的信号肽(PeroxisomalTargeting Signal,PTS)，而带有这些信号肽的蛋白需要同能够识别这些信号肽的受体蛋白结合，进而被运输到过氧化物酶体内。PEX5蛋白就是最重要的受体蛋白之一。如果将pex5基因敲除或减弱，就会影响到许多蛋白进入过氧化物酶体，从而达到抑制β-氧化的作用。长链二元酸生产菌株基因组里，CandidaA01322开放读码框编码PEX5。由于组装的基因组序列里未发现有另一个基因与CandidaA01322高度相似，但由于该菌为二倍体，即每个细胞内含有两套完整的染色体，每个基因都存在等位基因。因此，推测编码PEX5的这对等位基因在序列上完全一样，上下游区域序列也高度相似，因而2可以判断CandidaA0132实际上代表了一对等位基因。

2)转录组测序

利用德国凯杰公司的RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit)制备长链二元酸生产菌株假丝酵母的总RNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。得到的总RNA再经过文库构建、转录组测序及表达量分析。通过转录组数据分析，发现CandidaA01322的转录水平为440.9RPKM。这里，RPKM是基因表达量的一个计算方法，表示Reads Per Kb Per Million Reads。其计算公式为

设RPKM(A)为基因A的表达量，则C为唯一比对到基因A的reads数，N为唯一比对到参考基因的总reads数，L为基因A编码区的碱基数。RPKM法能消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响，计算得到的基因表达量可以直接用于比较基因表达差异。

由于β-氧化是长链二元酸降解相关的代谢途径，菌种改造的目的是尽量避免二元酸降解的发生。但是另一方面β-氧化对于菌体正常生理代谢和能量供应是必需的。因此，希望通过基因工程的手段来抑制而不是完全阻断β-氧化，达到既不影响菌体正常生长和长链二元酸的合成，又避免合成的长链二元酸被降解的目的。CandidaA01322编码PEX5蛋白，在二元酸降解过程中负责定位到过氧化物酶体的蛋白能够正确地从胞浆运输到过氧化物酶体内，否则就会影响到β-氧化的代谢强度。因此，利用代谢工程手段，敲除该对等位基因其中的一个拷贝，使得参与β-氧化代谢的许多酶不能够正确定位到过氧化物酶体内，以达到抑制二元酸降解的功效，从而达到更加有效累积二元酸的目的。

3)基因敲除实验流程如图3所示。其中引物PEX5-F和PEX5-R的5’端为同源臂序列，对应于基因敲除位点的上游和下游序列。这两个长引物的3’端分别与敲除模块(deletioncassette)的上游和下游配对。PCR扩增后得到的DNA片段，两头分别带上下游同源臂，中间为抗性筛选标记。

扩增的DNA片段经纯化后进行电转化导入菌体细胞内，DNA片段的上下游同源臂与菌体染色体上的靶位点发生双交换，达到基因敲除的目的。由于这种双交换是小概率事件，需要建立方法来进行筛选。这里所使用到的抗性基因是Sat1,编码诺尔斯菌素乙酰转移酶。二元酸生产菌株对诺尔斯菌素(又叫clonNAT或NTC)这种药物敏感，在含诺尔斯菌素的平板上不能生长，而表达该酶后菌体能够分解诺尔斯菌素，避免致死效应。抗性筛选标记只有整合到染色体上去才能得到表达，发挥作用，使得菌体能够在含抗性的培养基平板上生长，并形成菌落。同时对具有抗性的菌落，进行纯化和验证。

验证时，使用到一对检测引物PEX5-U和PEX5-D，分别与靶位点的上游和下游区域配对。如果没有同源重组发生，通过这一对等位基因为模版扩增出来的片段在长度上是一样的，在琼脂糖电泳中只能观察到一条带。如果其中一个等位基因由于双交换事件被抗性基因片段替换了，那么经过扩增得到的片段长度就发生变化，在琼脂糖电泳中可以观察到两条带。经过验证的菌株，再通过发酵实验验证代谢工程改造获得新菌株在二元酸生产方面是否有性能上的优势。

4)PCR扩增

其中，质粒pSFS2,参考文献为Gene(2004)341:119–127，GeneBank数据库的登录号为：AY524979，来源于中国科学院微生物所。

PCR扩增所用引物为PEX5-F和PEX5-R。DNA聚合酶是宝生物工程有限公司的Pyrobest DNA聚合酶，或者是NEB公司的Phusion DNA聚合酶，活性单位均为5U/μl。

PCR循环条件为：

94度2分钟 (预变性阶段)

94度20秒，58度20秒，72度1～6分钟 (30个循环扩增阶段)

72度10分钟 (最后延伸阶段)

5)DNA纯化

反应结束后，取5μl上述PCR样品进行琼脂糖电泳检测，证明扩增所得的DNA片段大小与预计的一样，而且没有杂带，进行两步纯化和浓缩，为后面的转化准备DNA样品。

第一步是利用PCR纯化试剂盒(购自Omega公司)，按照说明书进行。一般是50μl体系，做4管，总体积共200μl，PCR纯化的最后一步用50或100μl TE缓冲液洗脱柱子。纯化后的DNA，用NanoDrop仪器测浓度，计算得到的DNA总量约为20μg。

第二步是将纯化的DNA再用乙醇/醋酸钠/糖原处理进行沉淀。具体做法是：往上述溶在TE缓冲液的DNA溶液加入1μl糖原(20mg/ml)、100μl醋酸钠(3M,pH5.2)和1ml预冷的无水乙醇；放置-80摄氏度冰箱冷却30分钟；4度离心机，14000转/分的转速下，离心10分钟，留沉淀；沉淀再用75％预冷的乙醇洗两遍；超净台里风干；4摄氏度冰箱储存，电转之前重悬在10μl超纯水备用。

6)感受态制备及电转

从新鲜活化的平板上挑出发菌株(Candida sp.DC12，参见《微生物学报》20(1)：88-93,1980，正烷烃发酵生产长链混合二羧酸，可购买于中国科学院微生物研究所)的单菌落于3ml液体YPD培养基中，30℃摇床培养过夜，转速为220转/分钟；2％转接于20ml YPD,30℃摇床培养，220转/分钟,至OD600达到1.8；将菌液置于冰上静置15分钟，使其停止生长，4000转/分钟，4℃离心3分钟，留菌体沉淀；用4ml预冷无菌水洗一次；4000转/分钟，4℃离心3分钟，留菌体沉淀；加入4ml TE/0.1M LiOAc,150转/分钟，30℃的摇床内振荡90分钟；加入0.1ml 1M DTT，继续150转/分钟、30℃的摇床箱内振荡30分钟；4000转/分钟，4℃离心3分钟，留菌体沉淀；加入4ml预冷无菌水，洗3次；加入2ml 1M山梨醇，洗1次,4000转/分钟，4℃离心3分钟；弃上清，加入120μl山梨醇将细胞悬起；取出40ul的细胞悬液于1.5ml离心管，加入5μl上述纯化后重悬在无菌水的PCR扩增产物(约10μg)，混匀，置于冰上5分钟；转入预冷的电转杯中，擦干电转杯，进行电转(电转条件为：2mm狭缝的电转杯，电压为1800伏，电击时间为5毫秒)；电转后立刻加入1ml山梨醇，混匀后吸出放到1.5ml的离心管中；4000转/分钟离心3分钟，弃上清，加入1ml YPD培养基，37℃的摇床内培养2小时；4000转/分钟离心3分钟，弃上清，加100μl YPD重悬菌体，涂布平板(YPD+clonNAT)，放到30℃培养箱内培养至单菌落出现。

7)筛选抗性菌落

将上述抗性平板上长出的单菌落分别接种到1ml YPD培养基的离心管中，加clonNAT至终浓度为100μg/ml，220转/分钟，30℃摇床培养。出现生长，说明带有抗性，证明抗性基因已经整合到菌体基因组中并发挥作用，这部分菌落用于下一步验证。没有出现生长的菌落，说明是假阳性，等同于出发菌株，停止处理。

8)鉴定

上面出现生长的抗性菌落，接种YPD液体培养基培养过夜，吸取500μl菌液，利用宝生物工程有限公司的基因组提取试剂盒制备基因组DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。以获得的基因组DNA为模版，PEX5-U和PEX5-D为引物进行PCR扩增，具体反应体系及反应条件参照本实施例1的第4)条。如果靶位点上的等位基因没有被敲除，从两条等位染色体上扩增出来的DNA片段大小一样，在琼脂糖电泳上表现为一条带。如果靶位点上其中一个等位基因被敲除，从两条等位染色体上扩增出来的DNA片段大小不一样，在琼脂糖电泳上表现为两条带(见图3)。鉴定为抗性阳性并且靶位点被敲除的菌液，再进一步经菌落纯化和相同方法的鉴定，得到本发明的长链二元酸生产菌株TDTC025。

实施例2：长链二元酸的发酵生产

菌种通过常规的斜面培养后，接入50ml一级种子培养16小时，然后将一级种子培养转接入500ml二级种子培养16小时。

种子培养基的配方：酵母膏1～8g/L，玉米浆1～8g/L，蔗糖5～25g/L，KH₂PO₄ 4～12g/L，尿素0.5～4g/L，重蜡40～70g/L，121℃灭菌30分钟。其中，蔗糖和尿素分开单独110℃灭菌20分钟，灭菌后再合并混匀。

二级种子发酵完成后，转接入5L发酵罐。发酵罐培养基配方：酵母膏1～8g/L，玉米浆1～8g/L，蔗糖5～30g/L，KH₂PO₄ 4～15g/L，尿素0.5～4g/L，KNO₃ 5～15g/L，NaCl 0.5～2.5g/L，121℃灭菌30分钟。其中，蔗糖和尿素分开单独灭菌，110℃灭菌20分钟，灭菌后再合并混匀。另外配制75％葡萄糖溶液，105℃灭菌20分钟，发酵初期进行流加。基础培养基为4L。在30℃以1：0.5的通气体积，控制pH5.5～6.5，在第16小时后开始以50ml/h的速度流加十二碳直链烷烃，发酵时间为144-156小时。整个发酵过程用10M NaOH溶液自动流加控制pH，同时通过转速的调整使溶解氧保持在30％。

如图4和图5所示，HPLC分析表明出发菌株DC12和改造菌株TDTC025发酵得到的长链二元酸产物一致，纯度在约为99％。

从下表可以看出，改造后的菌株，转化率也得到提高。

实施例3

按照实施例2的方法，只是底物从十二碳直链烷烃改为月桂酸甲酯。

实施例4

按照实施例2的方法，只是底物从十二碳直链烷烃改为月桂酸乙酯。

Claims (4)

1.一种长链二元酸生产菌株，其分类命名为假丝酵母菌(Candida sp.)TDTC025，其保藏编号为：CGMCC No.8930。

2.根据权利要求1所述的长链二元酸生产菌株，其特征在于所述假丝酵母菌中的pex5基因已被敲除一个拷贝，所述已被敲除的pex5基因的碱基序列如序列表中的序列5所示。

3.如权利要求1所述的长链二元酸生产菌株在生产长链二元酸中的应用。

4.如权利要求3所述的长链二元酸生产菌株在生产长链二元酸中的应用，其特征在于发酵结束后，将发酵液加热至70～80℃；再将pH调至9～9.5，除去菌体沉淀，保留上清；脱色，温度保持在70～90℃，得到滤清液，用酸酸化至pH2.5，70～90℃保温，冷却，离心或压滤，水洗，清洗后的沉淀取出后真空干燥，得到长链二元酸。