CN104974992A - 茄子GDP-L-半乳糖磷酸酶SmGGP蛋白及其编码基因 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种茄子GDP-L-半乳糖磷酸酶SmGGP蛋白及其编码基因，所述蛋白包括：(a)由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有茄子GDP-L-半乳糖磷酸酶活性的由(a)衍生的蛋白质；所述编码基因具有SEQ ID NO.1所示碱基序列；该基因在根、茎、叶、花、果皮、果肉均有表达，叶中的表达量显著高于其他组织。低温胁迫下，其表达量在48h达到最大值，为未处理的4.57倍。本发明为今后利用基因工程技术改良植物品质，获得高抗氧化性的药物或食物提供理论依据，具有很大的应用价值。

Description

茄子GDP-L-半乳糖磷酸酶SmGGP蛋白及其编码基因
技术领域
本发明涉及茄子抗坏血酸合成途径中的关键酶及其编码基因，具体涉及一种茄子GDP-L-半乳糖磷酸酶SmGGP蛋白及其编码基因，属于生物技术领域。
背景技术
抗坏血酸是植物体内最重要的抗氧化物质之一，它可以直接清除植物在逆境或正常代谢中产生的活性氧。其次，抗坏血酸能够维持另一种重要的抗氧化剂维生素E处于还原状态，并通过抗坏血酸-谷胱甘肽循环间接清除H2O2，从而保护植物免于氧化胁迫的伤害。
目前为止，植物中抗坏血酸的生物合成被认为有4种途径，其中受公众认可的是L-半乳糖途径。GGP(GDP-L-galactose phosphorylase)，又称为VTC2，催化GDP-L-半乳糖转变成L-半乳糖-1-磷酸。Bulley等研究发现猕猴桃叶片及不同发育时期果实中抗坏血酸的含量与GGP基因的表达呈现很好的相关性。在抗坏血酸含量最高的毛花猕猴桃中，GME和GGP的表达高于其他种的猕猴桃。在拟南芥中超量表达来自猕猴桃的GGP基因可使抗坏血酸的含量提高4倍左右，而当同时瞬时表达GME和GGP基因可以使抗坏血酸的含量增加至7倍。这些结果说明了GGP基因很可能是调控植物抗坏血酸合成的关键点。
目前已从很多植物中克隆得到GGP基因，如拟南芥、大豆、猕猴桃、番茄等。茄子是重要的蔬菜作物，但其因为缺少基因组相关信息，导致相关研究比较滞后。目前，未有任何与茄子GGP基因及其编码蛋白的相关文献报道。
发明内容
本发明的目的在于填补茄子GGP蛋白及其编码基因的空白，提供了一种茄子GGP的cDNA以及氨基酸序列；进一步地，本发明提供了茄子SmGGP基因在不同组织器官及低温下的表达模式。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供一种具有茄子GDP-L-半乳糖磷酸酶(GGP)活性的蛋白质，所述蛋白质包括：
(a)由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有茄子GGP活性的由(a)衍生的蛋白质；
该蛋白质在茄子不同器官内的有无及活性大小存在较大差异。
优选地，所述蛋白质包括SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1～20个以内氨基酸而得到的序列。
优选地，所述蛋白质为SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中1～10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。
第二方面，本发明提供了一种编码所述具有茄子GDP-L-半乳糖磷酸酶(GGP)活性的蛋白质的基因的核酸序列，所述基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述基因的cDNA序列包括：
(a)如SEQ ID NO.1第1～1314位所示的碱基序列；或
(b)与SEQ ID NO.1第1～1314位所示的碱基序列具有至少70％的同源性的碱基序列；或
(c)能与SEQ ID NO.1第1～1314位所示的碱基序列进行杂交的碱基序列。
优选的，所述核酸序列包括SEQ ID NO.1第1～1314位所示的核酸序列中1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加60个以内核苷酸形成的碱基序列。
第三方面，本发明提供一对用于扩增所述基因的核酸序列的cDNA的引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
第四方面，本发明还提供一种所述基因的核酸序列的启动子，所述启动子包括SEQID NO.3所示的碱基序列。
在本发明中，“分离的DNA”、“纯化的DNA”是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。
在本发明中，术语“SmGGP蛋白编码序列”指编码具有茄子SmGGP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示的第1～1314位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1所示的第1～1314位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1所示的第1～1314位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的同源性至少70％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与天然的茄子SmGGP相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：通常为1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加为60个以内核苷酸。
在本发明中，术语“SmGGP蛋白”指具有茄子SmGGP蛋白活性的SEQ ID NO.2所示序列的多肽。该术语还包括具有与茄子SmGGP蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：通常为1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括茄子SmGGP蛋白的活性片段和活性衍生物。
本发明的茄子SmGGP蛋白的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与茄子SmGGP相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用茄子SmGGP蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。
在本发明中，“茄子SmGGP保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
表1
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还包括茄子SmGGP蛋白或多肽的类似物。这些类似物与茄子SmGGP相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可用实时荧光定量PCR的方法分析茄子SmGGP基因产物的表达模式，即分析茄子SmGGP基因的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
此外，根据本发明的茄子SmGGP核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选茄子SmGGP相关同源基因或同源蛋白。
为了得到与茄子SmGGP相关基因的点阵，可以用DNA探针筛选茄子cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用32P对茄子SmGGP相关的全部或部分做放射活性标记而得的。适合于筛选的cDNA文库是来自茄子的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech,Stratagene,Palo Alto,Cal.。这种筛选方法可以识别与茄子SmGGP相关的基因家族的核苷酸序列。
本发明的茄子SmGGP相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)固相多肽合成，WH Freeman Co.,San Francisco；MerrifieldJ.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明的茄子GGP基因与番茄GGP基因mRNA的同源比较(GAP)结果；
图2为本发明的茄子GGP蛋白与番茄GGP蛋白的氨基酸序列同源比较(FASTA)结果；其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出；
图3为本发明的茄子GGP基因在不同组织的表达情况；
图4为本发明的茄子GGP基因在低温下不同处理时间的表达情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、茄子SmGGP基因的克隆
1.植物材料的获得
本实验所用的植物材料为茄子优良种质资源蓝山禾线茄。实验材料栽培于上海市闵行区浦江镇航天育种基地的人工塑料大棚中。在自然条件下育苗，生长并结实。采集茄子的叶片用于提取RNA。
2.RNA的提取
采用TRIzol法提取总RNA(TRIzol购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。用甲醛变性胶电泳鉴定RNA的完整性，然后在分光光度计(Thermo Scientific NANODROP1000 Spectrophotometer)上测定RNA的纯度及浓度。
3.基因的全长克隆
基于Genbank中GGP基因的保守序列设计一对简并引物。将提取RNA进行反转录(Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit：宝生物工程(大连)有限公司)，以第一链cDNA为模板，利用引物
F1(SEQ ID NO.4)：5′-ATGATGCTYARRATYAAGAGGGTTCC-3′
R1(SEQ ID NO.5)：5′-TAKKCGGGAACCATGGTASYRTGG-3′
进行PCR，扩增得到预期长度后回收并连接到pMD-19T(宝生物工程(大连)有限公司)载体上，转化大肠杆菌DH5α，利用α互补及菌落PCR筛选阳性克隆，送至英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序，得cDNA序列SEQ ID NO.1。
实施例2、茄子GGP基因的序列信息与同源性分析
本发明新的茄子GGP基因全长CDS开放读框序列为1314bp，详细序列见SEQ IDNO.1。根据CDS开放读码框序列推导出茄子GGP的氨基酸序列，共437个氨基酸残基，分子量为48710.4道尔顿，理论等电点(pI)为4.71，详细序列见SEQ ID NO.2所示序列。
将茄子GGP的CDS开放读框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与番茄GGP基因(JQ517313.1)在核苷酸水平上具有93.76％一致性，如图1所示(Query：茄子GGP的mRNA序列；Sbjct：番茄GGP的mRNA序列)；在氨基酸水平上，它们两者之间相似性高达95.19％，如图2所示(Query：茄子GGP的氨基酸序列；Sbjct：番茄GGP的氨基酸序列)。由此可见，茄子GGP基因与番茄GGP基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。
实施例3、茄子GGP基因的启动子克隆与序列分析
采用Genome Walking Kit试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)，设计引物
SP1：5′-TTGAAACAATACAGCGGTAGCTTTGA-3′
SP2：5′-GAAGGCAGCAGTTCCTGAGGCAATT-3′
SP3：5′-CACCACGAGCACCAATTTCATCCACC-3′
以DNA为模板，进行三轮PCR扩增，扩增得到产物后回收并连接到pMD-19T(宝生物工程(大连)有限公司)载体上，转化大肠杆菌DH5α，利用α互补及菌落PCR筛选阳性克隆，送至英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序。测序结果发现得到茄子GGP基因启动子536bp。序列提交到PLACE和PlantCARE两个顺式元件在线预测软件进行分析，发现其含有很多光响应元件，包括G-box、GA-motif、GATA-motif、GT1-motif等；它还含有脱落酸响应元件ABRE。详细序列见SEQ ID NO.3所示序列。
实施例4、茄子GGP基因在不同组织中的表达差异和在低温下的表达模式
1.植物材料的获得
在果实成熟期分别采集茄子根、茎、叶、花、果皮、果肉，将样品分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转入-80℃超低温冰箱中贮存待用。
将位于人工气候培养箱中同期播种且长势一致的茄子幼苗置于4℃，分别在0h、1h、3h、6h、12h、24h和48h取处理材料的叶片，用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转入-80℃超低温冰箱中贮存待用。
2.RNA的提取
采用TRIzol法提取总RNA(TRIzol购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。用普通琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1.2％；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15min)检测完整性。电泳条带中最大rRNA亮度应为第二条rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示rRNA样品的降解。纯度较好的RNA，A260/A280以及A260/A230约为2.0左右。用分光光度计测定OD值并计算RNA含量。
3.cDNA的获得
以500ng的总RNA为模板，按照宝生物公司TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent KitPerfect Real Time试剂盒操作说明进行反转录获得cDNA备用。
4.设计特异性引物以进行实时荧光定量PCR分析基因在不同组织中和低温下的表达量。根据已经获得的茄子GGP基因序列，利用引物设计软件设计用于Real-time PCR中SmGGP基因定量分析的特异性引物，
GGP-F：5′-GCAAGTTCAACTTCACTAAGGTTGG-3′
GGP-R：5′-GGCACTCAAGGACCTTAGGGATCA-3′
内参基因为Actin(GU984779.1)，其引物为
ACTIN-F：5′-GTCGGAATGGGACAGAAGGATG-3′
ACTIN-R：5′-GTGCCTCAGTCAGGAGAACAGGGT-3′
5.制作目的基因及内参基因的标准曲线。用EASY Dilution(试剂盒提供)将标准品cDNA溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板，以目的基因及内参基因的特异性引物进行Real-time PCR扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线。分析溶解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得到单一的PCR扩增产物。通过标准曲线确定模板cDNA的合适稀释倍数。
6.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析。以合成的cDNA第一条链为模板，分别用目的基因与内参基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，Real-time PCR反应在FTC-3000实时定量仪上进行，反应体系为20μL。反应采用三步法，95℃变性1min，接着40个循环：95℃30s；58℃30s；72℃45s。每次扩增完成后，均做溶解曲线，以检验扩增产物是否为特异产生。
7.采用法作相对定量分析。结果表明SmGGP基因在茄子的根、茎、叶、花果皮、果肉中都有表达，其中在叶中的表达量最高，其次是花，而在根中的表达量最低，说明SmGGP基因的表达具有明显的空间差异性(图3)。在低温胁迫下，SmGGP基因的表达量随着胁迫时间的延长不断上升，在48h达到最大值，为未处理的4.57倍，表明其受到低温的诱导而表达(图4)。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (7)

1.一种具有茄子GDP-L-半乳糖磷酸酶活性的蛋白质，其特征在于，包括：
(a)由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有茄子GDP-L-半乳糖磷酸酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的具有茄子GDP-L-半乳糖磷酸酶活性的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质包括SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1～20个以内氨基酸而得到的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的具有茄子GDP-L-半乳糖磷酸酶活性的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中1～10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。
4.一种编码权利要求1所述的具有茄子GDP-L-半乳糖磷酸酶活性的蛋白质的基因的核酸序列，其特征在于，所述基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求4所述的编码所述具有茄子GDP-L-半乳糖磷酸酶活性的蛋白质的基因的核酸序列，其特征在于，包括SEQ ID NO.1第1～1314位所示的核酸序列中1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加60个以内核苷酸形成的碱基序列。
6.一对用于扩增权利要求4或5所述基因的核酸序列的引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
7.一种权利要求4所述的具有茄子GDP-L-半乳糖磷酸酶活性的蛋白质的基因的核酸序列的启动子，其特征在于，所述启动子包括SEQ ID NO.3所示的碱基序列。
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