CN104982645A - 一种磷酸化改性提高卵白蛋白乳化性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种磷酸化改性提高卵白蛋白乳化性的方法，其是将卵白蛋白加水配成质量浓度为5.0%的蛋白溶液，然后在蛋白溶液中加入卵白蛋白质量3.0%的三聚磷酸钠，并调pH值为7.6，再将混合液于39℃进行磷酸化反应，反应时间为153min，反应结束后收集上清液，经冷冻干燥得改性后的卵白蛋白。与未经改性的卵白蛋白相比，按本发明方法进行改性可显著提高卵白蛋白的乳化性，其乳化活性可达0.513，且其处理方法简单，有利于促进卵白蛋白在乳化体系中的应用。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种磷酸化改性提高卵白蛋白乳化性的方法。
背景技术
磷酸化是将磷酸基团加在中间代谢产物上或蛋白质上的过程，其机理是无机磷酸与蛋白质上特定的氧原子或氮原子形成-C-O-Pi或-C-N-Pi酯化反应，从而引进磷酸根基团，提高蛋白分子之间的静电斥力，增加蛋白的电负性，使之更易分散，进而改善蛋白的乳化性。而且磷原子是生物膜的重要组成成分，是所有生物体不可缺少的元素之一，从毒理学的角度看，磷酸根离子为所有生物代谢所必需，但其必须从膳食中获得，所以蛋白质的磷酸化改性是一种实用、有效的方法。
卵白蛋白是鸡蛋清中的主要蛋白，其含量约占蛋清蛋白质的54%~63%。蛋清是一种优质蛋白，含有8种人体必需氨基酸，还含有部分人体必需的微量元素，其蛋白质含量高达90%，水溶性好，易被人体吸收利用；另外，卵白蛋白能快速提供能量，促进机体的生长发育和新陈代谢，加速伤口愈合和血红蛋白合成。卵白蛋白为磷酸糖蛋白，是具有高度二级结构的球型结构，相对分子质量为43.0kDa，等电点为4.5，50%以上为疏水氨基酸残基，含3.5%糖基及埋藏于疏水中心内部的1个二硫键、4个自由巯基，天然卵白蛋白的巯基虽然包裹在分子内，但在蛋白质因变性而展开的过程中发挥很大作用，热处理下蛋白质凝胶结构的稳定性以及蛋白质聚集体的形成都与巯基有关，且卵白蛋白相对有序度较高，结构较为致密，自然卵白蛋白在储运过程中会转化为热稳定性的S-卵白蛋白构型。正是由于卵白蛋白的结构独特性决定其在分子改性以改善其功能特性时，呈现出与其他常用食品蛋白不同的机理与条件。随着蛋品深加工、综合利用的研究深入，鸡蛋生物活性成分的多级联产提纯技术日趋发展与完善，卵白蛋白作为鸡蛋清中含量最大的蛋白组分，是各种方法提纯其它功能活性成分时必须首先分离的对象。
蛋白质分子与多相体系中的脂肪、水等分子间相互作用形成乳化性，其被作为衡量蛋白质促进油-水型乳状液形成能力的指标，受疏水基团、亲水基团及氨基酸种类、数量的影响。由于卵白蛋白具有良好的起泡性、胶凝性、乳化性、持水性等特性，是食品加工中的重要原辅料。但其欠理想的乳化性限制其在乳化体系中的应用。因此，加深对卵白蛋白的研究，采用生物、物理或化学方法对卵白蛋白进行改性能够改善并提高卵白蛋白的乳化性，进一步扩大其在食品中的应用，对促进其高效综合利用具有重要意义。目前，卵白蛋白改性的方法主要有物理、化学及酶法，即可通过改变卵白蛋白的氨基酸组成、蛋白质的分子大小、疏水基团的数量以及表面静电荷数等手段提高卵白蛋白的乳化性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种磷酸化改性提高卵白蛋白乳化性的方法，其可显著提高所得卵白蛋白的乳化性，有利于促进卵白蛋白在乳化体系中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种磷酸化改性提高卵白蛋白乳化性的方法，是将卵白蛋白加水配成质量浓度为5.0%的蛋白溶液，然后在蛋白溶液中加入卵白蛋白质量3.0%的三聚磷酸钠，并调pH值为7.6，再将混合液置于39℃的水浴锅中进行磷酸化反应，反应时间为153min，反应结束后收集上清液，经冷冻干燥得改性后的卵白蛋白。
所述卵白蛋白来源于鸡蛋清，其具体提取方法为：选择无污染、无裂缝的新鲜鸡蛋，将蛋白与蛋黄分离后，将蛋白与去离子水按质量比为1:1混合进行稀释，在25℃下磁力搅拌10min，用纱布过滤，然后边磁力搅拌边缓慢加入混合液质量15%的PEG8000；搅拌1-2h后将混合液在5000r/min的条件下离心20min，取上清液；边磁力搅拌边用1mol/L HCl调pH值至4.5，静置30min后产生沉淀，收集沉淀即为卵白蛋白纯品，冷冻干燥后冷藏备用。
本发明的显著优点在于：采用本发明方法对卵白蛋白进行改性，其乳化活性可达0.513，与未改性的卵白蛋白相比，其乳化性有显著提高，且其处理方法简单，有利于促进卵白蛋白在乳化体系中的应用。
附图说明
图1为不同反应温度对卵白蛋白乳化性的影响。
图2为不同反应时间对卵白蛋白乳化性的影响。
图3为不同STP用量对卵白蛋白乳化性的影响。
图4为不同pH值对卵白蛋白乳化性的影响。
图5为反应温度与pH值对卵白蛋白乳化活性影响的响应面图（a）和等高线分析图（b）。
图6为pH值与反应时间对卵白蛋白乳化活性影响的响应面图（a）和等高线分析图（b）。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
1仪器和试剂
1.1实验仪器
722型可见分光光度计（上海舜宇恒平科学科学仪器有限公司）；FJ200-SH数显高速分散均质器（上海标本模型厂）；离心机(上海安亭科学仪器厂)；HJ-3数显恒温磁力搅拌器（常州振华仪器有限公司）；FD5-2.5真空冷冻干燥器（SIM，U.S.A），FA2004电子天平（上海舜宇恒平科学科学仪器有限公司）；HH-S2恒温水浴锅（金坛市成辉仪器厂）；PHSJ-4A实验室pH计（上海精密科学仪器有限责任公司）；25mm透析袋（BIOSHARP，U.S.A）等。
1.2材料与试剂
鲜鸡蛋（湘西吉首阳光超市购置）；金龙鱼食用调和油（广东省深圳市）；三聚磷酸钠，十二烷基磺酸钠，PEG8000，NaOH，浓盐酸均为国产分析纯试剂。
2实验方法
2.1卵白蛋白的提取
所用卵白蛋白的提取方法为：选择无污染、无裂缝的新鲜鸡蛋，将蛋白与蛋黄分离后，将蛋白与去离子水按质量比为1:1混合进行稀释，在25℃下磁力搅拌10min，用纱布过滤，然后边磁力搅拌边缓慢加入混合液质量15%的PEG8000；搅拌1-2h后将混合液在5000r/min的条件下离心20min，取上清液；边磁力搅拌边用1mol/L HCl调pH值至4.5，静置30min后产生沉淀，收集沉淀即为卵白蛋白纯品，冷冻干燥后冷藏备用。
2.2磷酸化改性工艺
将所得卵白蛋白加去离子水配成质量浓度为5.0%的蛋白溶液，然后加入三聚磷酸钠，调pH值后置于水浴锅中进行磷酸化反应，反应结束后收集上清液，冷冻干燥后备用。
2.3卵白蛋白乳化性测定
将经不同条件磷酸化处理后的卵白蛋白，分别溶解于pH值为7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液中，配制成0.5mg/L的蛋白溶液样品。然后于l0mL调和油中分别加入20mL样品，室温下以10000r/min均质1min，然后立即从底部吸取100μL均质后的乳化液，加入5mL质量分数为0.1%的SDS，充分混匀后，以等量0.1%的SDS溶液作空白，在500nm处测其吸光度A1，即为乳化活性EA；静置10min后，再次测定吸光度A2，计算得乳化稳定性Es。乳化稳定性的计算方法为：ES=A1×t/(A1-A2)，其中，t为静置时间。
2.4单因素试验
2.4.1不同反应温度对卵白蛋白乳化性的影响
将蛋白溶液的pH值调至8.0，STP添加量为卵白蛋白的5.0%，分别将反应温度设为15、20、25、30、35、40、45℃，反应180min，测定反应后各蛋白样品的乳化性。
2.4.2不同反应时间对卵白蛋白乳化性的影响
将蛋白溶液的pH值调至8.0，STP添加量为卵白蛋白的5.0%，在35℃下分别将反应时间设为30min、60min、120min、180min、240min、300min，测定反应后各蛋白样品的乳化性。
2.4.3不同STP用量对卵白蛋白乳化性的影响
将蛋白溶液的pH值调至8.0，温度为35℃，反应时间180min，将STP添加量分别设为卵白蛋白质量的1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%，测定反应后各蛋白样品的乳化性。
2.4.4不同pH值对卵白蛋白乳化性的影响
STP添加量为卵白蛋白的3.0%，温度为35℃，反应时间为180min，将pH值分别调至6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，测定反应后各蛋白样品的乳化性。
2.5响应面法优化试验
在单因素试验基础上，确定反应时间、pH值、反应温度为自变量，以卵白蛋白的乳化活性为响应值，采用Box-Betoken试验设计方法，研究各自变量及其交互作用对卵白蛋白乳化活性的影响。然后采用Design Expert软件进行响应面优化分析，并确定卵白蛋白磷酸化改性的最佳工艺条件。
3结果与分析
3.1单因素试验
3.1.1不同反应温度对卵白蛋白乳化性的影响
图1为不同反应温度对卵白蛋白乳化性的影响。图1结果表明，随着改性温度的升高，乳化活性和乳化稳定性先上升后下降。乳化活性在35℃时取到最大值，乳化稳定性在25℃时取到最大值。这是因为在温度较低时，随着温度的升高，蛋白质溶解性增强，导致乳化活性不高，而乳化稳定性较好；在较高的温度时，蛋白质溶解性增加，蛋白质分子的表面活性增加，导致乳化活性和乳化稳定性增强，温度过高时，卵白蛋白发生变性，失去活性，乳化活性与乳化稳定性也随之降低。因此，取30℃-40℃为响应面试验的反应温度范围。
3.1.2不同反应时间对卵白蛋白乳化性的影响
图2为不同反应时间对卵白蛋白乳化性的影响。图2结果表明，随着磷酸化改性反应的进行，卵白蛋白乳化活性和乳化稳定性随改性时间的增加先上升后下降，乳化活性在120min时达到最大值，乳化稳定性在180min处达到最大值。这是由于短时间内，包裹在卵白蛋白分子中的疏水基团暴露出来，使卵白蛋白分子亲油性增强，易分散于油-水界面，乳化性增强。而改性时间过长，蛋白水解程度提高，水解产物不易吸附在油-水界面形成的粘膜上，故乳化性明显降低。因此，取磷酸化改性时间120min-240min为响应面试验的最佳范围。
3.1.3不同STP用量对卵白蛋白乳化性的影响
图3为不同STP用量对卵白蛋白乳化性的影响。图3结果表明，卵白蛋白乳化活性随着STP用量的增加先缓慢上升，到STP添加量为3.0%时乳化活性达到最大值，之后快速下降，到STP添加量为6.0%后下降缓慢。卵白蛋白的乳化稳定性先随STP添加量的增大而缓慢上升，当STP用量为5.0%时达到最大，之后快速下降。与不添加STP的卵白蛋白相比，改性后卵白蛋白的乳化活性与乳化稳定性都得到了明显提高。这是因为STP用量的增加，使得STP与卵白蛋白分子肽链的接触机率增加，使蛋白质分子在油-水界面上的排列更加有序，乳化性增强。但当STP用量达到一定程度后，卵白蛋白对STP达到饱和，STP的作用受到抑制，含磷酸根基团的蛋白质分子间的静电斥力增加，导致乳化性降低。选择STP用量为3.0%时，乳化活性最大。
3.1.4不同pH值对卵白蛋白乳化性的影响
图4为不同pH值对卵白蛋白乳化性的影响。图4结果表明，随着溶液pH值的增加，其乳化活性和乳化稳定性呈现出先上升后下降的趋势，乳化活性在pH值为7.0时达到最大值，乳化稳定性在pH值为8.0时达到最大值。这是由于随着pH值的增加，蛋白质所带净电荷增加，导致蛋白质分子间排斥力增加，分散性增强，卵白蛋白溶解性更好，促进乳化性。同时，在过酸的条件下，卵白蛋白因过于靠近等电点而析出；而当pH值过高时，在碱的作用下，卵白蛋白变性失活，从而降低其乳化活性和乳化稳定性。因此，取pH值6.0-8.0为响应面试验的最佳范围。
3.2响应面优化试验及结果
在单因素试验结果基础上，以磷酸化改性的反应时间、pH值、反应温度为自变量，以卵白蛋白乳化活性为响应值，进行响应面优化分析。实验因素和水平见表1，实验结果见表2。
表1响应面分析因素及水平表
表2响应面分析方案及实验结果
以表2中实验6、9、11、13、17为中心实验，其他为析因实验。17个实验点分为析因点和零点，其中析因点为自变量取值在X1、X2、X3所构成的三维顶点，零点为区域的中心点，零点实验重复5次，用来估计实验误差。采用Design-Expert8.0.6程序对所得数据进行ANOVA分析，分析结果见表3。
表3响应面ANOVA分析结果
三个因子经过拟合得到的回归方程为：Y＝0.51+0.029×A+0.022×B+0.029×C-0.032×A×B-0.012×A×C-0.022×B×C-0.051×A2-0.037×B2-0.050×C2。
从表3的分析结果可知：模型的F=52.47，P<0.0001，表明本响应面模型极显著，在统计学上是有意义的。失拟项用来表示所用模型与实际拟合的程度，此模型中失拟残差为10.21%，不显著。因此对实验结果进行分析时，此模型中的回归方程可代替实验真实点。
从表3可知，模型中除了单因子A、B、C对Y值的影响非常显著外，双因子AB、BC对Y值的影响也非常显著，证明实验因素对响应值不是简单的线性关系，二次项A2、B2、C2对响应值也有很大的关系。
图5、图6分别直观地给出了三个因素间两两交互的响应面图和等高图。从图中可以看出，在实验所选的范围内，响应值存在极大值，即响应面的最高点和等高线最小椭圆的中心点。由Design-Exoert 8.0.6分析得到最大响应值（Y）即最大乳化活性时，其最佳工艺条件为：磷酸化改性时间152.73min，pH值7.60，改性温度38.74℃，理论最大乳化活性为0.511。
为了检验响应面优化试验的可行性，采用得到的最佳工艺条件进行卵白蛋白乳化活性测定的验证试验，同时考虑到实际操作和生产的便利，以改性时间153min，pH值7.6，改性温度39℃为最佳，得到实际乳化活性值为0.513，与未改性卵白蛋白的乳化活性（0.31）相比，改性后提高了65.48%，表明采用本发明方法可显著提高卵白蛋白的乳化性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (1)
1. 一种磷酸化改性提高卵白蛋白乳化性的方法，其特征在于：将卵白蛋白加水配成质量浓度为5.0%的蛋白溶液，然后在蛋白溶液中加入卵白蛋白质量3.0%的三聚磷酸钠，并调pH值为7.6，再将混合液于39℃进行磷酸化反应，反应时间为153min，反应结束后收集上清液，经冷冻干燥得改性后的卵白蛋白。
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