CN104962564A - 一个调控禾本科植物株高基因indeterminate1的克隆及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一个调控禾本科植物株高基因INDETERMINATE1(ID1)的克隆及应用，发明人从二穗短柄草和小麦中分离和克隆到同源的ID1基因，并将其命名为BdID1和TaID1，发明人将BdID1和A、B基因组的TaID1的全长cDNA连接到过表达载体启动的表达载体上，利用农杆菌浸染转化二穗短柄草，发现上述基因可以使二穗短柄草出现矮化的性状。

Description

一个调控禾本科植物株高基因INDETERMINATE1的克隆及应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，提供了一个调控禾本科植物株高基因INDETERMINATE1(ID1)的克隆及应用。

背景技术

我国黄淮海区域的农业生产主要是小麦和玉米的轮作。由于玉米的生产趋向于麦收后机器直播和成熟后机器收获，育种工作中迫切需要培育生育期短、耐倒伏的小麦和玉米品种。适度的早花能够缩短小麦和玉米的生育期，提高品种的适应性，因而是重要的作物农艺性状。作物植株矮化能够显著地增加作物的耐倒伏性，上个世纪60年代的绿色革命，就是利用了赤霉素相关的矮秆基因育成了矮秆抗倒伏的小麦和水稻品种，导致全世界的粮食产量大幅度地提升。因此获得更多的禾本科植物开花和株高相关功能基因，可以显著地促进小麦、玉米等的分子设计育种工作。

INDETERMINATE1(ID1)是玉米中最早克隆的抽穗期调控基因(Colassanti et al.,Cell.1998,93:593-603.)。与野生型相比，indeterminate1(id1)突变体表现为极度晚花，需要300多天才能抽穗，其花序也呈现出一定的营养生长的特征(Colassanti et al.,Cell.1998,93:593-603.)。ID1编码由四个连续的锌指结构组成的锌指蛋白转录因子(Colassanti et al.,Cell.1998,93:593-603.)。体外实验证明，ID1的四个锌指结构中，Z1和Z4具有蛋白互作功能，Z2和Z3具有DNA结合功能，能够结合一段序列为5’-T-T-T-G-T-C-G/C-T/C-T/a-T/a-T-3’的DNA(Kozaki et al.,Nucleic Acids Res.2004,32:1710-1720.)。

水稻中的ID1同源基因RID1/Ehd2/OsID1同样在成花转变中有重要功能。RID1/Ehd2/OsID1突变或者沉默后的植株表现出抽穗期滞后，甚至完全不抽穗的表型(Wu et al.,Proc.Natl.Accad.Sci.2008,105:12915-12920；Matsubara et al.,Plant Physiol.2008,148:1245-1435；Park et al.,Plant J.2008,56:1018-1029.)。RID1/Ehd2/OsID1和玉米中的ID1具有相似的表达模式，但具体的作用机理并不清楚。水稻中的研究表明，ID1可以影响很多抽穗期相关基因的表达，例如Ehd1、Hd1和Ghd7等，并最终通过影响FT同源基因RFT1和Hd3a来调控开花(Wu et al.,Proc.Natl.Accad.Sci.2008,105:12915-12920；Matsubara et al.,Plant Physiol.2008,148:1245-1435；Park et al.,Plant J.2008,56:1018-1029.)。最近发现水稻中的RID1/Ehd2/OsID1基因的一个点突变能够导致抽穗期推迟和产量增加(Hu et al.,Rice(N Y).2013,6:24.)。

ID1是IDD(ID Domain)基因家族的一个成员。IDD基因家族是植物特有的转录因子家族，在拟南芥、水稻和玉米中分别有16、15和21个家族成员。水稻和玉米中存在ID1基因，但在拟南芥中找不到ID1基因的同源基因，这说明ID1基因很可能是禾本科植物所特有的(Colasanti et al.,BMC Genomics.2006,7:158-174.)。

在IDD蛋白中，4个锌指结构组成的N端(即ID domain)较为保守，而C端除两个基序外，普遍地保守性较差(Colasanti et al.,BMC Genomics.2006,7:158-174.)。目前对IDD基因的功能研究还不是很多，并且仅限于水稻和拟南芥。水稻中IDD10基因参与了铵离子介导的水稻根系发育过程(Xuan et al.,2013)。水稻LPA1基因可以通过影响重力感应来调控水稻的株型(Wu et al.,Plant Physiol.2013,161:317-804.)。对于拟南芥的研究表明，IDD蛋白可以通过蛋白互作以及与DNA的结合调控下游基因的表达，参与多种植物生长发育信号途径的调控。其中SGR5能够影响植物的重力反应(Moria et al.,Plant J.2006,47:942-960；Tanimoto et al.,Plant Mol.Biol.2008,67:57-69.)。Jackdaw和Gafpie通过和SCR，SHR的互作调控根系的生长和发育(Welch et al.,Genes Dev.2007,21:2196-2204；Ogasawara et al.,Plant Mol.Boil.2011,77:489-499.)。

在热带禾本科植物玉米和水稻中，ID1是一个开花促进基因。热带禾本科植物是短日照植物，缺乏春化效应；温带禾本科植物是长日照植物，存在明显的春化需求。因此，从进化的角度推测，温带禾本科植物中的ID1基因的功能和作用机理可能会具有一定的特殊性，但目前尚无研究关注温带禾本科植物中的ID1基因。

禾本科植物包含了人类和动物能量来源的最重要的作物，如早熟禾亚科的小麦、大麦、燕麦等；稻亚科的水稻和黍亚科的玉米、高粱、甘蔗、谷子等。二穗短柄草(Brachypodium distachyon L.)属于短柄草族，它和麦族并列同属于早熟禾亚科(Mochida and Shinozaki,PLoS One.2013,8:e75265.)。麦族中的小麦年产量约6.5-7.0亿吨(FAO)，是世界三大粮食作物之一。二穗短柄草和小麦同属温带禾本科植物，而且存在着保守的IDD基因家族和ID1基因，它们大约在32-39M年前从同一祖先中分离，因此二穗短柄草是极好的研究小麦的模式植物。

双子叶模式植物拟南芥中缺乏典型的ID1基因，而玉米和水稻属于热带禾本科植物，其ID1基因的功能分析仅限于突变体和沉默系，主要是促进开花。二穗短柄草和小麦属于温带禾本科植物，其ID1基因的具体功能和热带禾本科植物不完全一致，如何发掘其不同并将其应用于植物生长调节中成为一大问题。

发明内容

本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一个调控禾本科植物株高基因INDETERMINATE1(ID1)的克隆及应用，发明人从二穗短柄草和小麦中分离和克隆到同源的ID1基因，并将其命名为BdID1和TaID1，发明人将BdID1和A、B基因组的TaID1的全长cDNA连接到表达载体上，利用农杆菌浸染转化二穗短柄草，发现该基因可以使二穗短柄草出现矮化和早花的性状。

来源于二穗短柄草的相关基因，命名为BdID1，其cDNA全长如SEQ ID NO.1所示，其编码区如序列表SEQ ID NO：2所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。

来源于小麦的相关基因，命名为TaID1，TaID1_6AS的编码区全长如序列表SEQ ID NO：4所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示；TaID1_6BS的编码区全长如序列表SEQ ID NO：6所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：7所示。

发明人首先从二穗短柄草和中国春小麦获取了总RNA，反转录获得cDNA第一链，之后利用其作为模板，用BdID1和TaID1对应的特异性引物对获得的cDNA进行pfu高保真酶扩增，其中所采用的引物如下：

BdID1引物序列： 

上游引物GGTACCATGATGCTCTCTGATCTCTCG如SEQ ID NO：8所示

下游引物AAGCTTTTAGAAGTGGTGGCTCCAAGT如SEQ ID NO：9所示

TaID1引物序列： 

上游引物GGTACCATGATGCTCTGTGATCTCTC如SEQ ID NO：10所示

下游引物AAGCTTCTAGAAGTTGTGGCTCCACG如SEQ ID NO：11所示

其中划线处为酶切位点，上游引物的酶切位点均为Kpn1，BdID1下游引物的酶切位点为HindⅢ，TaID1下游引物的酶切位点为Sac1；

扩增获得的产物分别用Kpn1和HindⅢ酶切BdID1；用Kpn1和Sac1酶切TaID1，之后将其分别连接到PZP211克隆载体；

综上所述，发明人发现在二穗短柄草中用35S启动子过表达BdID1，能够促进二穗短柄草转基因植株的开花并且抑制株高。玉米Ubi启动子驱动的二穗短柄草ID1和小麦ID1基因转化二穗短柄草导致更强烈早花和矮化的表型。

构建Ubi::BdID1、Ubi::TaID1_6AS和Ubi::TaID1_6BS过表达载体，转入到EHA105农杆菌菌株中，利用农杆菌介导的方法侵染二穗短柄草愈伤，筛选获得具有抗性的转基因苗，转基因阳性植株均表现为矮小的表型。由于植株过度早花，收不到种子，所以我们又构建了35S::BdID1过表达载体，转入到EHA105农杆菌菌株中，利用农杆菌介导的方法侵染二穗短柄草愈伤，筛选获得具有抗性的转基因苗，转基因阳性植株也表现为矮小的表型。由此可见，本发明获得的基因可以使二穗短柄草出现矮化的性状，并由此应用到农业生产中去。

上述步骤中，二穗短柄草RNA和中国春小麦RNA的提取和纯化可直接采用现有工艺，也可采用本发明中所记载的工艺；cDNA第一链的合成的也是相同的情况，也可以采用现有的工艺或者试剂盒，但是上述两者均优选采用本发明所记载的具体工艺；

综上所述，发明人将BdID1和A和B基因组的TaID1的全长cDNA连接到过表达载体启动的表达载体上，利用农杆菌浸染转化二穗短柄草，发现该基因可以使二穗短柄草出现矮化和早花的性状，并以此为基础可以直接应用与农业生产中。

附图说明

图1为进化树分析图，据图可知二穗短柄草和小麦中都有ID1的同源蛋白；BdID1、水稻ID1、小麦ID1以及玉米ID1同属于一个分支，具有很高的亲缘关系；

图2为禾本科植物ID1氨基酸序列比对图，

可见在第一个和第二个锌指结构之间具有一个较大的间隔，并且具有一个保守的LTR结构域；

图3为验证35S::BdID1能够互补水稻rid1突变体的试验综合图：

图中A为35S::BdID1互补的水稻rid1突变体对应生长情况示意图，其中ZH11为野生型对照植株，rid1为水稻突变体植株，#8、#20、#12、#15为35S::BdID1互补水稻rid1突变体的阳性植株，

B为互补植株开花时间的统计图，其中，ZH11为野生型对照植株，rid1为水稻突变体植株，35S::BdID1/rid1为35S::BdID1互补水稻rid1突变体的阳性植株，

C为琼脂糖凝胶电泳鉴定图，通过该图可验证互补植株确实为转基因阳性植株，其中ZH11为野生型对照植株，rid1为水稻突变体植株，#8、#20、#12、#15为35S::BdID1互补水稻rid1突变体的阳性植株，P1、P2和P3：验证为rid1突变体的引物，可见35S::BdID1互补水稻rid1突变体的阳性植株中均出现了BdID1，且P1和P2、P2和P3两对引物证明植株为rid1突变体；

图4为二穗短柄草中过表达小麦和二穗短柄草ID1基因植株的表型示意图；

图中A为Bd21植株作为对照，

B为小麦TaID1基因A基因组构建的Ubi过表达载体转化二穗短柄草获得的转基因植株，可见转基因阳性植株均具有矮化的表型，

C为小麦TaID1基因B基因组构建的Ubi过表达载体转化二穗短柄草获得的转基因植株，可见转基因阳性植株均具有矮化的表型，

D为二穗短柄草BdID1构建的Ubi过表达载体转化二穗短柄草获得的转基因植株，可见转基因阳性植株均具有矮化的表型；

图5为Ubi::BdID1转基因植株的表型示意图，

图中A为Ubi::BdID1转基因植株，可见该转基因阳性植株具有矮化的表型，

B为Ubi::BdID1转基因植株的早花表型，箭头表示包裹在叶子中的幼穗，

C为Ubi::BdID1转基因植株缩短的茎节，从而导致植物出现的矮化表型；

图6为35S::BdID1转基因植株的表型示意图，

图中A为在长日照条件下35S::BdID1转基因植株的表型，

B为在短日照条件下35S::BdID1转基因植株的表型，

A和B中WT为野生型Bd21植株，#5、#12、#14为转基因阳性株系，可见所有的转基因 阳性株系均具有半矮化的表型；

图7为BdID1-KO株系的植株表现为晚花表型的结果示意图，

利用CRISPR/Cas9技术获得的突变体植株：Bd21为野生型对照株系，BdID1-KO1、BdID1-KO2为两个不同位点突变的阳性株系，可见BdID1-KO1、BdID1-KO2为两个不同位点突变的阳性株系具有极度晚花或者永不开花的性状。

具体实施方式

以下实施例中进一步解释说明本发明的技术方案，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件；其中本发明将上述表达载体导入植物细胞中，导入方法都是本领域人员熟知的，这些方法包括但不仅限于：农杆菌介导的转化法、基因枪法、电激法、子房注射法等。本发明所用选择标记基因为新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)，可进一步包括其它选择标记基因和报告基因。本发明选用的筛选抗生素为G418，选用卡那霉素和巴龙霉素等抗生素也可起到相同筛选效果；除此之外，本发明所采用的均为本领域现有技术。

实施例1：二穗短柄草BdID1和小麦TaID1基因的序列分析以及克隆与载体构建

通过生物信息学分析，发明者找到了二穗短柄草的ID1同源基因如SEQ ID NO.1所示，和小麦的ID1同源基因，并克隆获得了二穗短柄草ID1基因如SEQ ID NO.2所示和小麦AB基因组上的ID1基因如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示。二穗短柄草的BdID1(BRADI3G26910)基因位于第三条染色体上，小麦ID1分别位于6AS，6BS，6DS上(分别命名为TaID1_6AS，TaID1_6BS，TaID1_6DS)。

其中BdID1的开放阅读框为1290bp，编码429aa如SEQ ID NO.3所示；

TaID1-6AS的开放阅读框为1257bp，编码418aa如SEQ ID NO.5所示；

TaID1-6BS的开放阅读框为1230bp，编码409aa如SEQ ID NO.7所示。

将BdID1这个基因编码的氨基酸序列在Gremene里进行检索，通过进化树分析发现这个基因与小麦、玉米、水稻等的ID1有较高的同源性，同属于一个亚分支(如图1所示)。氨基酸多序列比对表明BdID1，TaID1和水稻、玉米的ID1高度同源，且具有ID1蛋白的特征，比如ZF1和ZF2有较大的spacer，缺少MSATALLQKAA基序(如图2所示)。

根据找到的二穗短柄草BdID1和小麦的TaID1基因序列设计引物，进行克隆，克隆方法如下：

(1)RNA的提取：使用康为世纪TRIzon提取二穗短柄草和中国春小麦的总RNA。

1.取新鲜植物组织材料在液氮中充分研磨，每30-50mg组织加入1mlTRIzon，吸打混匀，室温放置5min使蛋白核酸复合物完全分离。

2.向上述离心管中加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2-3min。

3.4℃，12000g离心15分钟，液体分层，将最上层无色水相转移至一新RNase-Free离心管中。

4.加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min。

5.4℃，12000g离心10分钟，弃上清。

6.加入1mL RNase-Free水配制的75％乙醇(现用现配)，洗涤沉淀。

7.4℃，12000g离心5分钟，弃上清(尽量将上清全部吸干)，室温干燥5-10分钟，加入30-100μL无RNase的水溶解沉淀，沉淀溶解后可置于-80℃冰箱长久保存。

(2)反转录cDNA第一链的合成：将提取的RNA溶解后测定RNA浓度，然后使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒进行反转录。

取5μg总RNA，加入2×反应缓冲液10μL，引物ol igo dT(0.5μg/μL)1μL，反转录酶1μL，去基因组酶1μL，补水到20μL，在42℃孵育30分钟，85℃酶失活5分钟。

(3)BdID1和TaID1基因的克隆：

BdID1引物序列： 

上游引物GGTACCATGATGCTCTCTGATCTCTCG如SEQ ID NO：8所示

下游引物AAGCTTTTAGAAGTGGTGGCTCCAAGT如SEQ ID NO：9所示

TaID1引物序列： 

上游引物GGTACCATGATGCTCTGTGATCTCTC如SEQ ID NO：10所示

下游引物AAGCTTCTAGAAGTTGTGGCTCCACG如SEQ ID NO：11所示

使用pfu高保真酶进行扩增，反应体系为：10′反应缓冲液2.5μL，脱氧核糖核酸(dNTP)2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，pfu高保真酶0.5μL，DMSO 0.75μL，cDNA模板1μL，水补齐到25μL。

PCR反应条件为：95℃5分钟，95℃25秒，58℃30秒，72℃1分30秒，共35个循环，72℃5分钟，15℃保温。

反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，检测到目的条带后，切胶并进行胶回收，胶回收方法根据BioTeke公司的快捷型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Cat#DP1722)进行。

高保真酶扩增的产物末端为平末端，需要添加poly-A后才能进行TA克隆，反应体系如下：10′反应缓冲液1.5μL，脱氧核糖核酸(dNTP)1.2μL，Easy Taq酶0.15μL，胶回收产物补齐15μL。之后再72℃30分钟。

(4)取上述4μL加尾产物与pEASY-T1克隆载体进行连接，操作步骤按照全式金公司的产品pEASY-T1说明书进行.然后连接产物使用热激法转化大肠杆菌DH5α菌株，在含有氨苄青霉素的LB平板上生长过夜。挑取白色单个菌落在LB平板上划线，进行菌落PCR，反应体系如上，选取阳性菌落在LB液体培养基中过夜。

(5)质粒DNA的提取：使用康为世纪高纯度质粒小提取试剂盒(CW0500A)提取质粒DNA。

(6)序列测定：本工作在北京六合华大基因科技股份有限公司进行。

(7)表达载体的构建：用Kpn1和HindⅢ酶切测序正确的带有BdID1基因的质粒和分别带有Ubi和35S的PZP211空载体，用Kpn1和Sac1酶切测序正确的带有TaID1基因的质粒和带有Ubi的PZP211空载体，

37℃酶切一个小时之后，进行琼脂糖凝胶电泳，切除正确的条带进行胶回收，将胶回收产物用Thermo公司的T4DNA连接酶连接，连接产物转化DH5α菌株，在含有SPE的LB平板上生长过夜。挑取白色单个菌落在LB平板上划线，进行菌落PCR，选取阳性菌落在LB液体培养基中过夜。质粒DNA的提取：使用康为世纪高纯度质粒小提取试剂盒提取质粒DNA，构建得到Ubi::BdID1、35S::BdID1和Ubi::TaID1过表达载体。

取2.5μL质粒转化农杆菌EHA105，准备侵染二穗短柄草愈伤。

实施例2：BdID1互补水稻rid1突变体

利用构建得到的35S::BdID1过表达载体互补水稻rid1突变体：之后按照现有技术进行了水稻rid1突变体的同工互补实验，具体过程不再赘述，具体可参考吴昌银老师2008年发表在美国科学院院报上的“RID1,encoding a Cys2/His2-type zinc finger transcript ion factor,acts as a master switch from vegetat ive to floral development in rice.”。

结果表明转基因植株能够恢复抽穗(如图3A)，群体水平上抽穗期略晚于野生型(如图3B)，并且有个别植株出现了矮化的表型(如图3A)，使用P1和P2、P2和P3(引物序列如下)以及BdID1的双向引物验证发现，恢复抽穗表型的转基因苗确实为互补了BdID1的转基因阳性苗(如图3C)，这揭示了BdID1的确是RID1的同源蛋白。

验证转基因阳性植株的引物如下：

P1AAGGACGACTGTGGATTGAT SEQ ID NO：12所示

P2TCTTCTTCCTGTTCTTGCTCT SEQ ID NO：13所示

P3AATCCAGATCCCCCGAATTA SEQ ID NO：14所示

实施例3：二穗短柄草和小麦ID1超表达转基因植株的获得

利用农杆菌介导的方法侵染二穗短柄草愈伤获得转基因苗，具体实施方法如下：

(1)侵染前三天挑取农杆菌(携带重组质粒的农杆菌单菌落)接种于含有50mg/L壮观霉素的YEP培养基中，28℃，200rpm摇菌过夜，第二天取1ml活化的菌平铺到含有乙酰丁香酮的MGL培养基，暗培养两天后，准备侵染。

(2)将培养基上的菌体收集到20ml侵染液中，28℃摇散，测量浓度，使OD₆₀₀值在0.6-1.0之间，A₆₀₀为0.06-0.1。收集300块左右生长了6-7周的二穗短柄草幼胚诱导的愈伤，转移到50mL无菌小烧杯，倒入含有农杆菌的悬浮液20mL，轻轻摇晃1min，静置4min，倒出菌液，并用移液器尽可能多的吸走多余菌液。

(3)准备好一些放有无菌干滤纸的9cm培养皿。每个培养皿转入大约100块侵染过的愈伤，愈伤与愈伤之间，尽可能的分开，让滤纸吸去多余的菌液。愈伤摆放好后，28℃暗培养3天。

(4)将愈伤转移到含有G418的一次筛选培养基上生长，两周后转移到含有6-BA的二次筛选培养基上生长，筛选后的愈伤组织转入分化培养基。2周后，将分化得到的幼苗转入生根培养基，将长出3根以上壮根的幼苗炼苗，经过7天左右的炼苗期后，移栽至温室。

BdID1和TaID1过表达的转基因植株在分化阶段就表现出了严重的生长抑制表型，茎节不能伸长，叶片短小，一部分在分化培养基上就已经抽穗(如图4)。通过解剖发现，那些没有抽穗的植株也已经形成幼穗，可能由于节间不能伸长或者穗发育较慢导致穗不能抽出(图5)。以上结果表明，短柄草和小麦ID1能够促进成花转变，使得超表达植株表现出极早花表型，这与玉米水稻ID1促进抽穗的功能是一致的。另一方面，超表达植株出现矮化现象，这表明ID1抑制了植物的生长和节间伸长，这是之前尚未报道过的。由于Ubi1启动的超表达株系无法收到种子，我们构建了一个相对较弱的表达载体35S::BdID1转化二穗短柄草。35S::BdID1转基因植株表型差异较大，一些弱表型植株能够收到种子。T1植株表现出半矮化和轻微早花表型(图6)。这也进一步印证了小麦和二穗短柄草ID1抑制植物生长。

实施例4：二穗短柄草ID1突变体的获得

(1)CRISPR/Cas9载体的构建：

使用overlap PCR的方法扩增片段，引物序列如下：

BdID1.C1.F GGCCCCGGCGGTGCAGCTGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC如SEQ ID NO：15所示

BdID1.C1.R GCAGCTGCACCGCCGGGGCCACACAAGCGACAGCGCGCGGG如SEQ ID NO：16所示

BdID1.C2.F GCCATGGGAGTTGGATCCGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC如SEQ ID NO：17所示

BdID1.C2.R CCGGATCCAACTCCCATGGCACACAAGCGACAGCGCGCGGG如SEQ ID NO：18所示

BdU6.F GTGATGCTTGTAACTTTGTAAGC如SEQ ID NO：19所示

sgRNA.R GGCACATAGTCGACCTCGAGCGGCCGCCAG如SEQ ID NO：20所示；

进行两轮PCR，第一轮反应体系如下：10′反应缓冲液2.5μL，脱氧核糖核酸(dNTP)2μL，正向引物1μL，反向引物1μL，引物分别为：BdID1.C1.F与sgRNA.R；BdID1.C1.R与BdU6.F；BdID1.C2.F与sgRNA.R；BdID1.C2.R与BdU6.F，pfu高保真酶0.5μL，DMSO 0.75μL，cDNA模板1μL，水补齐到25μL。PCR反应条件为：95℃5分钟，95℃25秒，58℃30秒，72℃30秒，共35个循环，72℃5分钟，15℃保温。

第二轮PCR反应体系如下：10′反应缓冲液2.5μL，脱氧核糖核酸(dNTP)2μL，正向引物1μL，反向引物1μL，引物分别为：BdU6.F与sgRNA.R，pfu高保真酶0.5μL，DMSO 0.75μL，cDNA模板1μL，水补齐到25μL。PCR反应条件为：95℃5分钟，95℃25秒，58℃30秒，72℃30秒，共35个循环，72℃5分钟，15℃保温。反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，检测到目的条带后，切胶并进行胶回收，胶回收方法根据BioTeke公司的快捷型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Cat#DP1722)进行。

高保真酶扩增的产物末端是平末端，需要添加poly-A后才能进行TA克隆，反应体系如下：10′反应缓冲液1.5μL，脱氧核糖核酸(dNTP)1.2μL，Easy Taq酶0.15μL，胶回收产物补齐15μL。之后再72℃30分钟。

取4μL加尾产物与pEASY-T1克隆载体进行连接，操作步骤按照全式金公司的产品pEASY-T1说明书进行.然后连接产物使用热激法转化大肠杆菌DH5α菌株，在含有氨苄青霉素的LB平板上生长过夜。挑取白色单个菌落在LB平板上划线，进行菌落PCR，反应体系如上，选取阳性菌落在LB液体培养基中过夜。

质粒DNA的提取：使用康为世纪高纯度质粒小提取试剂盒(CW0500A)提取质粒DNA。

序列测定：本工作在北京六合华大基因科技股份有限公司进行。

表达载体的构建：用Mlu1和Sal1酶切测序正确的质粒和带有Cas9的PZP211空载体，37℃酶切一个小时之后，进行琼脂糖凝胶电泳，选取正确的条带进行胶回收，将胶回收产物用Thermo公司的T4DNA连接酶连接，连接产物转化DH5α菌株，在含有SPE的LB平板上生长过夜。挑取白色单个菌落在LB平板上划线，进行菌落PCR，选取阳性菌落在LB液体培养基中过夜。质粒DNA的提取：使用康为世纪高纯度质粒小提取试剂盒提取质粒DNA，构建得到PZP211-35S::Cas9:Tnos-BdU6::BdID1.C1与PZP211-35S::Cas9:Tnos-BdU6::BdID1.C2载体。

(2)转基因苗的获得：使用农杆菌侵染的方式获得超表达转基因植株。

利用上述载体用CRISPR/Cas9技术成功敲除了二穗短柄草中的ID1基因，获得了突变了不同位点的两个转基因株系，分别命名为BdID1-KO1和BdID1-KO2。这两个位点均在基因编码区的前段，由于INDEL突变引起的移码，从而导致BdID1基因的完全敲除。与玉米和水稻中相似，BdID1-KO1和BdID1-KO2均表现出极度晚花的表型，在18h/6h的长日照条件下生长超过130天仍然未能抽穗(图7)。

二穗短柄草和小麦属于温带禾本科植物，过表达实验表明：35S启动子驱动的二穗短柄草ID1基因能够互补水稻rid1突变体，促进二穗短柄草转基因植株的开花并且抑制株高；玉米Ubi1启动子驱动的二穗短柄草ID1基因转化二穗短柄草导致更强烈早花和矮化表型。构建小麦A、B基因组上ID1基因的过表达载体，转化二穗短柄草，发现转基因植株也呈现早花和矮化的表型，这说明该基因在功能上与二穗短柄草的ID1基因一致。

除此之外本发明中ID1基因及含有该基因的植物表达载体也可以用于生产其它可以改良农艺性状的转基因植物，如小麦、大麦、玉米、高粱等禾本科作物，包括此类转基因植物的器官、组织、细胞及其种子和后代。

Claims (3)

1.一个调控禾本科植物株高基因INDETERMINATE1 ID1，其特征在于：来源于二穗短柄草，命名为BdID1，其cDNA全长如SEQ ID NO.1所示，其编码区如序列表SEQ ID NO：2所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。

2.一个调控禾本科植物株高基因INDETERMINATE1(ID1)，其特征在于：来源于小麦，命名为TaID1，TaID1_6AS的编码区全长如序列表SEQ ID NO：4所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示；TaID1_6BS的编码区全长如序列表SEQ ID NO：6所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQID NO：7所示。

3.权利要求1或2所述的基因在调控禾本科植物株高上的应用。