CN104975068A - 一种检测样品中的荧光素酶活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种检测样品中的荧光素酶活性的方法。包括在含有ATP、Mg2+、Ca2+、荧光素、氨基乙酰双甘氨肽和磷酸盐的混合液中孵育生物素化荧光素酶以产生光信号。在检测荧光素酶的过程中，光信号强度大，持续时间长，有利于荧光素酶的高通量筛选和使用。

Description

一种检测样品中的荧光素酶活性的方法
技术领域
    本发明属于生物检测领域，具体涉及一种检测样品中的荧光素酶活性的方法。
背景技术
荧光素酶是生物体内催化荧光素或者脂肪醛氧化发光的一类酶的总称，可以从细菌、萤火虫等生物中提取出来。萤火虫荧光素酶催化的发光反应必须要ATP和萤火虫荧光素的参与。
荧光素酶可以在实验室中用基因工程的方法生成，并被用于多种不同的实验。萤光素酶的基因可以被合成并插入到生物体中或转染到细胞中。研究者利用基因工程已经使得小鼠、家蚕、马铃薯等一些生物可以合成萤光素酶。间接体外成像是一种强大的研究手段，可以对整个动物体中的细胞群落进行分析：将不同类型的细胞（骨髓干细胞、T细胞等）标记上（即表达）萤光素酶，就可以用高敏感度的CCD相机进行对动物体内进行活体观察而不会伤害到动物本身。
在荧光素酶中加入正确的萤光素底物就可以放出萤光，而发出的光子可以被光敏感元件，如萤光探测器或改进后的光学显微镜探测到。这就使得对包括感染在内的多种生命活动进程进行观察成为可能。例如，萤光素酶可以被用于检测血库中所存血液中的红血球是否开始破裂。法医可以用含有萤光素酶的溶液来检测犯罪现场中残留的血迹。医院用萤光素酶的发光来发现特定的疾病。萤光素酶还可以作为“报告蛋白”被用于分子生物学研究中，例如，用于在转染过萤光素酶的细胞中检测特定启动子的转录情况或用于探测细胞内的ATP的水平；这一技术被称为报告基因检测法或萤光素酶检测法。萤光素酶是一个热敏感蛋白，因此经常被用于研究蛋白热变性过程中热休克蛋白的保护能力。
基因组测序是当代生命科学技术的前沿核心技术之一，其中的焦磷酸测序法采用了荧光素酶进行检测，读长大，精确度高。现有技术在检测荧光素酶的过程中，光信号强度较差，持续时间短，不利于荧光素酶的高通量筛选和使用。
发明内容
本发明的一个目的是一种检测样品中的荧光素酶活性的方法，包括在含有ATP、Mg2+、Ca2+、荧光素、氨基乙酰双甘氨肽和磷酸盐的混合液中孵育生物素化荧光素酶以产生光信号。
所述混合液中还含有Tris-HCl缓冲液。
所述混合液中，氨基乙酰双甘氨肽为14-18mM。
所述混合液中还含有温和还原剂，所述温和还原剂为TCEP（三(2-羧乙基)膦）、DTT、(NH4)2S、NH4HS、Na2S、NaHS和NaHSO3中的一种或几种，优选为TCEP、DTT和NaHS，体积比为3:1:2。
所述温和还原剂在60mM以下。
所述Mg2+是由MgCl2提供的，所述Ca2+是由CaCl2提供的。
所述磷酸盐离子是由H2PO4 -、HPO4 2-和PO4 3-中的一种或几种提供的，优选为HPO4 2-。
所述混合液的pH值为7.0-8.0。
所述混合液中ATP为0.4-0.8μM。
在200μl的检测体系中，分别检测80-120ng、8-12ng和0.8-1.2ng生物素化荧光素酶的荧光信号强度。
将孵育后的生物素化荧光素酶放入Promega GloMax 96 微孔板发光检测仪测定荧光信号的强度。
本发明还提供了一种用于检测荧光素酶活性的试剂盒，包括权利要求1所述的混合液。
本发明中的测定方法在检测荧光素酶的过程中，光信号强度大，持续时间长，有利于荧光素酶的高通量筛选和使用。本发明具有操作简单，时间短，通量大的特点，可大批量筛选荧光素酶，应用于高强度的焦磷酸测序反应。
具体实施方式
实施例1
在200μl Tris-HCl中加入3mM MgCl2、4 mM CaCl2、1mM荧光素、15mM氨基乙酰双甘氨肽、1.5mM磷酸盐、6mM TCEP、2mM DTT和4mM NaHS，调节pH值至7.5，再加入100ng生物素化荧光素酶，振荡5s，以产生光信号，振荡2s，迅速置于Promega GloMax 96 微孔板发光检测仪中，检测仪加入0.47μM ATP，测定荧光信号的强度，再以同样方法分别对10ng和1ng进行测定。
实施例2
在200μl Tris-HCl中加入4mM MgCl2、3 mM CaCl2、1mM荧光素、16mM氨基乙酰双甘氨肽、1.5mM Na2HPO4 2、6mM (NH4)2S和2mM NaHS，调节pH值至7.0，再加入120ng生物素化荧光素酶，进行4℃孵育，以产生光信号，振荡5s，迅速置于Promega GloMax 96 微孔板发光检测仪中，检测仪加入0.4μM ATP，测定荧光信号的强度，再以同样方法分别对12ng和1.2ng进行测定。
实施例3
在200μl Tris-HCl中加入2mM MgCl2、3 mM CaCl2、0.9mM荧光素、14mM氨基乙酰双甘氨肽、0.5mM KH2PO4、1mM Na2HPO4、1mM Na3PO4、10mM NH4HS，调节pH值至8.0，再加入100ng生物素化荧光素酶，振荡4s，以产生光信号，振荡3s，迅速置于Promega GloMax 96 微孔板发光检测仪中，检测仪加入0.8μM ATP，测定荧光信号的强度，再以同样方法分别对10ng和1ng进行测定。
实施例4
在200μl Tris-HCl中加入4mM MgCl2、2mM CaCl2、0.8mM荧光素、18mM氨基乙酰双甘氨肽、2mM NaH2PO4、1mM K2HPO4、5mM TCEP和3mM NaHSO3，调节pH值至7.6，再加入100ng生物素化荧光素酶，于4℃振荡孵育2s，以产生光信号，振荡6s，迅速置于Promega GloMax 96 微孔板发光检测仪中，检测仪加入0.6μM ATP，测定荧光信号的强度，再以同样方法分别对10ng和1ng进行测定。
实施例5
在200μl Tris-HCl中加入6mM MgCl2、0.5mM CaCl2、0.8mM荧光素、18mM氨基乙酰双甘氨肽、5mM Na2HPO4、2mM NH4HS、1.5mM Na2S、1mM NaHS和3mM NaHSO3，调节pH值至7.8，再加入80ng生物素化荧光素酶，于4℃振荡孵育25s，以产生光信号，振荡10s，迅速置于Promega GloMax 96 微孔板发光检测仪中，检测仪加入0.65μM ATP，测定荧光信号的强度，再以同样方法分别对8ng和0.8ng进行测定。
实施例6
在200μl Tris-HCl中加入4mM MgCl2、2mM CaCl2、1.2mM荧光素、16mM氨基乙酰双甘氨肽、3mM Na2HPO4、8mM DTT，调节pH值至7.4，加入100ng生物素化荧光素酶，振荡30s，以产生光信号，振荡10s，迅速置于Promega GloMax 96 微孔板发光检测仪中，检测仪加入0.5μM ATP，测定荧光信号的强度，再以同样方法分别对10ng和1ng进行测定。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一种检测样品中的荧光素酶活性的方法，其特征在于，包括在含有ATP、Mg2+、Ca2+、荧光素、氨基乙酰双甘氨肽和磷酸盐的混合液中孵育生物素化荧光素酶以产生光信号。
2.如权利要求1所述的检测样品中的荧光素酶活性的方法，其特征在于，所述混合液中还含有Tris-HCl缓冲液。
3.如权利要求1所述的荧光素酶活性的测定方法，其特征在于，所述混合液中还含有温和还原剂，所述温和还原剂为TCEP、DTT、(NH4)2S、NH4HS、Na2S、NaHS和NaHSO3中的一种或几种，优选为TCEP、DTT和NaHS，体积比为3:1:2。
4.如权利要求1所述的检测样品中的荧光素酶活性的方法，其特征在于，所述温和还原剂在60mM以下。
5.如权利要求1所述的检测样品中的荧光素酶活性的方法，其特征在于，所述Mg2+是由MgCl2提供的，所述Ca2+是由CaCl2提供的。
6.如权利要求1所述的检测样品中的荧光素酶活性的方法，其特征在于，所述磷酸盐离子是由H2PO4 -、HPO4 2-和PO4 3-中的一种或几种提供的，优选为HPO4 2-。
7.如权利要求1所述的检测样品中的荧光素酶活性的方法，其特征在于，所述混合液的pH值为7.0-8.0。
8.如权利要求1所述的检测样品中的荧光素酶活性的方法，其特征在于，所述混合液中ATP为0.4-0.8μM。
9.一种用于检测荧光素酶活性的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的混合液。
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