CN104984389B

CN104984389B - 一种大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法

Info

Publication number: CN104984389B
Application number: CN201510439589.XA
Authority: CN
Inventors: 张天柱; 郭振超; 杨新明; 顾宁
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2015-07-23
Filing date: 2015-07-23
Publication date: 2018-01-16
Anticipated expiration: 2035-07-23
Also published as: CN104984389A

Abstract

本发明涉及一种大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，包括以下步骤：配制质量百分比浓度为20％的P(MVE‑alt‑MAH)水溶液，取质量百分比浓度为10％的碳酸氢钠溶液，缓慢滴加到P(MVE‑alt‑MAH)水溶液中，调节pH为5‑6，反应加入1‑乙基‑(3‑甲基氨基丙基)碳酰二亚胺活化；再加N‑羟基琥珀酰亚胺反应(3)调节pH7.2，再加入2mL鸡蛋清进行交联；(4)滴入PBS溶液，将多余小分子脲吸出去除，即得。硬度梯度容易控制，所形成的皱褶和密集的大型孔洞利于细胞的黏附生长。制备过程简单，材料经济，易于实现，蛋清本身可以给细胞提供一定的营养支持，不涉及采用高温高压装置，安全无毒副作用。

Description

一种大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法

技术领域

本发明涉及新型改性蛋清细胞培养支架材料的制备技术，特别涉及一种用P(MVE-alt-MAH)交联剂交联法制备得到的多个硬度梯度大孔改性蛋清细胞培养支架材料的方法。

背景技术

乙烯基甲醚/马来酸酐共聚物P(MVE-alt-MAH),又称乙烯甲醚-马来酸酐共聚物(甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物，甲氧基乙烯/马来酸酐共聚物)，是水溶性电解质聚合物，是人工合成化合物中少数几种的对人体和动物无毒无害的物质。因产品具有良好的化学稳定性、低毒性、生物相容性、络合性、螯合性、粘合性、凝聚性、成膜性、兼有亲水和疏水的独特性能，该产品在现代工业中有广泛的用途，可以起到分散剂、偶联剂、稳定剂、增稠剂、乳化剂、增溶剂、缓蚀剂、成膜剂和抗静电剂的作用。可以作为交联剂，制备具有大孔结构的高分子材料。

组织工程支架材料是指替代细胞外基质使用的生物相容性医学材料。除要考虑材料的组织相容性外，还要考虑力学相容性—粘弹性，合适的三维立体结构。孔隙率应该达到90％以上，有较大的比表面积，有利于黏附细胞，容纳细胞因子、营养物质，同时具有均匀分布和互相连通的孔结构，有利于细胞在整个支架体内部形成网络分布，有利于代谢废物的排出和血管神经的长入，保证再生组织具有三维有机结构。

蛋清含有细胞生长发育所需要的全部营养和信号成分，是一种以水作为介质，以蛋白作为分散相的胶体物质，约占鸡蛋总重的60％～63％。其中的85％～89％为水分，而剩余的固形物中，约有80％的蛋白质，其力学性能及形貌有较大范围的可改性调节。通过对蛋清培养支架材料采用不同方式改性，用于研究不同的材料硬度和形貌微环境对细胞行为的影响。

P(MVE-alt-MAH)和蛋白质的酰胺化反应通过1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为活化剂和催化剂得以进行。以10mg/ml的EDC活化羧基15-20min，pH5.0，然后用10mg/ml NHS来激活反应15-20min。调节pH7.2左右加入蛋白，37℃反应12h。偶联时EDC反应的最佳条件是pH 4.5(或者在4-6范围之间)，使用精密pH试纸测定。反应时间6h以上，延长到12h会更好。反应完应把小分子量的脲除掉。

酰胺键偶合在弱碱条件下进行：1.称NHS与反应容器中。(NHS稳定性比EDC好)2.称EDC。(这步要快，EDC在空气中会受潮水解，尽量使用5倍Sulfo-NHS摩尔以上的量)3.加入PBS buffer。4.用NaHCO₃10％或者NaOH(1M)将pH调至中性反应。EDC/NHS是把两种物质的-NH₂和-COOH交联起来。COOH与EDC反应，反应后的物质再与NH₂反应，中间NHS是加速反应EDC很容易失活，半衰期只有120min，要注意马上使用，并且防潮。

EDC起到了一个活化羧基的作用，EDC能够和羧基反应形成一个中间物，然后这个中间物再与氨基作用，使得氨基和羧基反应形成相应的共价键。NHS的作用就是稳定这个中间物，减少副反应的发生。

蛋白质化学交联是一类重要化学修饰反应，所用交联剂为含有双功能基团的化学试剂。化学交联型具有良好的力学性能和稳定性。因为P(MVE-alt-MAH)天然安全无毒副作用，所以是目前研究的热点，可用于生物医学组织工程高分子的交联改性制备大孔支架材料。

发明内容

本发明的目的在于为了提供一种大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，工艺简单，周期短，且适用于批量生产。

本发明的另一个目的在于提供一种新型改性蛋清细胞培养支架材料，交联度均匀，表面多皱褶或多大孔，形貌结构统一。

本发明提供的技术方案如下：一种大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)配制质量百分比浓度为20％的P(MVE-alt-MAH)水溶液，取0.025～0.2g的P(MVE-alt-MAH)水溶液加入反应器皿中；

(2)取质量百分比浓度为10％的碳酸氢钠溶液，缓慢滴加到P(MVE-alt-MAH)水溶液中，调节pH为5-6，反应10-15min；加入1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳酰二亚胺活化15-20min；再加N-羟基琥珀酰亚胺反应15-20min；1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:1；

(3)调节pH7.2，再加入2mL鸡蛋清进行交联，充分振荡或搅拌后静置，25～37℃下充分交联反应完全；

(4)将步骤(3)得到的改性蛋清培养支架材料用注射器逐滴滴入PBS溶液，静止12h，使其中的多余小分子脲吸出去除，重复若干次；

(5)反应后，得到的改性蛋清细胞培养支架材料置于细胞超净工作台，紫外照射杀菌即获得用于细胞培养的大孔改性蛋清培养支架材料。

第(5)步得到的大孔改性蛋清培养支架材料进一步制备成冻干粉末。

第(4)步重复若干次是指的用PBS溶液重复三次，每次12h洗涤去除多余及未交联的小分子脲。

所紫外照射杀菌为超净台内紫外光照不超过30min。

根据权利要求1所述的大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，

基于所述的大孔改性蛋清细胞培养支架材料的细胞培养方法，将大孔改性蛋清细胞培养支架移入六孔板中，向每孔加入0.4mL事先准备好的SKOV3卵巢癌细胞悬液，细胞浓度为5×10⁴cells/mL,细胞数量每孔不低于5×10⁴个；在培养过程中，小于等于7天的培养时间，采用连续追加培养液法进行培养；大于等于15天以上的培养期，则采用每3天各孔更新一半培养液的办法进行换液。

所述的基于大孔改性蛋清细胞培养支架材料的细胞培养方法，所用的细胞悬液为SKOV3卵巢癌贴壁细胞。

所述的大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法得到的冻干粉末的应用，将制备好的大孔改性蛋清细胞培养支架材料冻干粉末添加到正在贴壁培养瓶或皿里，短期培养后用以实现材料和细胞的分离。

有益效果

本发明所述的大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，可灵活使用。制备好的大孔改性蛋清细胞培养支架材料可进一步制成冻干粉末，添加到正在贴壁对数生长期的贴壁细胞培养瓶(皿)里，短期培养后，易于实现材料和细胞的分离，研究材料对细胞行为的影响。

本发明所制备的新型改性蛋清细胞培养支架材料，硬度梯度容易控制，所形成的皱褶和孔洞利于细胞的黏附生长。各孔洞互为贯通，有利于营养和氧气、代谢物的交换排出，也利于细胞向材料内部生长，提高细胞培养密度。制备过程简单，材料经济，易于实现，蛋清本身可以给细胞提供一定的营养支持，不涉及采用高温高压装置，安全无毒副作用。

附图说明

图1是本发明实施例1、2、3、4、5获得的大孔改性蛋清细胞培养支架材料的冻干扫描电镜图；本发明制备得到大孔改性蛋清细胞培养支架材料表面皱褶、多孔，形貌结构统一。其中，各图显示了P(MVE-zlt-MAH)完全交联后的蛋清的形貌变化。(a)0.2g P(MVE-zlt-MAH)处理；(b)0.15g P(MVE-zlt-MAH)处理；(c)0.1g P(MVE-zlt-MAH)处理；(d)0.05g P(MVE-zlt-MAH)处理；(e)0.025g P(MVE-zlt-MAH)处理。

图2蛋清P(MVE-zlt-MAH)交联后流变学变化特征。可以看出，随交联剂量增加，支架材料的粘弹性总体有增大的趋势。2mL蛋清P(MVE-zlt-MAH)交联后流变学变化特征。(a)0.2g P(MVE-zlt-MAH)处理；(b)0.15g P(MVE-zlt-MAH)处理；(c)0.1g P(MVE-zlt-MAH)处理；(d)0.05g P(MVE-zlt-MAH)处理；(e)0.025g P(MVE-zlt-MAH)处理。

图3.SKOV3卵巢癌细胞在P(MVE-zlt-MAH)交联蛋清支架材料中的生长状态倒置光学显微照片，可以看出该制备支架材料可以较好地支持细胞生长。SKOV3卵巢癌细胞在P(MVE-zlt-MAH)交联蛋清支架材料中的生长3天后的倒置光学显微照片。(a)0.2g P(MVE-zlt-MAH)处理蛋清中的SKOV3；(b)0.15g P(MVE-zlt-MAH)处理蛋清中的SKOV3；(c)0.1g P(MVE-zlt-MAH)处理蛋清中的SKOV3；(d)0.05g P(MVE-zlt-MAH)处理蛋清中的SKOV3；(e)0.025g P(MVE-zlt-MAH)处理蛋清中的SKOV3。

具体实施方式

以下实施例所采用的原料来源说明：P(MVE-alt-MAH)购自南京晚晴化学试剂有限公司；新鲜的鸡蛋清购自超市；无菌超纯水取自无菌超纯水自制系统；所用到的6孔板为无菌洁净。

以下实施例在取溶液及蛋清等液体时，采用“毫升”为单位，即ml。溶质的质量为“克”，即g。

一种新型改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)选用100mL烧杯，将20克P(MVE-alt-MAH)加入到80mL超纯水中，加热90℃搅拌2h以上，充分溶解至无色透明。配制成20％溶液。分别取20％P(MVE-alt-MAH)溶液1mL、0.75mL、0.5mL、0.25mL、0.125mL,即0.2克、0.15克、0.1克、0.05克、0.025克，于6孔板中；

P(MVE-alt-MAH)交联剂质量不设零克。加热搅拌2h以上,无色透明溶液为其充分溶解特征。比较适应的溶解温度为90℃，磁子搅拌转速为300-400r/m。不宜超过6h,否则可能发黄，影响观察。除6孔板外，其它烧瓶、烧杯、培养皿等容器也可以代替进行。

(2)取10％的碳酸氢钠溶液，缓慢滴加到6孔板中，调P(MVE-alt-MAH)的pH为5，反应10-15min；加1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC),活化15-20min；再加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，反应15-20min；

中和时要缓慢，一滴一滴的加，防止气泡溢出。pH为5-6均可。EDC/NHS要现用现加，质量比1：1。要充分搅拌和振荡。促进反应均匀充分。

(3)调节pH7.2左右，加2mL新鲜的鸡蛋清进行交联，充分振荡或搅拌后静置，室温下25-37℃反应12-24h，使其充分交联完全；

此反应实际上6h左右即可发生完全，但考虑到材料试剂的不均一性，放置24h基本上可以保证交联充分。

(4)将步骤(3)得到的改性蛋清培养支架材料用注射器逐滴滴入PBS溶液，静止12h，使其中的多余小分子脲吸出去除，重复三次；

(4)反应后，得到的改性蛋清细胞培养支架材料置于细胞超净工作台，紫外照射30min,保证培养支架材料的无菌状态，加入事先准备好的SKOV3卵巢癌细胞悬液，即可获得用于细胞培养的多个硬度梯度大孔蛋清培养支架材料。在培养过程中，短期培养，如7天左右，可连续追加培养液培养；长期培养，如15天以上，每3天各孔更新一半培养液的办法进行换液。

(5)根据所述的大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，可灵活使用。制备好的大孔改性蛋清细胞培养支架材料可进一步制成冻干粉末，添加到正在贴壁对数生长期的贴壁细胞培养瓶(皿)里，短期培养后，易于实现材料和细胞的分离，研究材料对细胞行为的影响。

实施例1

一种大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)选用100mL烧杯，将20克P(MVE-alt-MAH)加入到80mL超纯水中，加热90℃搅拌2h以上，充分溶解至无色透明。配制成20％溶液。取20％P(MVE-alt-MAH)溶液1mL,即0.2克，于6孔板中；

(2)取10％的碳酸氢钠溶液，缓慢滴加到6孔板中，调P(MVE-alt-MAH)的pH为6，反应10-15min；加1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC),活化15-20min；再加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，反应15-20min；

(3)调节pH7.2左右，加2mL鸡蛋清进行交联，充分振荡或搅拌后静置，室温下反应24h以上，使其充分交联完全；

(4)将步骤(3)得到的改性蛋清培养支架材料用注射器逐滴滴入PBS溶液，静止12h，使其中的多余小分子吸出去除，重复三次；

(4)反应后，得到的改性蛋清细胞培养支架材料置于细胞超净工作台，紫外照射30min,保证培养支架材料的无菌状态，即可获得用于细胞培养的大孔蛋清培养支架材料。加入事先准备好的SKOV3卵巢癌细胞悬液进行培养。在培养过程中，短期培养，如7天左右，可连续追加培养液培养；长期培养，如15天以上，每3天各孔更新一半培养液的办法进行换液。

如图1.a、图3.a。

实施例2

(1)选用100mL烧杯，将20克P(MVE-alt-MAH)加入到80mL超纯水中，加热90℃搅拌2h以上，充分溶解至无色透明。配制成20％溶液。取20％P(MVE-alt-MAH)溶液0.75mL,即0.15克，于6孔板中；

(4)反应后，得到的改性蛋清细胞培养支架材料置于细胞超净工作台，紫外照射30min,保证培养基的无菌状态，即可获得用于细胞培养的大孔蛋清培养支架材料。加入事先准备好的SKOV3细胞悬液。在培养过程中，短期培养，如7天左右，可连续追加培养液培养；长期培养，如15天以上，每3天各孔更新一半培养液的办法进行换液。

如图1.b、图3.b。

实施例3

一种新型改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)选用100mL烧杯，将20克P(MVE-alt-MAH)加入到80mL超纯水中，加热90℃搅拌2h以上，充分溶解至无色透明。配制成20％溶液。取20％P(MVE-alt-MAH)溶液0.5mL,即0.1克，于6孔板中；

(4)反应后，得到的改性蛋清细胞培养支架材料置于细胞超净工作台，紫外照射30min,保证培养支架材料的无菌状态，即可获得用于细胞培养的多密度大孔蛋清培养支架材料。加入事先准备好的SKOV3卵巢癌细胞悬液。在培养过程中，短期培养，如7天左右，可连续追加培养液培养；长期培养，如15天以上，每3天各孔更新一半培养液的办法进行换液。

如图1.c、图3.c。

实施例4

(1)选用100mL烧杯，将20克P(MVE-alt-MAH)加入到80mL超纯水中，加热90℃搅拌2h以上，充分溶解至无色透明。配制成20％溶液。分别取20％P(MVE-alt-MAH)溶液0.25mL,即0.025克，于6孔板中；

如图1.d、图3.d。

实施例5

(1)选用100mL烧杯，将20克P(MVE-alt-MAH)加入到80mL超纯水中，加热90℃搅拌2h以上，充分溶解至无色透明。配制成20％溶液。分别取20％P(MVE-alt-MAH)溶液0.125mL,即0.025克，于6孔板中；

(4)反应后，得到的改性蛋清细胞培养支架材料置于细胞超净工作台，紫外照射30min,保证培养支架材料的无菌状态，即可获得用于细胞培养的多密度大孔蛋清培养支架材料。加入事先准备好的SKOV3卵巢癌细胞悬液进行培养。在培养过程中，短期培养，如7天左右，可连续追加培养液培养；长期培养，如15天以上，每3天各孔更新一半培养液的办法进行换液。

如图1.e、图3.e。

Claims

1.一种大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）配制质量百分比浓度为20%的P(MVE-alt-MAH)水溶液，取0.025~0.2g的P(MVE-alt-MAH)水溶液加入反应器皿中；

（2）取质量百分比浓度为10%的碳酸氢钠溶液，缓慢滴加到P(MVE-alt-MAH)水溶液中，调节pH为5-6，反应10-15 min；加入1-乙基-（3-甲基氨基丙基）碳酰二亚胺活化15-20 min；再加N-羟基琥珀酰亚胺反应15-20 min；1-乙基-（3-甲基氨基丙基）碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:1；

（3）调节pH7.2，再加入2 mL鸡蛋清进行交联，充分振荡或搅拌后静置，25~37℃下充分交联反应完全；

（4）将步骤（3）得到的大孔改性蛋清细胞培养支架材料用注射器逐滴滴入PBS溶液，静止12 h，使其中的多余小分子脲吸出去除，重复若干次；

（5）将步骤（4）得到的大孔改性蛋清细胞培养支架材料置于细胞超净工作台，紫外照射杀菌即获得用于细胞培养的大孔改性蛋清培养支架材料。

2.根据权利要求1所述的大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，其特征在于，第（5）步得到的大孔改性蛋清培养支架材料进一步制备成冻干粉末。

3.根据权利要求1所述的大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，其特征在于，第（4）步重复若干次是指的用PBS溶液重复三次，每次12 h洗涤去除多余及未交联的小分子脲。

4.根据权利要求1所述的大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，其特征在于，所述紫外照射杀菌为超净台内紫外光照不超过30 min。

5.一种细胞培养方法，其中使用的细胞培养支架材料是通过权利要求1～4任一项所述的大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法得到，其特征在于，将大孔改性蛋清细胞培养支架移入六孔板中，向每孔加入0.4 mL事先准备好的SKOV3卵巢癌细胞悬液，细胞浓度为5 × 10⁴ cells/mL,细胞数量每孔不低于5×10⁴个；在培养过程中，小于等于7天的培养时间，采用连续追加培养液法进行培养；大于等于15天以上的培养期，则采用每3天各孔更新一半培养液的办法进行换液。

6.根据权利要求5所述的细胞培养方法，其特征在于，所用的细胞悬液为SKOV3卵巢癌贴壁细胞。

7.根据权利要求2所述的大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法得到的冻干粉末的应用，其特征在于，制备好的大孔改性蛋清细胞培养支架材料冻干粉末添加到贴壁培养瓶或皿里，短期培养后用以实现材料和细胞的分离。