CN104981150A

CN104981150A - 新的诱导型应激行为动物模型

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Publication number: CN104981150A
Application number: CN201380072299.5A
Authority: CN
Inventors: S·柳; R·德马尔科
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2012-12-06
Filing date: 2013-12-05
Publication date: 2015-10-14
Also published as: EP2740353A1; EP2928288A1; US10080355B2; US20150282462A1; WO2014086938A1; EP2928288B1

Abstract

本发明涉及一种产生诱导型应激动物模型的方法，所述方法包括遗传修饰非人脊椎动物以表达在下丘脑-垂体-肾上腺轴细胞中可以通过光激活的一种或多种蛋白，其中可以通过光激活的蛋白能够诱导(i)从下丘脑前区的室旁核中的神经元释放促皮质素释放激素(CRH)和/或精氨酸-加压素(AVP)；(ii)从垂体前叶中的促肾上腺皮质激素细胞释放促肾上腺皮质激素；和/或(iii)从肾上腺皮质中的细胞释放糖皮质激素。本发明进一步涉及通过本发明的方法获得的应激动物模型以及所述动物模型在筛选用于预防、改善或治疗应激和/或应激相关疾病的化合物中的用途。此外，本发明还涉及一种筛选用于预防、改善和/或治疗应激和/或应激相关疾病的化合物的方法以及在鱼中分析应激行为的方法。

Description

新的诱导型应激行为动物模型

本发明涉及一种产生诱导型应激动物模型的方法，所述方法包括遗传修饰非人脊椎动物以表达在下丘脑-垂体-肾上腺轴细胞中可以通过光激活的一种或多种蛋白，其中可以通过光激活的蛋白能够诱导(i)从下丘脑前区(rostral hypothalamus)的室旁核中的神经元释放促皮质素释放激素(CRH)和/或精氨酸-加压素(AVP)；(ii)从垂体前叶中的促肾上腺皮质激素细胞释放促肾上腺皮质激素；和/或(iii)从肾上腺皮质中的细胞释放糖皮质激素。本发明进一步涉及通过本发明的方法获得的应激动物模型以及所述动物模型在筛选用于预防、改善或治疗应激和/或应激相关疾病的化合物中的用途。此外，本发明还涉及一种筛选用于预防、改善和/或治疗应激和/或应激相关疾病的化合物的方法以及在鱼中分析应激行为的方法。

在本说明书中，引用包括专利申请和制造商的使用手册在内的许多文件。虽然不认为与本发明的专利性相关，但通过引用将这些文件的整体内容加入本文。更具体地，所有引用的文件均援引加入本文，与具体并单独地表明每个单独的文件援引加入本文相同。

应激是生物通过激活整体上称作应激应答的一套生理和行为应答来抵消的受威胁的稳态状态(Johnson et al.,1992)。应激应答包括两个系统。负责中间反应的交感-肾上腺髓质系统以及负责能量重新分配和应激应答终止的下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴(de Kloet et al.,2005)。对应激应答，下丘脑前区的室旁核(PVN)中的神经元将促皮质素释放激素(CRH)和精氨酸-加压素(AVP)释放入下丘脑-垂体门脉循环。垂体前叶中这些信号的受体结合触发促肾上腺皮质激素(ACTH)从促肾上腺皮质激素细胞释放入血液。然后ACTH刺激肾上腺皮质中的细胞分泌糖皮质激素。糖皮质激素是HPA-轴的最终效应子(de Kloet et al.,2005)，具有周围和中枢神经系统中的靶标(Munck et al.,1984)，包括首先触发应激应答的下丘脑中的细胞，因此形成抑制CRH和ACTH释放的负反馈(Dallman et al.,1994)。生理应激相关物包括免疫系统、心血管功能和代谢中的改变(Munck et al.,1984,Sapolsky et al.,2000)，而行为应激相关物包括增加的认知和集中注意力，生殖行为减少，以及抑制食欲和进食(Chrousos and Gold,1992)。

虽然对于动物的短期存活至关重要，但是应激应答的不足或过度激活可以是有害的，并且肥胖、抑郁和痴呆已与应激应答障碍有关(Raber,1998)。

尽管其具有重要性，但是完全功能应激应答系统的开发和负责应激应答障碍的分子机制仍不确定。因此，在动物模型中精确地控制并检测应激应答的能力在测试和开发应激相关病症的药物中是非常宝贵的。目前，仍缺少良好的以高通量方式测试应激障碍的动物模型。目前慢性应激的小鼠模型的产生是非常劳动密集型的，并且方案和所得的表型根据进行实验的实验室变化很大。具体地，特异性靶向HPA轴的动物模型利用基因敲除或过量表达，并且不提供时间控制。例如，由于CRH在应激应答调节中的中心作用及其与情感病症的关系，因此大量工作已集中于产生具有受损的CRH信号的小鼠模型(Muller and Holsboer 2006)。但是，全面敲除CRH的小鼠未显示应激诱导的行为受损，这可能表明其他CRH样分子在介导应激应答中的作用或者在这些突变体中存在补偿机制(Weninger et al.1999)。在另一方面，CRH受体1(CRHR1)或CRH受体2(CRHR2)全面缺陷小鼠表现出焦虑和受损的应激应答(Bale and Vale 2003；Smith et al.1998；Timpl et al.1998)。相似地，CRH全面过量表达的小鼠表现出HPA轴失调以及慢性应激样自主神经和生理改变(Dirks et al.2002；Groenink et al.2002)。但是，因为CRH和CRH受体在脑中的多个部位中表达，这些研究不可以区分CRH的下丘脑神经内分泌功能与其在通过额外的下丘脑受体部位调节不同行为中的作用。

为了克服这个问题，已产生前脑特异性的CRH过量表达小鼠(Lu et al.2008)以及边缘系统特异性的CRHR1敲除小鼠(Muller et al.2003)。最近在特定神经元群体中CRHR1的靶向缺失鉴定了CRHR1在谷氨酸能和多巴胺能神经元中的不同作用(Refojo et al.2011)。虽然这些研究已对理解CRH功能作出了重要贡献，但是事实上一个重要限制是这些基因操作不允许时间控制。甚至在特定细胞类型中，基因功能的敲除或过量表达长期组成型发生。这可以触发补偿机制，以不会正常发生的方式改变神经回路。为了模仿急性、重复或甚至长期暴露于人群体中发生的应激并与抑郁有因果关系，需要其中仅在特定细胞群体中可以时间控制CRH活性的动物模型。

相似地，到目前为止不存在可诱导的垂体或肾上腺皮质功能失活的方法。

因此，尽管已将大量精力投入到阐明应激应答的机制，但是到目前为止不存在使得能够在体内简单、时间控制并非侵入性分析应激行为的动物模型。因此，仍然需要提供这类动物模型和测试方法，例如用于药物发现。

本申请权利要求书中所表征的实施方案解决了这种需要。

因此，本发明涉及一种产生诱导型应激动物模型的方法，所述方法包括遗传修饰非人脊椎动物以表达在下丘脑-垂体-肾上腺轴细胞中可以通过光激活的一种或多种蛋白，其中可以通过光激活的蛋白能够诱导(i)从下丘脑前区的室旁核中的神经元释放促皮质素释放激素(CRH)和/或精氨酸-加压素(AVP)；(ii)从垂体前叶中的促肾上腺皮质激素细胞释放促肾上腺皮质激素；和/或(iii)从肾上腺皮质中的细胞释放糖皮质激素。

如本文所用，术语“诱导型应激动物模型”指其中当需要时研究者可以激活应激的动物。按照本发明，如下文详述的，所述动物表达可以通过光激活的一种或多种蛋白。所述蛋白的光激活启动沿下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的信号传导，因此模仿在动物中观察到的天然存在的应激应答。

在不同脊椎动物中存在负责能量重新分配和应激应答终止的下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴中的差异是本领域公知的。例如，在硬骨鱼类中，肾间腺(inter-renal gland)产生皮质类固醇(皮质醇为主要终产物)，因此它们的应激轴常称作下丘脑-垂体-肾间(HPI)轴(Wendelaar Bonga,1997)。按照本发明，这些变化意图落在术语HPA下，即使在每种情况下未明确讨论。因此，当提到HPA时，还包括HPI。

按照本发明，所述动物是遗传修饰的非人脊椎动物。所述非人脊椎动物可以是任何非人脊椎动物。优选地，所述非人脊椎动物为非人哺乳动物、鸟、鱼或蛙。甚至更优选地，所述非人哺乳动物选自啮齿动物、狗、猫科动物、灵长类、兔、猪和反刍动物；所述鸟选自鸡、火鸡、雉鸡、鸭、鹅、鹌鹑以及包括鸵鸟、鸸鹋和食火鸟在内的平胸类鸟；所述鱼选自斑马鱼、青鳉、鳟鱼、鲑鱼、金枪鱼或鲱鱼；而所述蛙选自非洲爪蟾(Xenopus)属。

如本文所用，术语“遗传修饰非人脊椎动物”指改变所述非人脊椎动物的遗传组成。按照本发明，这类改变指引入编码可以通过光激活的一种或多种蛋白的核酸序列，从而其可以转录并翻译为相应的(功能)蛋白。

本领域已知许多不同的用于修饰非人脊椎动物基因组的策略，按照本发明全部均可以采用。例如，通过用于靶向基因修饰的同源重组(HR)技术或者通过使用基因捕获或转座子介导的诱变，可以将编码可以通过光激活的一种或多种蛋白的核酸序列作为转基因引入基因组。

为了产生传统的转基因动物，将编码可以通过光激活的一种或多种蛋白的核酸序列注射入各动物的受精卵。将胚胎植入代孕母亲的子宫，并且一些后代会表达各核酸序列。这种常规的转基因方法提供相对简单和便宜的优势，同时可以实现高水平的基因表达。用这种方法，整合的位点是随机的，因此不允许基因组的靶向修饰。

除了转基因方法，通过同源重组进行基因修饰也是可能的。最初将核酸序列装配入特别设计的基因靶向载体，从而待插入的序列两侧是靶序列的基因组片段，其用作同源区以开始同源重组。通常，然后用基因靶向载体转染ES细胞，分离重组ES细胞克隆，随后将其注射入胚泡以通过嵌合体的生殖系传播突变的等位基因并建立突变系。(Hasty P,Abuin A,BradleyA.,2000,In Gene Targeting:a practical approach,ed.AL Joyner,pp.1-35.Oxford:Oxford University Press；Nagy A,Gertsenstein M,Vintersten K,Behringer R.,2003.Manipulating the Mouse Embryo.Cold Spring Harbour,New York:Cold Spring Harbour Laboratory Press)。

此外，通过将锌指-或TAL-核酸酶连同待插入的序列以及与靶序列同源的侧翼区引入卵母细胞，最近的方法使得能够在卵母细胞中通过同源重组来基因靶向(参见例如WO 2011/051390和WO 2011/154393)。

为了仅在特定细胞类型中或在特定发育阶段研究基因功能，可以产生条件突变体。

如在目前的情况下，当目标是条件基因激活时，编码待激活的基因(即可以通过光激活的一种或多种蛋白)的核酸序列包含另一序列，例如编码抗性标记的基因，两侧是位点特异性DNA重组酶的两个重组酶识别位点(RRS)。排列这个额外序列的存在，从而其防止例如通过移码或多腺苷酸化信号的存在表达待激活的基因。然后重组导致两侧为RRS的额外序列的缺失，因此导致在表达重组酶的细胞/组织中表达待激活的基因。

条件突变体需要产生两个转基因系：一个系包含如上文所述的两侧为RRS的片段，通过在ES细胞中基因靶向获得；以及在一种或多种细胞类型中表达相应的重组酶的第二转基因系。通过杂交这两个系产生条件突变体，从而根据第二转基因系中重组酶表达的模式，靶基因失活和激活以空间和时间限制方式发生(Nagy A,Gertsenstein M,Vintersten K,Behringer R.2003.Manipulating the Mouse Embryo,third edition ed.Cold Spring Harbour,New York:Cold Spring Harbour Laboratory Press；Torres RM,Kühn R.1997.Laboratory protocols for conditional gene targeting.Oxford:Oxford UniversityPress)。

作为高通量方法，基因捕获是用来实现将所关注的核酸序列插入细胞基因组中预先表征的基因座的另一方法。已开发的示例性基因捕获技术是基于以前引入基因座的盒的置换，例如Baer and Bode 2001(J.Curr OpinBiotechnol.2001；12(5))中描述的重组酶介导的盒交换(RMCE)或Cesari et al.2004(Genesis 2004；38(2))中描述的Flp-RMCE或例如WO 2011/064262中描述的方法。

此外，将突变引入基因组的有力方法是转座子介导的掺入诱变，其已变为无脊椎动物中非常宝贵的基因组工具，并且还已获得在脊椎动物如鱼中诱变的重要性。

术语“转座子”指可以在基因组内移动(转置)的DNA片段。基因不仅可以通过转座子插入而失活，转座子还可以将所关注的转基因引入基因组。与上文所述的方法相似，转座子也可以携带表达转基因必需的调节元件，因此允许所述基因的成功表达。此外，转座子可以或可以不编码催化其在基因组内重新定位和/或复制必需的酶转座酶。当转座子不编码其转座酶时，在本身不表达相关转座酶的细胞中可能需要反式表达所述酶。此外，转座子包含其调动所需要的序列，即包含转座酶结合位点的末端重复序列。

转座子可以源自细菌或真核转座子；并且转座子可以源自I类或II类转座子。II类或DNA介导的转座元件优选用于基因转移应用，因为这些元件的转座不包括可以将不期望的突变引入转基因的反转录步骤(I类或反转录元件的转座中所涉及的)(Miller,A.D.,1997,"Development andapplications of retroviral vectors".Retroviruses:843(Cold Spring HarborLaboratory Press,New York,)；Verma,I.M.and Somia,N.,1997,"Gene therapy？promises,problems and prospects".Nature 389:239)。

已设计病毒和非病毒技术以促进转基因穿透生物膜。当转座子用于插入诱变筛选时，转座子载体常包含4个主要类别的构建体以快速鉴定突变的基因。这些包含报道基因，其应当根据整合的遗传背景表达。在增强子捕获中，报道物的表达需要存在基因组顺式调节子以作用于整合的构建体内的衰减启动子。启动子捕获根本不含启动子。这些载体仅在外显子读框内或接近表达的基因的启动子下游时表达。在polyA捕获中，标记基因缺少polyA信号，但是包含剪接供体(SD)位点。因此，当整合入内含子时，可以合成融合转录物，其包含标记和捕获基因的下游外显子。基因捕获(或外显子捕获)也缺少启动子，但是在标记基因之前装有剪接受体(SA)。如果载体整合入表达的基因，并且发生报道物和上游外显子之间的剪接，则发生受体激活。基因捕获和polyA捕获盒可以组合。在这种情况下，用启动子改良polyA捕获部分的标记，从而载体还可以捕获下游外显子，并且可以获得捕获基因的上游和下游融合转录物。上述构建体还提供通过利用例如LacZ或荧光蛋白作为标记蛋白可视化突变基因的空间和时间表达模式的可能性。

在脊椎动物基因组中使用转座子的里程碑是产生睡美人(SB)元件(Ivics,Z.et al.,1997:"Molecular reconstruction of Sleeping Beauty,a Tc1-liketransposon from fish,and its transposition in human cells".Cell 91(4):501)。睡美人转座在不同脊椎动物类别的细胞中有效(Izsvak,Z.et al.,2000:"Sleeping Beauty,a wide host-range transposon vector for genetictransformation in vertebrates".J Mol Biol.302(1):93；Lu,B.et al.,2007:"Generation of rat mutants using a coat color-tagged Sleeping Beautytransposon system".Mamm Genome 18(5):338；Luo,G.et al.,1998:"Chromosomal transposition of a Tc1/mariner-like element in mouse embryonicstem cells".Proc Natl Acad Sci U S A 95(18):10769；Horie,K.et al.,2003:"Characterization of Sleeping Beauty transposition and its application to geneticscreening in mice".Mol Cell Biol 23(24):9189)。将期望的多核苷酸位点特异性靶向入DNA序列的转座子系统的进一步开发描述于例如WO2004/070042、WO 2004/069995和WO 2004/069994。

为了产生转基因斑马鱼，现有技术方法利用分离自青鳉系统的转座子Tol2(Kawakami K.(2007))。

优选地，通过同源重组或转座子介导的诱变将编码可以通过光激活的一种或多种蛋白的核酸序列插入受体非人脊椎动物的基因组。

可以将编码可以通过光激活的一种或多种蛋白的核酸序列插入受体非人脊椎动物的基因组，从而所述核酸序列在非人脊椎动物的基因组中存在的内源调节序列的控制之下。或者，可以将编码可以通过光激活的一种或多种蛋白的核酸序列连同确保它们表达所需的调节序列插入非人脊椎动物的基因组。优选地，将编码可以通过光激活的一种或多种蛋白的核酸序列可操作地连接至允许在脊椎动物细胞中表达的表达控制序列。这类调节序列是本领域技术人员公知的，并且包括但不限于确保转录起始的调节序列、内部核糖体进入位点(IRES)(Owens,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(2001),1471-1476)、病毒2A肽(Tang et al.J Neurosci.(2009)29(27):8621-9)以及任选存在的确保转录终止和转录物稳定的调节元件。确保转录起始的转录元件的非限制性实例包括翻译起始密码子，增强子如SV40-增强子，绝缘子和/或启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40-启动子、RSV-启动子(劳斯肉瘤病毒)、lacZ启动子、gai10启动子、人延伸因子1α-启动子、CMV增强子、CaM-激酶启动子或苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)多面体启动子。按照本发明特别优选的启动子序列包括在下丘脑-垂体-肾上腺轴细胞中表达的基因的启动子，例如参与编码应激控制激素的基因的表达的启动子，如促肾上腺皮质激素释放因子(CRH)、精氨酸加压素(AVP)、下丘泌素(Hcrt)等的启动子；在主要应激控制区下丘脑的室旁核中表达的转录因子的启动子，例如orthopedia(Otp)、single-mined 1(Sim1)、Nkx2、Fezf2等；在垂体促肾上腺皮质激素细胞中特异性表达的基因的启动子(参见例如Liu et al.Mol Endocrinol.2003May；17(5):959-66)；参与类固醇生成并在肾上腺中特异性表达的基因的启动子，包括类固醇生成因子1(SF1)、细胞色素p450侧链切割(P450scc)、类固醇生成急性调节蛋白(StAR)和3β-羟基类固醇脱氢酶(3b-HSD)；以及例如也称作MC2R的ACTH受体的启动子。确保转录终止的调节元件的非限制性实例包括V40-poly-A位点、tk-poly-A位点或SV40、lacZ或AcMNPV多面体多腺苷酸化信号，其包括在编码可以通过光激活的一种或多种蛋白的核酸序列的下游。额外的调节元件可以包括翻译增强子，编码分泌信号的核苷酸序列，或者根据所用的表达系统，能够指导表达的多肽至细胞室的信号序列。所有上述序列是本领域公知的。

此外，可以将编码可以通过光激活的一种或多种蛋白的核酸序列连同选择标记插入非人脊椎动物的基因组。选择标记的实例包括提供对新霉素、氨苄西林、潮霉素等的抗性的标记，并且是本领域公知的。

编码可以通过光激活的一种或多种蛋白的核酸序列可以包含在能够指导所述核酸序列的复制和表达的表达载体中。包含上述调节元件的合适的表达载体是本领域已知的，例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)、pSPORT1(GIBCOBRL)、Gateway质粒(Invitrogen)或pGEMHE(Promega)。为了在斑马鱼中转基因，核酸序列可以例如利用Tol2试剂盒中的载体如本领域所述进行表达，例如Kwan et al.(Dev Dyn.2007 Nov；236(11):3088-99)。

用于产生遗传修饰的非人脊椎动物的核酸序列可以设计用于直接引入，例如注射，或者通过电穿孔(利用例如Multiporator(Eppendorf)或Genepulser(BioRad))、PEI(Polysciences Inc.Warrington,Eppelheim)、Ca²⁺介导的转染或通过脂质体(例如："Lipofectamine"(Invitrogen))、非脂质体化合物(例如："Fugene"(Roche))、脂质体、噬菌体载体或病毒载体(例如腺病毒、反转录病毒、慢病毒)引入细胞。此外，还可以使用杆状病毒系统或者基于痘苗病毒或Semliki Forest病毒的系统。

按照本发明，核酸序列包括DNA，如cDNA或者包括外显子和内含子序列的基因组DNA，以及RNA，优选mRNA。优选地，编码可以通过光激活的一种或多种蛋白的核酸序列为cDNA。

在本文中可交换地称作可光激活的蛋白或光激活蛋白的可以通过光激活的蛋白是通过暴露于光来激活其功能的蛋白。光激活蛋白的非限制性实例包括微生物视蛋白、光门控通道和光激活腺苷酸环化酶。

诸如channelrhodopsin和盐细菌视紫红质的微生物视蛋白已成功地用于幼体斑马鱼以触发逃避反应(Douglass et al.,2008)，控制心功能(Arrenberget al.,2010)，鉴定不同组的控制游泳的神经元(Arrenberg et al.,2009)，以及负责眼运动的神经元的靶向操作(Schoonheim et al.,2010)。Channelrhodopsin和盐细菌视紫红质为光门控离子通道，其在光激活时允许神经元去极化/超极化，分别在480nm和570nm处具有最大吸收。

已报道在脊髓神经元中表达的光门控通道(LiGluR)诱导尾跳动(Wyartet al.,2009)。LiGluR是基因编码的谷氨酸通道，其以可光调节方式打开，当分别在500nm和380nm处的可逆光致异构化是打开和关闭。

与膜电压调节物一起，还已报道另一类光激活蛋白，其调节广泛存在的第二信使分子环腺苷酸(cAMP)。在单细胞鞭毛虫小眼虫(Euglena gracilis)中光激活腺苷酸环化酶(PACα)对于光回避非常重要。这种酶包含BLUF型光受体结构域(使用黄素腺嘌呤二核苷酸的蓝光传感器)，使得其对蓝光敏感(Iseki et al.2002)。光激活之后，在HEK293细胞中PACα亚基的表达提高cAMP水平。此外，据显示光诱导的cAMP增加足以触发细胞内途径。这在非洲爪蟾卵母细胞中通过Cl^--通道引起的光诱导的血浆膜电导增加证实，Cl^--通道依赖于PKA(cAMP依赖性蛋白激酶A)激活(Schroder-Lang et al.,2007)。已报道PACα在果蝇(Drosophila)中调节多动、严寒和梳毛(Schroder-Lang et al.,2007)，以及在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)调节运动行为(Weissenberger et al.,2011)。此外，最近已报道具有较低黑暗活性、较高光活性和比PACα小的来自细菌贝氏硫细菌(Beggiatoa)的新PAC(bPAC)，并且成功用于大肠杆菌(E.coli)、非洲爪蟾卵母细胞和果蝇(Stierl etal.,2011)。bPAC在450nm的波长下可激活。

暴露于光以激活所述蛋白可以通过本领域公知的方式来完成。例如，由于它们身体的大小和透明性，可以将幼体斑马鱼或青鳉简单地暴露于光，优选在如上文所示的各波长下，以便激活光激活蛋白。或者，当采用较大且不透明的动物如小鼠或大鼠时，可以通过本领域公知的方法在表达光激活蛋白的细胞附近植入光纤，例如Wang et al.2011或Anikeeva et al.2011。

按照本发明，下丘脑-垂体-肾上腺轴的细胞包括下丘脑的室旁核(PVN)中的神经内分泌细胞、垂体前叶中的促肾上腺皮质激素细胞和肾上腺皮质中的类固醇生成细胞。

如下文详细描述的，可以通过光激活的蛋白能够诱导特定激素和糖皮质激素的释放。在这个上下文中，诱导释放包括诱导从细胞释放现有激素和/或糖皮质激素以及诱导表达或形成并释放所述新形成的激素和/或糖皮质激。换句话说，光激活蛋白可以诱导释放或者可以诱导生物合成并随后释放所述激素和/或糖皮质激素。

按照本发明，光激活蛋白诱导(i)从下丘脑前区的室旁核中的神经元释放促皮质素释放激素(CRH)和/或精氨酸-加压素(AVP)；和/或(ii)从垂体前叶中的促肾上腺皮质激素细胞释放促肾上腺皮质激素(ACTH)；和/或(iii)从肾上腺皮质中的细胞释放糖皮质激素。关于从下丘脑前区的室旁核中的神经元释放CRH和/或AVP，释放这两种激素之一足以介导应激应答，但是按照本发明，还考虑并优选诱导这两种激素的释放。可以从肾上腺皮质的细胞释放的糖皮质激素包括例如人和鱼中的皮质醇以及啮齿动物中的皮质酮。

技术人员知道怎样选择合适的光激活蛋白以成功地诱导各激素或糖皮质激素的释放。例如，并且如下文所附实施例所示，利用编码ACTH前体的pomc基因的启动子可以在垂体细胞中特异性地表达光激活腺苷酸环化酶(PAC)如贝氏硫细菌光激活腺苷酸环化酶(bPAC)。这种方法确保在表达PAC的垂体细胞中产生cAMP，反过来这对于这些垂体细胞中的CRH受体信号转导非常重要，最终导致动物模型中皮质醇水平的升高。更详细地，促肾上腺皮质激素细胞中cAMP的增加导致Ca²⁺的内流和伴随的Ca²⁺介导的ACTH释放。cAMP信号对于许多激素释放过程很重要，因此PAC还可以下丘脑神经内分泌细胞中表达以增加CRH/AVP释放。

按照本发明，已开发精确和非侵入性的应激应答的检测和控制模型。所述模型需要利用细胞类型特异性启动子特异性地在应激激素生成神经元中表达光激活蛋白如通道和酶，以便诱导应激应答。因此，实现自由活动的个体中特定神经元群体的光控制。

在脊椎动物中，应激应答是通过下丘脑中高度保守的神经内分泌细胞的激活来调节的，产生应激激素如促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)(Charmandari et al.(2005))。一旦产生，CRH激活垂体促肾上腺皮质激素细胞以通过G-蛋白偶联受体和随后的cAMP介导的信号释放促肾上腺皮质激素(ACTH)(Arzt and Holsboer(2006))。

作为原理的证据，在本文中斑马鱼用作模型系统，并且产生转基因系，其利用编码ACTH前体的pomc基因的启动子在垂体细胞中特异性地表达光门控腺苷酸环化酶(PAC)。在这种动物中，当蓝光照明时，获得应激激素皮质醇水平的剂量依赖性升高。此外，利用光，可以控制并研究斑马鱼幼体的应激行为。因此本申请提供一种新的动物模型用于(1)研究应激行为，例如慢性应激；(2)筛选应激应答的新调节物，(3)在发育期间操作应激水平以获得早期生活应激动物模型，(4)在动物模型中急性和慢性地控制应激行为，以及(5)测试靶向应激应答系统的药物。

总的来说，这个系统允许在脊椎动物中直接、非侵入性、定量和精确地检测和操作应激应答。

在本发明的方法的一优选实施方案中，可以通过光激活的蛋白选自光激活腺苷酸环化酶(PAC)、channelrhodopsin 1和channelrhodopsin 2。

光激活腺苷酸环化酶及其氨基酸序列以及编码所述蛋白的核酸序列已描述于例如Stierl et al.2011。而且本领域已描述channelrhodopsin 1和channelrhodopsin 2，例如Nagel et al.2002。

在本发明的方法的另一优选实施方案中，非人脊椎动物为鱼。

最近几十年，鱼已成为有希望的生物医学研究的脊椎动物模式生物。它们可以在实验室中容易地操作，并且具有快速的世代时间和大的生殖群。因此，它们为这类相互作用的分析提供优秀的模型，特别是因为它们的HPI-轴与人中的HPA轴同源。

目前本领域中采用的在较大的动物模型如啮齿动物中分析应激应答所需的内分泌学测量通常是劳动密集型的，并且在不同实验室之间常常是未标准化的。因此，使用较小的脊椎动物模型如鱼提供一套读出和精确的操作方案，其以多孔形式容易放大用于高通量筛选和分析。

在一甚至更优选的实施方案中，鱼选自斑马鱼和青鳉。

斑马鱼(Danio rerio)是在印度和周边国家稻田附近的河流和小溪中天然发现的淡水硬骨鱼(Engeszer et al.,2007)。斑马鱼的一个特别优点是它们的应激应答系统与哺乳动物研究模型享有基础相似性(Wendelaar Bonga,1997,Alsop and Vijayan,2009)。在孵化时，幼体斑马鱼发育功能HPI-轴，并且在第4天时，它们整个身体的皮质醇水平对应激物应答而快速升高(Toet al.,2007,Alsop and Vijayan,2008,Alderman and Bernier,2009)。机械感觉刺激和各种化学物和污染物可以用作应激物，并且可以容易地施用于斑马鱼的水环境。此外，因为斑马鱼是变温和狭盐性的，温度和盐度改变也可以用作适合应激应答功能分析的不同应激物。

斑马鱼的卵生发育具有重要性，其幼体小且透明的身体以及可用的选择性靶向细胞应激途径和非侵入性脑成像的大量工具以及神经回路的光遗传学探测为研究应激轴的发育和完全功能应激应答提供了极好的机会。

与斑马鱼相似，青鳉作为小脊椎动物模型也提供优势，其具有完全测序的基因组以及适合光操作的半透明幼体。

本发明进一步涉及通过本发明的方法获得的应激动物模型。

此外，本发明还涉及按照本发明的动物模型在筛选用于预防、改善或治疗应激和/或应激相关疾病的化合物中的用途。

基本上按照本发明可以测定任何化合物预防、改善或治疗应激和/或应激相关疾病的潜力。这类化合物包括例如小分子，如有机或无机分子。有机分子涉及或属于具有碳基础的一类化合物，碳原子通过碳-碳键连接在一起，包括生物实体如蛋白、糖、核酸、脂质。术语有机的原始定义涉及化合物的来源，有机化合物是获得自植物或动物或微生物来源的那些含碳化合物。有机化合物可以是天然或合成的。小有机分子优选具有约500Da或以下的分子量。无机化合物源自矿物来源，并且包括没有碳原子的所有化合物(除了二氧化碳、一氧化碳和碳酸盐)。有许多这类化合物的供应商，包括例如Sigma(St.Louis,Mo.)、Aldrich(St.Louis,Mo.)、Sigma-Aldrich(St.Louis,Mo.)、Fluka Chemika-Biochemica Analytika(Buchs,Switzerland)。此外，待分析的化合物可以通过本领域已知的方法合成。受试化合物可以包含在不同或结构相似化合物的化合物文库(例如组合化学合成文库)中，并且可以同时测定文库中的许多受试化合物。任选地，可以将源自不同文库的受试化合物汇集用于同时评价。文库可以包含分子的随机集合。或者，文库可以包含偏向特定序列、结构或构象的分子集合。制备包含各种类型分子的不同群体的文库的方法是本领域已知的(Brenk,R.et al.,Lessons Learntfrom Assembling Screening Libraries for Drug Discovery for NeglectedDiseases,ChemMedChem 2008,3,435–444,Quinn J.R.et al.,Developing aDrug-like Natural Product Library,J.Nat.Prod.2008,71,464–468)。许多文库也是可商购的。

筛选它们预防、改善或治疗应激和/或应激相关疾病的潜力的优选化合物包括但不限于抗抑郁药，例如氟西汀，这是由于应激和抑郁之间的密切联系(Holsboer and Ising 2010；Holsboer et al.1984)，或者镇静剂，如地西泮。

按照本发明，术语“应激相关疾病”涉及个体内作为急性或慢性应激的结果发展的疾病状况。这类应激相关疾病的非限制性实例为心脏病、慢性疲劳、焦虑发作、情绪波动、心理困扰、抑郁、睡眠问题、高血压、饮食失调、消化性溃疡、免疫功能低下、慢性疼痛、感冒、流感、病毒感染、酗酒、头痛和偏头痛。

本发明进一步涉及一种筛选用于预防、改善和/或治疗应激和/或应激相关疾病的化合物的方法，所述方法包括(a)向本发明的动物模型给药受试化合物；(b)在步骤(a)之前、与步骤(a)同时或在步骤(a)之后在所述动物模型中诱导应激；以及(c)分析步骤(b)中诱导的应激应答，其中与受试化合物不存在下观察到的应激应答相比，在受试化合物存在下于(c)中观察到的减少的应激应答指示化合物适合作为预防、改善和/或治疗应激和/或应激相关疾病的化合物。

本文关于制备诱导型应激动物模型的方法和这样的动物模型的用途提供的所有定义和优选实施方案经适当修改后也应用于本发明的这种筛选方法。

按照本发明的这种方法，在第一步中向本发明的动物模型给药待测试的化合物。给药受试化合物的方法是本领域公知的，包括例如肠胃外、直肠、口服、脑池内、静脉内、腹腔内、皮下、肌肉内、皮内、体表(例如作为散剂、软膏剂、滴剂或透皮贴剂)、鼻内、口腔、鼻部或支气管内给药。此外，可以将化合物给药入动物模型周围的环境，例如在鱼的情况下给药入水，或者在其他脊椎动物如实验室啮齿动物如小鼠或大鼠的情况下给药入空气。

在步骤(a)中给药受试化合物之前，与步骤(a)中给药受试化合物同时和/或在步骤(a)中给药受试化合物之后在所述动物模型中诱导应激。在本发明的这种方法的一优选实施方案中，通过将所述动物暴露于光来诱导应激。更优选地，在本发明的动物模型中诱导应激是通过将动物模型暴露于特定波长的光刺激来完成的。应激诱导的变化可以通过改变施用的光刺激来实现，例如使用多个重复的光刺激或单一的长时间光暴露等。

诱导应激之后，分析因此在动物中诱导的应激应答。这样的分析涵盖行为测试，例如尾部悬吊、水迷宫、旷场、光/暗盒选择、高架十字迷宫等，全部是本领域公知的，并且描述于例如Prut and Belzung(2003)或Belzungand Griebel(2001)，或者下文和所附实施例中描述的任何测试。

然后可以将受试化合物存在下观察到的应激应答与受试化合物不存在下观察到的应激应答进行比较。在与受试化合物不存在下观察到的应激应答相比，在受试化合物存在下观察到减少的应激应答的那些情况下，所述化合物适合作为预防、改善和/或治疗应激和/或应激相关疾病的化合物，或者作为开发预防、改善和/或治疗应激和/或应激相关疾病的化合物的先导化合物。

在本发明的方法、动物或用途的一优选实施方案中，所述应激为慢性应激。

按照本发明，慢性应激通过应激行为的长期改变和改变的应激激素水平来定义。慢性应激导致HPA轴的特征性失调并增加包括抑郁在内的各种疾病的易损性(参见例如Chrousos and Gold(1992))。慢性升高的糖皮质激素水平和升高的中心CRH水平涉及抑郁相关的HPA高活性(Holsboer 1999；Holsboer and Barden 1996；Raadsheer et al.1994)，因此，在蛋白或DNA水平这些激素水平的持续升高可以用作慢性应激的指示。

在核酸水平确定这些激素的表达的方法包括但不限于RNA印迹、PCR、qPCR、RT-PCR或实时RT-PCR。在氨基酸水平确定这些激素的表达的方法包括但不限于ELISA、蛋白印迹或者聚丙烯酰胺凝胶电泳结合蛋白染色技术如考马斯亮蓝或银染。在蛋白定量中使用的还有Agilent Bioanalyzer技术。这样的方法是本领域公知的。

此外，本发明涉及一种在鱼中分析应激行为的方法，所述方法包括(i)将鱼置于游泳室中并将所述鱼暴露于刺激；以及(ii)在应激物的存在或不存在下分析所述鱼的刺激依赖性行为；其中与应激物不存在下在(ii)中观察到的行为相比，在应激物存在下于(ii)中观察到的行为改变是应激的指示。

虽然按照本发明的方法参考“鱼”，但是在本文中还设想使用许多鱼，因此，术语“鱼”涵盖使用许多鱼。此外，如本文所用，术语“鱼”涉及幼体(即幼年，非成体)鱼以及成体鱼。优选地，所述鱼为幼体鱼。

游泳室可以是本领域通常采用的任何游泳室，如单隔室或多隔室游泳室。应当理解当使用多隔室游泳室时，所述隔室是互相连通的。

然后将鱼暴露于刺激，所述刺激可以是所关注的任何刺激，如下文描述的优选刺激。监测暴露于刺激之后鱼的行为(即“刺激依赖性行为”，在本文中也称作“对刺激应答的行为”)并与其在应激物存在下的行为进行比较。与暴露于应激物之前对刺激应答的行为相比，暴露于应激物之后对刺激应答的改变的行为，例如运动(例如单位时间内移动的距离(运动水平))、空间利用(例如在室的某些隔室或部分中花费的时间比例)、摄食动机等的改变是应激的指示。因此，特定刺激依赖性行为的改变用作输出以评价特定应激物对鱼的影响。这种应激应答可以关于刺激定量。

应激物可以是所关注的任何应激物，例如渗透改变、机械感觉波动或者按照本发明的动物模型的光激活的应激诱导。

如本文所用，术语“监测”指利用某种监测仪或测量装置或者通过简单观察和研究者记录，对鱼的行为的可以随时间发生的变化的任何种类的观察。例如，摄像机可以用来记录鱼的行为，并且合适的分析软件可以用来确定各行为特征，如路程、使用的空间等。

按照本发明，提供鱼中的新行为测定作为正常和改变的应激应答检测的读出。为了检测行为的应激依赖性改变，开发了几种新的行为测定，包括测量1)对温度变化的反应性，2)对光照变化的反应性，3)对周围培养基的细微机械波动的反应性，以及4)摄食动机。

按照本发明，利用定义的外部刺激的输入-输出关系和相应的行为输出用作应激的主要读出。应激以多种方式影响行为，范围从运动的立即改变至觉醒、摄食、学习和记忆的改变。特别地，其可以修改生物体的控制特性以改变(增加或减少)其对外部刺激的反应性以有效避免威胁。虽然视觉指导的行为已在斑马鱼中良好表征，但是其他行为范例是欠缺的。因此按照本发明表征了幼体斑马鱼对两种独立的感官刺激，即机械和温度刺激的应答。据发明人所知，这些行为尚未在文献中描述，并且代表可以精确定量和控制的新行为范例。此外，到目前为止不知道幼体斑马鱼对光刺激的反应性代表应激行为，这是按照本发明的另一新发现。因此，对光刺激的应答构成另一应激行为，其可以通过HPA轴的光遗传学操作增强。

因此，在分析鱼中的应激行为的这种方法的一优选实施方案中，刺激选自温度变化、光照变化或机械感觉刺激。

如下文实施例2所示，温度变化、细微的机械感觉刺激以及光照变化用作对幼体斑马鱼的外部刺激的来源。鱼对所述刺激的反应用作应激反应性的度量。

在本发明的这种方法的另一优选实施方案中，所述刺激为食物。因此，在一更优选的实施方案中，分析鱼的行为的步骤包括确定鱼的摄食动机，其中通过(a)将鱼置于游泳室中；以及(b)添加食物之后分析鱼的运动来分析摄食动机；其中游泳室内朝向包含食物的隔室的差别空间使用是所述鱼的摄食动机的指示。

按照本发明的这个实施方案，鱼的摄食动机用作鱼经历的应激水平的读出。如本文所用，术语“摄食动机”涉及鱼获得并摄取食物的驱动力。为此，将鱼置于游泳室中，并且监测其运动，即所述游泳室内可用空间的空间使用(在室的某些隔室或部分中花费的时间比例)，以及单位时间移动的距离(运动水平)。通过监测在食物不存在下以及在食物存在下鱼的运动，可以进行比较。在包含食物的那些室部分中花费的时间的变化和/或添加食物时的运动水平代表鱼的摄食行为的可定量的度量。

如上文详述的，游泳室可以是本领域通常采用的任何游泳室。当游泳室仅包含单隔室时，在特定位置进行食物的添加，例如在室的一角内，以便产生包含食物的区域，而游泳室的其他区域保持没有食物或基本上没有食物。在游泳室包含多个隔室的那些情况下，这样进行食物的添加，从而至少一个隔室包含室温，并且至少一个隔室没有或基本上没有食物。优选地，游泳室包含至少两个互相连通的隔室。采用具有互相连通的几个隔室的游泳室提供以下优点，在一个隔室中进行的改变，例如食物的添加或环境(温度、渗透压等)的变化可以与其他隔室分开。尽管如此，因为隔室是互相连通的，所有鱼自由使用整个可用的空间。此外，使用不同隔室允许容易且正确定量一个隔室相对于其他隔室的％一侧偏好(side bias)，这在单隔室中是不可能的。

术语“基本上没有食物”指其中例如由于从包含食物的区域扩散，仅存在微量食物的环境。优选地，与包含食物的区域相比，基本上没有食物的区域或隔室包含少于10％的食物，例如少于5％、少于4％、少于3％、少于2％且更优选少于1％。甚至更优选地，与包含食物的区域相比，基本上没有食物的区域或隔室包含少于0.5％的食物，并且最优选地，少于0.1％的食物。

按照本发明使用的合适的食物是本领域公知的，并且包括但不限于草履虫、卤虫、氨基酸或干薄片。

按照本发明，摄食动机可以用来分析鱼对应激物的应激应答。因此，按照本发明分析鱼中的应激行为的方法可以这样进行：(i)将鱼置于游泳室中并将鱼暴露于应激物；以及(ii)暴露于应激物之后分析鱼的摄食动机；其中与暴露于应激物之前的摄食动机相比，暴露于应激物之后改变的摄食动机是应激的指示。

如所附实施例所示，已开发行为测定，特别设计以估计对鱼饲料的动机，并且测量应激物对摄食动机的影响。因此，令人惊讶地观察到应激暴露之后摄食动机的可逆性损害，表明摄食动机的分析是确定鱼中的应激应答的合适输出。

在分析鱼中的应激行为的方法的一可选实施方案中，所述方法为主动回避测试。

主动回避是本领域公知的，指动物主动从刺激转变方向，从而逃离其影响的动物行为。非限制性实例包括如下文实施例2所示，测量动物远离升高的温度源，以及远离光照的突然变化或机械波动。主动回避监测为当暴露于刺激时，自由运动的动物，这里为鱼的空间使用的变化。当施用刺激时减少的空间使用代表所述刺激的主动回避。

在分析鱼中的应激行为的方法的另一优选实施方案中，所述鱼选自斑马鱼和青鳉。

在分析鱼中的应激行为的方法的另一优选实施方案中，所述鱼是通过本发明的方法获得的应激动物模型。

如下文实施例2所示，光遗传修饰的幼体斑马鱼用于基于温度变化、机械感觉刺激或光照变化作为外部刺激源的应激行为测试。从这些数据可以得出结论，皮质醇水平的升高(通过bPAC阳性转基因幼体中bPAC活性的光诱导来诱导的)可以通过改变阈值应答水平来修改幼体斑马鱼对外部刺激的反应性。

关于本说明书中，特别是权利要求书中表征的实施方案，独立权利要求中提到的每个实施方案意图与所述独立权利要求根据的每个权利要求的每个实施方案(独立或从属的)组合。例如，在引用3可选项A、B和C的独立权利要求1，引用3可选项D、E和F的从属权利要求2以及根据权利要求1和2并引用3可选项G、H和I的权利要求3的情况下，除非另外特别提到，应当理解说明书明确地公开对应于组合A、D、G；A、D、H；A、D、I；A、E、G；A、E、H；A、E、I；A、F、G；A、F、H；A、F、I；B、D、G；B、D、H；B、D、I；B、E、G；B、E、H；B、E、I；B、F、G；B、F、H；B、F、I；C、D、G；C、D、H；C、D、I；C、E、G；C、E、H；C、E、I；C、F、G；C、F、H；C、F、I的实施方案。

相似地，而且在独立和/或从属权利要求不引用可选项的那些情况下，应当理解如果从属权利要求回引许多前面的权利要求，则认为由此覆盖的主题的任何组合都是明确公开的。例如，在独立权利要求1，回引权利要求1的从属权利要求2以及回引权利要求2和1的从属权利要求3的情况下，由此断定权利要求3和1的主题的组合清楚和明确地公开为权利要求3、2和1的组合。在存在指向权利要求1-3中任一项的另一从属权利要求4的情况下，由此断定权利要求4和1，权利要求4、2和1，权利要求4、3和1以及权利要求4、3、2和1的主题的组合清楚和明确地公开。

附图示出：

图1利用蓝光作为应激物修改应激轴的获得的光遗传方法。(a)幼体斑马鱼在黑暗中游泳表现出稳定的不连续运动率(分别显示为虚线和灰色背景的总平均值±S.E.M.)。(b)将适应黑暗的幼体暴露于蓝光引起运动减少，然后光偏移之后运动增加。(c)蓝光还导致升高的皮质醇水平(Mann-Whitney检验，p<0.01；括号中的样品大小)。(d)贝氏硫细菌光激活腺苷酸环化酶(bPAC)靶向表达至垂体促肾上腺皮质激素细胞，其通过细胞内cAMP信号产生并释放ACTH；CRHR，CRH-受体；AC，腺苷酸环化酶；PKA，蛋白激酶A；POMC，propiomelanocortin。(e)假设蓝光会导致bPAC-阳性幼体中HPI-轴激活和升高的皮质醇水平。(f)通过tdTomato荧光检测的受精后6天(dpf)的幼体的垂体中两个细胞团中bPAC表达的背部和侧面视图；放大的图示出ACTH和荧光tdTomato信号的共表达。(g)与它们的阴性兄弟姐妹(bPAC^-)相比，暴露于蓝光在bPAC-阳性幼体(bPAC⁺)中导致较高的皮质醇水平(双向ANOVA；光功率：F_(3,82)＝29.48，p<0.0001；基因型：F_(1,82)＝23.09，p<0.0001；光功率X基因型：F_(3,82)＝1.77，p＝0.16；Bonferroni事后检验，p<0.01；字母，p<0.05，以及星号，*p<0.05，**p<0.01，分别在组内和组之间命名差异；括号中的样品大小)。(h)暴露于2.8mW*cm^-2的蓝光180s之后bPAC⁺和bPAC^-幼体中作为时间函数的运动行为；插图示出随后的“曲线下面积”值(平均值±S.E.M.)(Mann-Whitney检验，p＝0.02；括号中的样品大小)。

图2光遗传增强的糖皮质激素水平提高刺激反应性。(a)提高流入小游泳室(右下箭头)的培养基的温度不仅提高室内的平均温度(较高的温度示出为增加的红色)，而且还提高分别靠近进口和出口的区域1(高温)和2(低温)之间的温差；作图的是示例性1s游泳途径，显示靠近区域1因为温度升高而增加的速度和快速转弯；白点指明幼体的起始位置。(b)作为时间函数的区域1和2中的平均温度(分别为黑色和浅红色线)。(c)作为时间函数的区域之间的温差；注意在温度升高(设置在0)之后60-90s发生快速增加。(d)温度升高之后60-90s bPAC⁺和bPAC^-幼体中的速度增加(Mann-Whitney检验，对于区域1和2中阳性对阴性幼体分别为p＝0.01和p＝0.40)。(e)bPAC⁺和bPAC^-幼体中的刺激反应性(Wilcoxon配对符号秩次检验，对于bPAC⁺幼体p＝0.0006；t检验，t₍₈₎＝1.11，对于bPAC^-幼体p＝0.30)。未暴露的bPAC⁺和bPAC^-幼体对温度变化反应没有不同-未示出。(f)幼体斑马鱼通过接近刺激源来对单一20ms长SMS单元应答；示出的是SMS之后的示例性1s游泳途径；白点和红线分别指明幼体的起始位置和源位置。(g)当SMS时至刺激源的平均位移。(h)示出至刺激源的距离的示例性踪迹(顶部)和作为时间函数的游泳速度(底部)；粉红背景显示重复的SMS(以1Hz施用120s)。(i)将幼体对SMS的应答分级，运动减少程度随刺激强度增加。(j)暴露于低强度蓝光仅在bPAC⁺幼体中增加对SMS的反应性，而较高的光强在两组幼体中均增加SMS反应性(双向ANOVA，光功率：F_(1,28)＝12.73，p＝0.0013；基因型：F_(1,28)＝6.28，p＝0.018；光功率X基因型：F_(1,28)＝0.28，p＝0.60；Bonferroni事后检验s，*p<0.05；暴露时间180s)；0对应于未暴露的幼体的平均应答强度(±S.E.M.，灰色)。(k)假设的蓝光暴露对幼体的应答阈值水平的影响。

图3光遗传诱导的糖皮质激素水平和运动行为的相关变化。(a)作为暴露时间和光强函数的bPAC⁺和bPAC^-幼体中的皮质醇水平(双向ANOVA，左，长度：F_(1,40)＝33.85，p<0.0001；基因型：F_(1,40)＝19.56，p<0.0001；长度X基因型：F_(1,40)＝0.47，p＝0.50；右，长度：F_(1,40)＝10.85，p＝0.002；基因型：F_(1,40)＝20.37，p<0.0001；长度X基因型：F_(1,40)＝1.13，p＝0.29；Bonferroni事后检验，p<0.05或<0.001；分别显示为虚线和灰色背景的平均值±S.E.M.基础水平)。(b)暴露于1或2.8mW*cm^-2的蓝光期间bPAC⁺和bPAC^-幼体中作为时间函数的运动行为。(c)蓝光暴露期间的平均运动行为(对于bPAC⁺ _1mW*cm ^-2vs bPAC^- _1mW*cm ^-2，t₍₇₉₎＝3.02，**p＝0.003；对于bPAC⁺ _2.8 _mW*cm ^-2vs bPAC^- _2.8mW*cm ^-2，t₍₆₁₎＝2.10，*p＝0.04；对于bPAC^- _1mW*cm ^-2vs bPAC^- _2.8 _mW*cm ^-2，t₍₇₀₎＝4.19，***p<0.0001；对于bPAC⁺ _1mW*cm ^-2vs bPAC⁺ _2.8mW*cm ^-2，t₍₇₀₎＝0.97，p＝0.33，t检验)。(d)重复的蓝光暴露(试验间隔：27min)在bPAC^-中削弱刺激依赖性皮质醇增加，但是在bPAC⁺幼体中不会(双向ANOVA，重复暴露：F_(2,50)＝12.44，p<0.0001；基因型：F_(1,50)＝18.55，p<0.0001；重复暴露X基因型：F_(2,50)＝0.13，p＝0.88；光强：2.8mW*cm^-2)；注意bPAC⁺而不是bPAC^-幼体对重复暴露应答，具有增加的皮质醇(分别为Wilcoxon符号秩次检验和一个样品t检验，*p<0.05，**p<0.01或***p<0.001)。(e)重复蓝光暴露中的运动行为；蓝条和黑色箭头分别指示光暴露和皮质醇提取的时间；光偏移之后数十分钟两组幼体的平均运动行为不同(在10-min.时间中测量)(未示出)(双向ANOVA，重复暴露：F_(2,306)＝3.0，p＝0.0513；基因型：F_(1,306)＝8.26，p＝0.0043；重复暴露X基因型：F_(2,306)＝0.19，p＝0.83)。(f)对皮质醇水平作图的运动行为；注意光偏移之后数十分钟，运动表现出过去的峰值皮质醇水平的线性依赖性；

图4：bPAC阳性幼体中全身cAMP水平的蓝光依赖性升高以及myc-标签和tdTomato信号的共定位。(a)将bPAC mRNA注射入单细胞阶段胚胎之后受精后1天(dpf)胚胎中全身cAMP水平的蓝光依赖性升高(Mann-Whitney检验，对于未刺激的对照对bPAC注射的，p＝0.19；对于光刺激的对照对bPAC注射的，*p＝0.02)。(b)6dpf bPAC阳性幼体的垂体的示出myc-标签和tdTomato信号的共定位的背部共聚焦图像。

图5：暴露于黄光刺激的野生型幼体中的行为和内分泌特征谱。(a)将适应黑暗的野生型幼体暴露于黄光引起运动的快速减少，然后在光偏移之后运动增加，与蓝光暴露引起的运动特征谱相似。(b)在适应黑暗的野生型幼体中，暴露于黄光180s提高皮质醇水平(Mann-Whitney检验，*p＝0.03)。

图6：在暴露于蓝光或黄光的bPAC+和bPAC-幼体中光诱导的糖皮质激素水平和运动行为的变化。(a)暴露于等强度的蓝光或黄光180s之后2min.，bPAC+和bPAC-幼体中的皮质醇水平(Mann-Whitney检验，对于蓝光刺激的bPAC-对bPAC+，**p＝0.002；对于黄光刺激的bPAC-对bPAC+，p＝0.46)。(b)等强度的蓝光或黄光偏移之后bPAC+和bPAC-幼体中的平均运动行为(在10min.时间中测量；相对于刺激前基线以％计)(Mann-Whitney检验，对于暴露于蓝光和黄光的bPAC阳性对阴性幼体分别为＝0.04和p＝0.70)。

图7：幼体斑马鱼对细微机械感觉刺激(SMS)的应答包括活性组分且不改变糖皮质激素水平。(a)仅在包含刺激源的一半室内记录幼体游泳时发生SMS；示例性踪迹示出至刺激源的距离(顶部)和游泳速度(底部)作为时间函数；粉色背景指示重复SMS(以1Hz施用120s)。(b)示出暴露于SMS的6dpf幼体相对于未暴露的幼体的皮质醇水平。

图8：蓝光刺激之后作为时间函数的皮质醇水平。暴露于2.8mW*cm-2的蓝光180s之后在不同时间测量的bPAC+和bPAC-幼体中的皮质醇水平(双向ANOVA，时间：F(2,42)＝28.43，***p<0.0001；基因型：F(1,42)＝23.09，p＝0.0153；时间X基因型：F(2,42)＝3.18，p＝0.06；成对比较的Bonferroni事后检验，p<0.01)。

图9：LED-阵列和游泳室。指向定制的游泳室的中心的LED阵列的透视图。

图10：暴露之后作为应激物强度和时间的函数的HPI-轴活性。(a)暴露于不同浓度的NaCl(渗透休克)10min导致相似的结果(来自6dpf AB/TL幼体的数据；括号中的样品大小)。(b)升高的皮质醇水平在应激物暴露之后短暂降低，暴露于100mM NaCl之后30min达到基础水平(来自6dpfAB/TL幼体的数据；括号中的样品大小)。(c-d)利用机械感觉输入作为应激物获得平行结果。皮质醇水平与强度一起升高(来自5dpf AB/TL幼体的数据；括号中的样品大小)，并且皮质醇在暴露于60％应激物强度之后短暂降低(来自6dpf AB/TL幼体的数据，括号中的样品大小)。星号指明相对于平均基础皮质醇水平的统计差异(±S.E.M.，分别为虚线以及之上和之下的灰色区域)(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，单样本t-检验和Wilcoxon符号秩次检验)。不同字母说明通过单向ANOVA，然后post-hoc比较确定的统计差异。

图11：应激物暴露可逆地损害摄食动机。(a)10min记录周期期间6dpfAB/TL幼体的示例性踪迹显示仅在食品的存在下可以检测到的一侧偏好(红色虚线圆)。(b)在4dpf不存在偏好，并且随着年龄显著增加(N_4dpf＝23；N_5dpf＝20；N_6dpf＝19)。(c)暴露于机械感觉输入在6dpf幼体中于暴露之后10min消除一侧偏好，同时其在暴露之后60min恢复(N＝23)。(d)渗透休克在6dpf AB/TL中导致相同结果；暴露之后10min减少一侧偏好(N＝6)，并且在暴露之后60min恢复一侧偏好，与未暴露的幼体不可区分(N＝11)。星号信号与0(无偏好)不同(*p<0.05。**p<0.01。***p<0.001。Wilcoxon符号秩次检验)。不同字母说明通过单向ANOVA，然后post-hoc比较确定的组内差异。

以下实施例说明本发明。

实施例1：方法

转基因斑马鱼的产生

将编码来自贝氏硫细菌的光激活腺苷酸环化酶的cDNA(bPAC；(Stierlet al.,2011))用突变的终止密码子PCR-扩增并克隆入载体，所述载体在pBR322骨架中包含病毒2A序列(Tang et al.,2009)，以及两侧为I-SceI和Tol2转座子识别位点的tdTomato。将这个构建体与PCR-扩增自Pomc-GFP构建体的Pomc启动子组合(Liu et al.,2003)。将Pomc:bPAC-2A-tdTomato质粒在水中稀释并与100ng的Tol2转座酶RNA温育10min以获得较高效率的转基因(Kawakami,2004)。在0.05％酚红的存在下将质粒和RNA混合物注射入单细胞阶段野生型胚胎(AB和TL品系的交叉)。用垂体中的特异性tdTomato表达选择一个创立者，并且对于进一步增殖没有异位表达。

斑马鱼饲养

在标准条件下进行斑马鱼(Danio rerio)繁殖和维持(Westerfield,2000)。在早晨收集胚胎并升高至28.5℃，以6个卵ml^-1的密度在E2培养基中，12:12小时光照:黑暗(LD)周期。将Rx3突变体杂交并通过形态学外观(较强的色素沉着，缺少眼睛)选择纯和突变体。将PAC转基因鱼与野生型(AB/TL)异型杂交，并且利用荧光解剖镜选择4和5dpf之间垂体中的荧光tdTomato表达。为了避免实验之前PAC的非特异性激活，将转基因胚胎饲养于用550nm长通滤波器(Thorlabs)覆盖的定制反光容器中(图4c)。除非另有说明，在行为测定中进行比较的组通常在相同条件下饲养。

行为测试

利用野生型、bPAC-阳性和阴性6dpf幼体进行行为测试。在通过IR-LED阵列传送的红外(IR)光下，在置于无振动平台上的定制不透光外壳(Newport,Irvine,CA,USA)内进行实验。在所述外壳内利用定制的机械零件组装行为设置。为了以25帧s^-1成像各游泳幼体的移动，使用红外灵敏相机(ICD-49E B/W,Ikegami Tsushinki Co.,Ltd.Japan)，其镜头(TV Lens,Computar VARI FOCAL H3Z4512CS-IR,CBC(America),NY,USA)周围为定制的LED环灯，置于定制的游泳室(图9)或组织培养板(Greiner-Bio One,Germany)之上，这取决于实验(见下文)。IR-LED的阵列从下方照亮室或组织板。EthoVision XT软件(Noldus Information Technology,The Netherlands)用来追踪幼体的游泳路径。由玻璃制成的游泳室和Plexiglas具有10mm的内径和4个开口，并且具有400μL的体积。两个这样的开口(高：400μm，宽：2.5mm)为入口和出口通道，因为实验用室内循环的E2培养基(Westerfield(2000))进行(见下文)。剩余两个开口是对称地位于室每侧的直径400μm的圆柱形通道，它们最长的轴朝向相对于水平线30°的角；这些通道均在室的透明玻璃底部打开。这些圆柱形通道之一具有参考热电偶(npielectronics GmbH,Tamm,Germany)以不断监测室内的温度。第二通道具有用来传送细微的高度控制的机械感觉刺激的石英毛细管(见下文)。利用蠕动泵(IPC Ismatec(IDEX Health&Sciences GmbH,Glattbrugg,Germany)，在室内设置200μL*min.^-1流速的E2培养基(Westerfield(2000))。这个流速对幼体的运动的标称水平没有可检测的影响，并且允许利用温控系统(PTC 20,npi electronics GmbH,Tamm,Germany；Exos-2 V2液体冷却系统,Koolance,Auburn,USA)控制室内的平均温度(维持在28.0±0.5℃)。为了长期记录，组织培养板用来同时成像26-28℃下30个幼体的移动，每个置于40μL的E2培养基中，而剩余的实验利用上述游泳室进行。所有涉及转基因幼体的实验都是盲的，并且不同实验组整天互相混合。在匹配幼体白天的时间中进行测试。在所有实验中，给予幼体15分钟以在记录之前调整测试条件。

对温度变化的反应。温控系统允许快速且准确地修改流动培养基的温度，以便在小室内产生不对称的温度变化。通过以高度控制的可重复的方式快速提高流入培养基的温度(图2a)，目的是不仅提高室内的温度，而且还增加分别靠近入口和出口的区域1(高温)和2(低温)之间的温差(图2b,c)，以便最大化检测对给予小尺寸室的温度变化的反应的可能性。在幼体不存在下进行区域1和2中的温度测量(图2b)。初始调整至测试条件(见上文)之后，每段时间包括在恒定温度下240s的基线运动测量，然后在温度变化方案下300s的运动水平测量。首先速度的增加(以百分比计)计算为((Vel_90s–Vel_60s/Vel_60s)*100)，当区域(即1和2)之间的温差以最大速率增加时在30s时间中发生。为了估计刺激反应性，区域1和2中速度的相对差异计算为在温度升高发生之后0和180s测量的((Vel_区域1–Vel_区域2/Vel_区域 ₂)*100)。

饲养

将自由运动的幼体单独置于小的定制的由两个互相连通的隔室组成的游泳室中(见图10a)。然后，在白光照明下于20分钟的时间中记录它们的运动模式，首先在食品不存在下(开始10分钟)，然后在向室的隔室之一添加40μl草履虫之后(最后10分钟)。然后计算运动水平的度量(单位时间移动的距离)和空间使用(在室的任一隔室中花费的时间比例)并跨组进行比较。

细微机械感觉刺激(SMS)。在定制的室内用单个幼体游泳进行实验。将石英毛细管(直径：350μm)通过两个圆柱形通道(见上文)之一引入游泳室1mm。将毛细管固定至压电致动器(PL 140.10(Physik-Instrumente,Karlsruhe,Germany)，其转而连接至脉冲发生器(Universal Taktgenerator,EL V GmbH,Leer,Germany)。这允许横向移动毛细管，通过修改施用于压电致动器的电压来控制这类移动的持续时间和强度；这个电压称作给定持续实验的SMS的强度或刺激强度。在这里报道的实验中，单SMS单位由毛细管的10个横向移动组成，每个持续1ms并以1ms的试验间隔传递。当连续发生时，以1Hz的的频率传递SMS单位。使用两种类型的SMS方案。在第一个中，仅在记录幼体在包含毛细管的一半室内游泳时发生SMS。在第二种方案中，首先在120s中测量基线运动，然后如上文所述施用SMS 120s时间。为了定量幼体对SMS应答的强度，首先将每个幼体在最初120s SMS时间“之前”和“期间”每40ms游泳的距离作图，然后计算相应的“游泳距离对时间积分”。然后，为了估计SMS引起的运动下降的幅度，计算来自这样的积分(即之前和期间)的曲线下面积以及净面积差异。认为这个值的倒数是应答强度导数并称作“应答强度”。最后，图2j中示出的光诱导的应答增强定义为((‘应答强度_光刺激的-应答强度_未刺激的)/应答强度_未刺激的)*100)。

光刺激。将定制的相机镜头周围的LED环灯置于记录室之上(见上文)。LED的入射角允许游泳室(图4h)或组织板的均匀照明。为了控制LED，使用定制的驱动器、脉冲发生器和TTL控制盒(USB-IO盒(Noldus,Wageningen,The Netherlands)。在这里报道的实验中，将幼体暴露于不同强度的蓝光或黄光18s或180s。利用手持式光功率计(Newport,USA)测量光功率。每个光脉冲由以5Hz的频率传递的100ms闪光组成。

渗透休克

在28℃下于黑暗中将幼体暴露于不同浓度的NaCl溶液10min。为了随后的记录，将幼体在E2培养基中清洗并转移至记录室。将对照幼体以相同方式暴露于E2以排除操作的任何影响。在应激物暴露结束之后4-5min的时间窗口内开始记录。在探讨渗透应激的行为关系的实验中，将幼体暴露于50mM NaCl。

强机械感觉输入

为了向幼体施用强机械感觉刺激，使用多层弯曲致动器(PL140.10)，其具有0-60V的操作电压、(±1000μm)的标称位移和160Hz的空载谐振频率。将折弯机连接至脉冲发生器、将10V的输入信号增加为0-60V的输出信号的具有可调整的增加和10-转精密电位器的双压电放大器、以及允许计算机控制的TTL控制系统。将石英毛细管(PolymicroTechnologies,AZ)粘至折弯机，并且部分浸没(～2mm)地置于装有半满的E2培养基的35mm培养皿的中心。以不同强度和频率(3V 2Hz、4.5V 6Hz和6V 10Hz)施用6个单位的强机械感觉刺激。每个单位在前一个之后立即开始，并且在持续时间中包含99个脉冲每40ms，具有不同的i.t.i.。在RT下于正常光照下进行刺激。在探讨机械感觉应激的行为关系的每个实验中，使用分别为6V和10Hz的强度和频率。暴露之后，将幼体转移至记录室并保持平静10分钟，以便在记录时间开始之前调整至新环境。

皮质醇测量

将30只幼体(6dpf)的组刺激，在冰水中固定，在乙醇/无水中立即冷冻并储存在-20℃下。通过在150μL ddH2O中匀浆样品来提取皮质醇。之后，将1mL乙酸乙酯添加至匀浆的样品中，涡旋30s，并且在5000x g和4℃下离心5min。为了分离包含皮质醇的溶剂和水相，将样品放入-50℃乙醇/干冰中，仅允许水相冷冻并将包含皮质醇的溶剂倒入新管中。将乙酸乙酯在30℃下于speed-vac浓缩仪中蒸发30min，并且将皮质醇重新溶解于60μL样品-缓冲液中。将ELISA板(Immulon 2HB)用皮质醇小鼠抗体(EastCoastBio,Inc.)(1x PBS中4μg/mL)在4℃下于黑暗中包被过夜。然后，每次使用250μL洗涤缓冲液进行3个洗涤步骤之后，添加200μL封闭缓冲液，并且将制品在定轨振荡器上以40rpm于RT下温育30min以减少非特异性结合，然后洗涤。将50μL的每种样品连同标准品(氢化可的松，Sigma-Aldrich)移液至板中。将1x PBS中1:400最终稀释的50μL皮质醇-HRP(EastCoastBio,Inc.)添加至每个孔中，并且将制品在RT下温育2h。3个洗涤步骤之后，将100μL染色-溶液添加至每个孔中，并且在RT下温育30min。通过添加100μL终止-溶液(1M硫酸)来终止反应，并且将板短暂摇动，然后用酶标仪(Thermo Scientific Multiskan Ascent)测量在450nm处的吸收。将测量的标准品的光密度及其对应的皮质醇浓度在分对数-对数图中作图，并且从随后的线性回归线计算样品的皮质醇浓度。对结果修正稀释因子、提取效率和恢复功能。除非另有说明，在光或SMS偏移之后2分钟采集皮质醇样品(见下文)。

cAMP测量

利用mMessage mMachine T7Ultra试剂盒(Ambion)制备50pg加帽的bPAC RNA并将其注射入单细胞阶段的AB/TL胚胎。将胚胎保持在反光的光过滤容器中，并且利用下文描述的光方案(光强：2.8mW cm^-2)在受精后1天(dpf)接受蓝光。光偏移之后立即收集27个胚胎的组，并且立即在冰上于210μl 0.1M HCl中匀浆。在4℃下以12000x g离心30分钟之后，提取上清并储存在-20℃下。按照来自cAMP ELISA试剂盒(ADI-900-066,Enzo LifeSciences)的乙酰化方案测量cAMP水平。100μl的样品用于测定，并且将蓝光刺激的bPAC注射的样品稀释15倍以允许在标准范围内测量。通过将结合的样品的％插入标准曲线来计算结果。

免疫组织化学

将6dpf幼体在4℃下于磷酸缓冲盐水(PBS)中的4％多聚甲醛(PFA)中固定过夜。如以前所述(Ryu,S.et al.Curr Biol 17,873-880,(2007))利用抗人ACTH的多克隆抗体(National Hormone and Peptide Program,NationalInstitute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases；1:500)或抗Myc-Tag的兔多克隆抗体(Cell Signaling Technology；1:500)作为一抗以及Alexa488抗兔(Invitrogen；1:1000)作为二抗在4℃下于避光的振荡器(30-40rpm)上进行免疫组织化学过夜。将幼体在80％甘油中利用装有Nikon 20x甘油物镜的Leica SP5CLSM成像。利用Amira 5.4评价栈(stacks)以产生最大强度预测并评价跨通道的体素相关性。

统计分析

所有数据均显示为平均值和平均值的标准误差(S.E.M.)。为了比较，除非另有说明，运动行为表示为相对于刺激前基线水平的百分比，因为bPAC-阳性和阴性幼体之间基线水平没有不同(Mann-Whitney检验，p＝0.11)。学生t检验(双尾)用于两组比较，或者如果数据不满足t检验的假设，则使用Mann-Whitney U-检验。线性回归和ANOVA用于多组比较，然后Bonferroni’s post-hoc检验，或者它们的非参数等同物。利用MS-Excel(Microsoft,Redmond,WA,USA)、Matlab 2009b(MathWorks,Natick,MA,USA)、Prism 5,(Graphpad Software Inc.,San Diego,CA,USA)、Sigma Plot(Systat Software Inc.,San Jose,CA,USA)和Virtual Dub(Freeware)分析数据。

实施例2：幼体斑马鱼中内源性hypercortisolaemia的光遗传诱导

糖皮质激素(GC)是进化上保守的应激应答介质下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴的终产物。为了研究GC对应激依赖性行为改变的贡献，必须改变内源性GC水平而不同时改变上游内分泌途径。目前不存在特异性操作GC-水平的有效方法，因为注射外源性GC本身是应激性的，并且不提供跨时域分析GC效应所需的分辨率。

应激应答包括抗衡对稳态的威胁的一组生理和行为过程。其依赖于下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴，下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴的激活导致促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)和糖皮质激素(GC)的偶联释放(Charmandari et al.(2005))。ACTH的主要功能是刺激GC释放，而CRH和GC具有广泛分布的受体，并且涉及各种应激相关物(Lowry and Moore(2006)；McEwen and Sapolsky(1995)；Sandi andPinelo-Nava(2007))。GC-功能的机械分析是挑战性的，因为GC具有在不同时域(范围为毫秒至天)作用的多效性功能(Griffiths et al.(2012)；Charmandari et al.(2005))。为了理解特定GC-功能，必须改变GC-水平且具有相似水平的下丘脑激活，目前尚不存在特异性操作内源性GC-水平的有效方法。

因此，光遗传方法用来非侵入性且选择性地改变幼体斑马鱼中内源性皮质醇(硬骨鱼中的主要GC)的水平，斑马鱼的下丘脑-垂体-肾间(HPI)轴在发育中成熟早，并且与哺乳动物中的HPA-轴同源(Lowry and Moore(2006)；McEwen and Sapolsky(1995))。此外，GC和5-羟色胺信号的相互作用在斑马鱼中是保守的(Sandi and Pinelo-Nava(2007)；Sapolsky et al.(2000))。将HPI-轴的获得光遗传修饰以在暴露于其他方面相同的应激性事件的动物中获得不同的GC-水平，并且检测糖皮质激素水平、运动行为和刺激反应性的相关变化。

幼体斑马鱼对光刺激高度敏感(Burgess and Granato(2007))，并且对从黑暗至光明的急剧转变的反应为运动的抑制，然后在光偏移之后运动增加(MacPhail et al.(2009))。观察到幼体对蓝光照明相似地反应(图1a,b)，这导致光暴露之后不久皮质醇水平升高(图1c)。因此，为了差异性提高皮质醇水平而不影响CRH，将贝氏硫细菌可光激活的腺苷酸环化酶(bPAC)的表达(Stierl et al.(2011)；Ryu et al.(2010))靶向至可以产生ACTH的垂体促肾上腺皮质激素细胞(图1d,e)。

假设这些细胞中在CRH受体1(CRHR1)激活时cAMP的增加可以利用bPAC蓝光刺激模拟，从而增加ACTH和皮质醇释放。

首先，证实斑马鱼中利用bPAC mRNA的全身cAMP水平的蓝光依赖性升高(图4a)。

然后，利用阿黑皮素原(POMC)启动子的片段(Liu et al.(2003))，将偶联至tdTomato的bPAC特异性地靶向至垂体促肾上腺皮质激素细胞，限制于整个幼体中的两个细胞团(图1f)。如通过融合的myc-标签(图4b)检测的，荧光tdTomato信号与bPAC共定位，并且还与ACTH共定位(图1f)。bPAC-阳性和阴性幼体均对蓝光应答，具有增加的皮质醇，这与我们的观察一致，光本身作用为应激物。但是，阳性幼体表现出比阴性幼体高的皮质醇水平(图1g)。此外，虽然暴露于蓝光和黄光在野生型幼体中均导致相似的行为和内分泌特征谱(图1a-c和图5a,b)，但是黄光在bPAC-阳性幼体中不能增强皮质醇变化(图6a)，符合由于其BLUF(利用FAD的蓝光受体)类型光传感器结构域，bPAC被蓝光特异性地激活这一事实(Stierl et al.(2011))。因为GC调动能量并增强运动(Sandi et al.(1996))，所以然后分析是否这样的皮质醇差异增加具有可检测的运动相关物。观察到bPAC-阳性幼体在蓝光偏移之后表现出增强的运动(图1h)，但是在黄光偏移之后没有(图6b)。合在一起，这些结果显示这种方法可以通过相同的刺激方案产生不同水平的内源性皮质醇和应激物后运动行为，从而保持类似的下丘脑激活活性。

应激以多种方式影响行为，范围从运动的立即改变至觉醒、摄食、学习和记忆的改变。特别地，其可以修改生物体的控制特性以增加其对环境刺激的反应性(Pfaff et al.(2008))。因此，为了证实本方法，询问光遗传提高的皮质醇水平是否可以修改幼体斑马鱼对外部刺激的反应性。为了检验这个预测，测量个体幼体对高度控制的温度变化的反应(图2a-c)；温度用作外部输入源，因为幼体斑马鱼是严格放热的，并且它们的运动行为随温度变化而增加(Prober et al.(2008))。蓝光刺激之后不久，阳性而不是阴性幼体快速反应以通过增加它们的转弯(未示出)和游泳速度(图2d)来与升高的温度接触。这导致刺激反应性的显著组差异(图2e)。为了排除刺激特异性，然后表征迄今未报道的幼体斑马鱼对细微机械感觉刺激(SMS)的应答。然后，测量光诱导的应答增强。观察到幼体斑马鱼对SMS应答，接近刺激源，随后逐步减少它们不连续运动的速率(图2f-h)，这是分级(图2i)、主动和非应激性(图7a,b)的应答。低强度的蓝光暴露在阳性幼体中特异性地增强SMS反应性，而较高的光强度在两组中均大大增强反应性(图2j)，表明这个应答是对应激高度敏感的。总的来说，这些结果证实光遗传提高的皮质醇水平增强幼体斑马鱼中的刺激反应性，可能是通过改变应答阈值(图2k)。

已知GC介导快速应激反应(Moore and Orchinik(1994))，但是它们的效应却难以分析，因为注射外源性GC是应激性的，并且不提供足够的分辨率。为了检测快速GC效应是否可以在运动上检测，首先测试短暂的光刺激是否足以增加皮质醇。短暂暴露于仅持续几秒的低强度蓝光足以在阳性而不是阴性幼体中增加皮质醇，并且刺激越长，随后的皮质醇水平越高。相比之下，较高的光强在两组中均增加皮质醇，但是bPAC-阳性幼体表现出比阴性幼体高的水平；如前所述，刺激越长，皮质醇水平越高(图3a)。令发明人惊讶的是，bPAC-阳性和阴性幼体在蓝光暴露期间已不同移动，阳性幼体随着光强的增加表现出相对较低和较高的运动水平(图3b,c)。这些结果显示升高的皮质醇水平具有快速的可检测的活动性变化，并且这些变化可以具有不同标志，这取决于皮质醇变化率。

应激提高GC-水平，但是通过GC负反馈至下丘脑和垂体终止应激应答(Dallman et al.(1994)；Dallman,and Yates(1969))。如库欣综合征中，ACTH和GC过量引起的这类负反馈的损伤可以导致hypercortisolaemia状态，这是人中的主要健康风险(Wolkowitz et al.(2009))。库欣病样皮质醇增多症可以在斑马鱼中通过靶向促肾上腺皮质激素细胞肿瘤生长和激素分泌来模拟(Liu et al.(2011))，但是这种方法不允许hypercortisolaemia的时间控制。因此询问在垂体水平修改HPI-轴的获得是否可以导致hypercortisolaemia的形式。单一蓝光暴露之后20分钟，bPAC-阳性和阴性幼体具有显著降低的皮质醇水平，40分钟后其达到基础水平(图8)。形成鲜明对比的是，阳性而不是阴性幼体对重复的光暴露应答，具有增加的皮质醇(图3d)。然后检测这种形式的hypercortisolaemia怎样关系到幼体的运动行为，并且观察到bPAC-阳性幼体在光偏移之后数十分钟表现出增强的运动(图3e)。对来自几次暴露的皮质醇水平作图，所得的运动值可以通过线性回归近似计算(图3f，R-squared＝0.97)。这些数据证实，在重复暴露于蓝光的动物中，在垂体水平增加HPI-轴的获得导致hypercortisolaemia和偏离标称运动。

以前存在的不能以高时间分辨率改变内源性GC-水平使得难以确定GC在调节应激反应中的具体作用。在这个实施例中显示在幼体斑马鱼中可以光遗传修饰它们的HPI-轴的获得，改变内分泌和行为应激反应。斑马鱼具有许多遗传工具，并且幼体的半透明身体及其卵生发育使得其对于非侵入性脑成像和神经回路的光遗传研究是理想的。这个研究提出一种分析GC-功能的有前途的新方法，包括应激轴内的反馈和发育编程。

实施例3：幼体斑马鱼中对应激物的直接应答

凭经验地，应激物是这样的刺激，其导致垂体细胞释放ACTH，随后触发肾上腺皮质中的细胞释放糖皮质激素。在成年硬骨鱼中，温度、盐度、浊度、重金属和pH的变化提高糖皮质激素水平(Wendelaar Bonga,1997)。以前(未公开)的数据显示在幼体斑马鱼中各种应激物也提高全身皮质醇水平。周围培养基的机械感觉波动、渗透休克、温度变化、氨、硫酸铜(CuSO4)和乙醇全部导致相对于对照升高的皮质醇水平。

如图10中所示，在暴露于渗透休克的幼体斑马鱼中观察到应激物强度依赖性皮质醇增加(图10a)，并且在应激物暴露之后可以看到峰后皮质醇下降(图10b)。第二应激物，即机械感觉输入进一步用来精确控制应激物强度。这里，使用培养基的分级波动，其使用压电元件以产生精确振动，不同于以前采用的旋转。与渗透休克上的结果一致，皮质醇表现出与机械感觉输入的应激物强度的正相关(图10c；F(3,44)＝7.64,p<0.001)。还可以证实暴露之后皮质醇水平随时间衰减(图10d；F(2,14)＝20.19,p<0.001)。应激物暴露之后30min，在渗透休克和机械感觉输入这两种情况下，不可以区分峰后皮质醇水平与初始基础水平(具有灰色区域的虚线)。

实施例4：应激物暴露可逆地减少幼体的摄食动机

脊椎动物中公知的行为应激应答是食物摄取的减少(Carr,2002)。在斑马鱼发育中，在3dpf左右卵黄囊开始耗尽(Kimmel et al.,1995)，幼体需要开始主动摄食。因此，问题出现了，这种现象是否也可以在发育的斑马鱼中找到。为了解决这个问题，将幼体斑马鱼暴露于应激物，随后测试它们的摄食动机。

首先，需要开发摄食动机的度量。这通过间接评价摄食动机为两隔室游泳室中的差异空间使用来实现，其中仅在一个隔室中提供食物(图10a)。在4dpf不可以检测到偏好，而在5和6dpf，朝向食品的侧偏是显著的。总体摄食动机随年龄显著增加(图10b；ANOVA F(2,61)＝8.50,p<0.001)。

为了测试应激物暴露的效应，将6dpf幼体用以前发现提高皮质醇水平的机械感觉输入处理(见实施例3)。处理完全破坏侧偏好，表明摄食动机的减少(图11c)。这种效应是可逆的，因为当应激物暴露之后给出60min恢复时，幼体表现出与未处理的对照不可区分的摄食动机。总的来说，处理的效应是高度显著的(ANOVA F(2,68)＝16.56,p<0.001)。为了排除应激物特异性现象的可能性，还测试了暴露于渗透休克。结果证实以前的结果，表现出最初减少的摄食动机，在应激物暴露之后60min重新获得摄食动机(图4d；ANOVA F(2,22)＝5.79,p＝0.010)。

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Claims

1.一种产生诱导型应激动物模型的方法，所述方法包括遗传修饰非人脊椎动物以表达可以在下丘脑-垂体-肾上腺轴细胞中通过光激活的一种或多种蛋白，其中可以通过光激活的蛋白能够诱导

(i)从下丘脑前区的室旁核中的神经元释放促皮质素释放激素(CRH)和/或精氨酸-加压素(AVP)；

(ii)从垂体前叶中的促肾上腺皮质激素细胞释放促肾上腺皮质激素(ACTH)；和/或

(iii)从肾上腺皮质中的细胞释放糖皮质激素。

2.权利要求1的方法，其中可以通过光激活的蛋白选自光激活腺苷酸环化酶(PAC)、channelrhodopsin 1和channelrhodopsin 2。

3.权利要求1或2的方法，其中所述非人脊椎动物为鱼。

4.权利要求3的方法，其中所述鱼选自斑马鱼和青鳉。

5.通过权利要求1-4中任一项的方法获得的应激动物模型。

6.权利要求5的动物模型在筛选用于预防、改善或治疗应激和/或应激相关疾病的化合物中的用途。

7.一种筛选用于预防、改善和/或治疗应激和/或应激相关疾病的化合物的方法，所述方法包括

(a)向权利要求5的动物模型给予受试化合物；

(b)在步骤(a)之前、与步骤(a)同时和/或在步骤(a)之后在所述动物模型中诱导应激；以及

(c)分析步骤(b)中诱导的应激应答，

其中与不存在受试化合物的情况下观察到的应激应答相比，在存在受试化合物的情况下于(c)中观察到的减少的应激应答指示化合物适合作为预防、改善和/或治疗应激和/或应激相关疾病的化合物。

8.权利要求7的方法，其中在步骤(b)中通过将所述动物暴露于光来诱导应激。

9.权利要求1-4中任一项的方法，权利要求5的动物，权利要求6的用途或者权利要求7或8的方法，其中所述应激为慢性应激。

10.一种分析鱼中的应激行为的方法，所述方法包括

(i)将鱼置于游泳室中，并且将所述鱼暴露于刺激；以及

(ii)在存在或不存在应激物的情况下分析所述鱼的刺激依赖性行为；

其中与不存在应激物的情况下在(ii)中观察到的行为相比，在存在应激物的情况下于(ii)中观察到的行为的改变指示应激。

11.权利要求10的方法，其中所述刺激选自温度变化、照明变化或机械感觉刺激。

12.权利要求10或11的方法，其中所述刺激为食物。

13.权利要求10或11的方法，其中所述方法为主动回避测试。

14.权利要求10-13中任一项的方法，其中所述鱼选自斑马鱼和青鳉。

15.权利要求10-13中任一项的方法，其中所述鱼是通过权利要求3或4中任一项的方法获得的动物模型。