CN104990997A - 一种基于核碱基信息的微藻群落原位生长速率的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于核碱基信息的微藻群落原位生长速率的测定方法。选择若干水华优势藻，获取不同实验条件下指数生长期的生长速率；收集各种条件下指数生长期内生长速率最大时的藻细胞样品，进行盐酸高温消解处理，用高效液相色谱分析特定的核碱基含量。将藻细胞中的尿嘧啶含量与胸腺嘧啶含量的比值对藻类最大生长速率作图，并建立回归模型；从野外环境中采集微藻细胞，用于核碱基含量分析，计算微藻细胞的[U]/[T]比值，利用已建立的回归模型反演出野外环境中的藻类生长速率，即微藻群落原位生长速率。本方法所得生长速率基本上反映了野外取样时刻的藻类群落生长特性，非常适于探索微藻群落原位生长速率的高分辨率时空变化特征，进而为预测藻类水华可能的暴发位置和时间提供科技支撑。

Description

一种基于核碱基信息的微藻群落原位生长速率的测定方法

技术领域

本发明涉及浮游植物原位生长速率的测定方法，具体的说是一种基于微藻群落细胞核碱基含量比的浮游植物原位生长速率的测定方法。

背景技术

藻类水华（如蓝藻水华）是淡水生态系统富营养化过程中的常见现象，严重时可引起溶解氧匮乏或产生藻毒素，进而危害水生动物和人类健康。然而，这些危害性也伴随着藻类组成结构和生长阶段的不同而变化的。要对大型水域藻类水华暴发的位置和时间进行准确地预警和预测，就需要掌握较高时空分辨率的藻类生长特性，这成为当前湖泊/水库水质管理中的一个热点和难点。

在天然水域中，原位生长速率是浮游植物实际生长特性的一种反映，是揭示藻类在实际水域中生态行为过程的重要指标，也是进一步探索藻类演替机理、完善对水华形成过程认识的基础。目前，藻类生长速率的测定或估算方法有很多，包括放射性C-14标记的叶绿素a分析技术（G. Redalje, D., & A. Laws, E., 1981, Marine Biology, 62:73-79）、细胞分裂频率法（Campbell, L., & Carpenter, E. J. , 1986, Mar. Ecol. Prog. Ser., 32: 139-148）、原位培养围隔水柱法（Elser, J. J., 1992. Ecology, 73: 887-902）、细胞周期分析法（Chang, J., & Dam, H. G., 1993, Limnology & Oceanography, 38: 202-212.）、流式细胞分类-同位素法（Pel, R., Floris, V., Gons, H. J., & Hoogveld, H. L., 2004, Journal of Phycology, 40: 857-866）等，但并不是所有方法都适合于原位生长速率的测定。其中，细胞分裂频率法和原位培养法在我国太湖和长江三峡水库等研究中得到了初步应用（吴晓东, 孔繁翔, 2008, 中国环境科学, 28: 552-555; 李哲, 谢丹, 郭劲松 等, 2012, 湖泊科学, 24: 746-754），每次测定时需要连续24 h采样观测，至少1次/2 h的采样频率，工作量较大，且采集的样品本身受蓝藻迁移影响。这些方法野外工作难度较大，无法获得较高时空分辨尺度的藻类生长速率数据，很难在大范围的时空尺度上应用。

核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内，生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。在藻类细胞生长过程中，而核糖核酸（简称RNA）含量决定了蛋白质合成快慢，RNA越多，蛋白质的合成速率越快，藻细胞分裂也越快，显然，藻类细胞生长速率与RNA含量（如[rRNA]）有关（Binder, B. J., & Liu, Y. C. , 1998, Applied and Environmental Microbiology, 64: 3346-3351）。由于藻细胞中脱氧核糖核酸（简称DNA）是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础，其含量相对比较稳定，主要与细胞大小有关，受环境因子的影响很小，藻类生长速率也与[RNA]/[DNA]比值等密切相关。当前，[RNA]/[DNA]等核酸衍生物指数已广泛用于海洋生态学中某一特定环境条件下的水生生物生长状况（Chícharo, A. M., & Chícharo, L., 2008. International Journal of Molecular Sciences, 9: 1453-1471.），其应用有可能在藻类生长速率的高分辨时空观测方面实现突破。曾有人试图利用[RNA]/[DNA]来估算太湖铜绿微囊藻的原位生长速率（专利公开号CN102808035A），但DNA和RNA的提取和纯化过程比较复杂且成本高（Berdalet, E., Roldán, C., & Olivar, M. P.，2005, Scientia Marina, 69: 17-30.），而且，DNA和RNA含量至今都没有标准的定量分析方法，传统光度法定量分析结果在不同实验室之间存在着差异（Miller, T., Folkvord, A., & Holt, G. , 2006, Limnology & Oceanography-Methods, 4: 153-163），所以，这种方法在实际应用上仍有些难度。

发明内容

本发明的目的在于克服传统藻类生长速率测定法无法满足表征藻类生长特性高度时空动态变化的缺陷，以及克服它野外工作难度大或者分析成本高的缺陷，从而提供一种基于核碱基信息的藻类群落原位生长速率的测定方法，从实际湖泊或水库等水体中获得不同样点的藻类样品，在实验室内进行藻细胞水解和核酸碱基测定，计算尿嘧啶（U）和胸腺嘧啶（T）的含量比（[U]/[T]），反演出实际水体中铜绿微囊藻的原位生长速率。

  本发明的目的是通过下述技术方案实现的：

  本发明建立了一种铜绿微囊藻的原位生长速率的测定方法，包括以下步骤：

(1) 藻类生长速率的测定，在实验室不同温度或光照条件下开展藻类的系列培养实验，通过测定藻类的细胞密度或叶绿素a含量绘制生长曲线，计算各处理组藻类瞬时生长速率（r，d^-1），在死亡率为零的指数生长期内，r等于其比生长速率（μ，d^-1）；

(2) 藻细胞的酸消解及特定的核碱基含量比的测定，所述特定的核碱基为尿嘧啶（U）和胸腺嘧啶（T），在藻类的指数生长期，采集水样进行微孔膜过滤得微藻细胞样品或者用浮游植物网获取微藻细胞浓缩液，置于安瓿瓶中并添加盐酸，控制盐酸最终浓度为6 mol/L；氮气吹扫排空氧气后，用火焰将安瓿瓶封口，做好标记，并用锡箔纸裹紧后，160℃下消解40 min；消解完成后取出并充分冷却后在离心机作用下离心10 min，然后准确移取100 μL的水解产物上清液于色谱样品瓶的内衬管中，经氮气吹干后，加入20 μL超纯水重新溶解，再次进行氮吹以去除残余的盐酸；加入100 μL的超纯水，经涡旋振荡使水解产物充分溶解混匀后，经高效液相色谱分离并测定尿嘧啶（U）和胸腺嘧啶（T）核碱基的含量；将藻细胞中的尿嘧啶含量与胸腺嘧啶含量的比值（[U]/[T]）对藻类最大生长速率（μ_max）作图，并建立回归模型；

(3)，微藻群落原位生长速率的测定，按步骤(2)的方法收集野外水环境中的微藻细胞，酸消解后用于核碱基含量分析，计算微藻细胞的[U]/[T]比值，最后利用步骤(2)建立的回归模型反演出野外环境中的藻类群落生长速率（μ），即微藻群落原位生长速率。

本发明开发的一种基于核碱基信息的微囊藻生长速率的测定方法与现有的技术方法相比，具有如下优势：（1）现场采样简单，不需要在每个点连续一整天地采样；（2）室内分析仪器也较为常规，分析便捷和准确，成本也较低；（3）可根据需要加密布设样点采集藻细胞，测定各点藻类群落的原位生长速率，并绘制原位生长速率空间分布的等值线地图，表征藻类生长特性空间上的高度动态变化，用于预测大型湖泊或水库中藻类水华暴发的潜在位置；（4）可根据需要在预测的藻类水华潜在位置加密藻细胞采集频率，测定各时间点藻类群落的原位生长速率，并绘制原位生长速率随时间变化的等值线图形，表征藻类生长特性时间尺度上的高度动态变化，用于预测藻类水华暴发的可能时间。

总之，本方法所得生长速率基本上可反映野外取样时刻的藻类群落生长特性，非常适于探索微藻群落原位生长速率的高分辨率时空变化特征，进而为预测藻类水华可能的暴发位置和时间提供科技支撑。

附图说明

图1：不同营养盐水平下铜绿微囊藻的生长曲线，其中：(a)A1~A3处理组生长曲线，(b)A4~A6处理组生长曲线

图2：不同营养盐水平下铜绿微囊藻的生长速率，其中：(a)A1~A3处理组生长速率，(b)A4~A6处理组生长速率

图3：铜绿微囊藻细胞中[U]/[T]比值与生长速率之间的函数关系

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明的技术方案作进一步的描述。

实施例1、不同营养盐水平下铜绿微囊藻的生长曲线及生长速率

实验所用铜绿微囊藻（FACHB-905）购自中国科学院生生生物研究生淡水藻种库，选用AGP人工培养基配方（其中TN=4.2 mg/L，TP=0.186 mg/L）。实验前，进行反复转接藻种并扩大培养，使细胞达到同步生长。为获得不同生长速率的藻细胞样品，设置6个处理组（NaNO₃和K₂HPO₄浓度不同，A1至A6分别为AGP配方浓度的1/10、1/4、1、2、4、10倍）进行藻类生长潜力培养实验。所有处理组均设置3个平行实验，设定光照培养箱中温度为28±1 ℃，光照强度为2500 lx，光暗周期比为14 h:10 h，在上述条件下连续培养14 d。为了减少因光照不均匀可能造成的影响，每天摇动锥形瓶3次并随机更换各实验组锥形瓶的位置。从接种第1天起，每天同一时间进行取样。采用浮游植物分类荧光仪（Phyto-PAM, Walz, Germany）测定铜绿微囊藻的荧光叶绿素a (Chl a)含量，并以此绘制藻类的生长曲线。

比生长速率（μ，d^-1）是指某一时间间隔内藻类的生长速率（金相灿，湖泊富营养化调查规范，1990）。在藻类指数生长期中，比生长速率等于瞬时生长速率，因此，可通过下列公式计算：

式中，X ₁为t₁时刻藻类的Chl a含量；X ₂为t₂时刻藻类的Chl a含量； t₁, t₂分别为藻类的培养时间天数(d）。

藻细胞倍增时间(T₂)是指在生长曲线上细胞数量增加一倍的时间，可以通过公式：T₂=0.693/r。每日倍增数 (k)可直接根据叶绿素含量运用公式：k=log₂(X₂/X₁)/(t₂-t₁) 计算得到。

实施例2、铜绿微囊藻细胞中[U]/[T]比值与生长速率之间的函数关系

通过实施例1中所描述的藻类室内培养实验，可在不同处理组中采集得到若干个处于指数生长阶段的不同生长速率的藻细胞样品。将藻细胞样品在60 ^oC 烘箱中恒温烘干至恒重，经上述技术方案中描述的藻细胞样品预处理实验，采用高效液相色谱测定得到核碱基[U]和[T]的含量，计算其碱基比[U]/[T]。以实施例1中计算得到的比生长速率μ为横坐标，核碱基比[U]/[T]为纵坐标，通过非线性拟合，即可得到比生长速率和核碱基比之间的回归模型，如图3所示。其回归方程为: y=0.183ln(20.7ln([U]/[T]))其中a, b均为常数，拟合得到: a=0.183, b=-20.7,R²=0.836, p＜0.001。

实施例3、2014年10月长江口水库中蓝藻的核碱基信息及其原位生长速率

采集2014年10月青草沙水库中不同点位的表层水样共8个，经玻璃纤维滤膜(0.7μm, Whatman, GF/F, 450℃预灼3 h)过滤得到藻细胞样品，并在烘箱中60 ^oC恒温烘干至恒重，然后通过实施技术方案中所描述的藻细胞预处理实验，最后用高效液相色谱测定尿嘧啶和胸腺嘧啶的含量，计算得到[U]/[T]的比值，代入到计算公式：μ=0.183+ln(20.7ln([U]/[T]))，从而反演得到各点位青草沙水库中藻类原位生长速率。表1为测得的青草沙水库藻类的比生长速率，其结果为0.394~0.563 d^-1。相比于库区后部的样点而言，库区中部各样点(QCS1~QCS3) 藻类比生长速率明显较高，而库区后部(QCS4, QCS5)和输水泵站口(QCS7)样点的藻类比生长速率相对较低。根据历年青草沙水库监测结果来看，位于库中的样点藻种较为丰富，藻细胞密度也较高，是预防藻类水华暴发的重点关注区域。

表1：2014年10月青草沙水库中蓝藻的核碱基信息及其原位生长速率

样点编号	所在位置	[U]/[T]	比生长速率（d-1）	每日倍增数	倍增时间（d）
						QCS1	库中-垦区北侧	2.74	0.547	0.789	1.27
QCS2	库中-垦区南侧	3.02	0.563	0.812	1.23
						QCS3	库区中部	2.12	0.494	0.713	1.40
QCS4	库尾/中央	1.63	0.416	0.600	1.67
						QCS5	库尾/中央	1.60	0.409	0.590	1.69
QCS6	库尾/近岸	1.83	0.455	0.656	1.52
						QCS7	库尾/输水泵口	1.54	0.394	0.568	1.76
QCS8	库尾/排水闸口	1.99	0.478	0.690	1.45

Claims (1)

1.一种基于核碱基信息的微藻群落原位生长速率的测定方法，其特征在于包括以下步骤：

(1) 藻类生长速率的测定，在实验室不同温度或光照条件下开展藻类的系列培养实验，通过测定藻类的细胞密度或叶绿素a含量绘制生长曲线，计算各处理组藻类瞬时生长速率（r，d^-1），在死亡率为零的指数生长期内，r等于其比生长速率（μ，d^-1）；

(2) 藻细胞的酸消解及特定的核碱基含量比的测定，所述特定的核碱基为尿嘧啶（U）和胸腺嘧啶（T），在藻类的指数生长期，采集水样进行微孔膜过滤得微藻细胞样品或者用浮游植物网获取微藻细胞浓缩液，置于安瓿瓶中并添加盐酸，控制盐酸最终浓度为6 mol/L；氮气吹扫排空氧气后，用火焰将安瓿瓶封口，做好标记，并用锡箔纸裹紧后，160℃下消解40 min；消解完成后取出并充分冷却后在离心机作用下离心10 min，然后准确移取100 μL的水解产物上清液于色谱样品瓶的内衬管中，经氮气吹干后，加入20 μL超纯水重新溶解，再次进行氮吹以去除残余的盐酸；加入100 μL的超纯水，经涡旋振荡使水解产物充分溶解混匀后，经高效液相色谱分离并测定尿嘧啶（U）和胸腺嘧啶（T）核碱基的含量；将藻细胞中的尿嘧啶含量与胸腺嘧啶含量的比值（[U]/[T]）对藻类最大生长速率（μ_max）作图，并建立回归模型；

(3)，微藻群落原位生长速率的测定，按步骤(2)的方法收集野外水环境中的微藻细胞，酸消解后用于核碱基含量分析，计算微藻细胞的[U]/[T]比值，最后利用步骤(2)建立的回归模型反演出野外环境中的藻类群落生长速率（μ），即微藻群落原位生长速率。