CN104962486B - 来自海洋的亚罗酵母fa2-3及其所产低温淀粉酶与产酶方法 - Google Patents

来自海洋的亚罗酵母fa2-3及其所产低温淀粉酶与产酶方法 Download PDF

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Abstract

本发明是一种来自海洋的亚罗酵母（Yarrowia sp.）FA2‑3，CGMCC N0.10377。菌株FA2‑3为长椭圆形，单个分散，出芽生殖。菌落呈白色，边缘整齐。该菌株生长温度范围为15‑35℃，最适生长温度为30℃；生长pH范围为5.0−10.0，最适生长pH为7.0；菌株在NaCl浓度为0%‑8%范围内能生长，最适生长的NaCl浓度为0.5%。本发明还公开了一种利用菌株FA2‑3产低温淀粉酶的方法和按该方法得到的低温淀粉酶产品。该低温淀粉酶在饲料、环保等领域具有广泛的应用前景。

Description

来自海洋的亚罗酵母FA2-3及其所产低温淀粉酶与产酶方法
技术领域
本发明涉及一种微生物，特别是一种分离自中国江苏省连云港海域海泥的亚罗酵母（Yarrowia sp.）FA2-3；本发明还涉及该菌株产低温淀粉酶的方法及产品。
背景技术
淀粉酶(Amylase)是能催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一群酶的总称，广泛存在于动植物和微生物中，并广泛应用于造纸、食品、医药工业和洗涤剂工业。普通淀粉酶和高温淀粉酶在淀粉水解工艺处理中温度较高、原料容易变质，制约了淀粉酶的进一步应用。低温酶(Cold temperature-enzyme)是指在低温条件下能有效催化生化反应的一类酶，最适反应温度比普通酶要低20～30℃，而且在0℃有一定的活性。低温淀粉酶酶促作用温度低，在不加热的情况下就可以保证较高的催化效率。另外，在生产中由于低温淀粉酶对热敏感，所以可以通过较低温度的热处理就可以使酶失活，节约了能源。
低温淀粉酶的特殊性质使其在工业生产应用中具有一定的优势，食品行业是低温淀粉酶的一个重要应用领域，很多风味物质为保持其风味不丢失，常常需要在低温条件下发酵。0-20 ℃温度范围内(此时同源的嗜温型酶不活泼)，低温微生物具有高生长速率、高酶活力及高催化效率，可大大缩短处理过程的时间并省却昂贵的加热等系统，因此在节能方面有相当大的优势。与此同时低温发酵还能够减少中温菌的污染的危险，尤其是在连续发酵操作中。
环境治理是低温酶又一个应用领域，在低温条件下来自低温微生物的淀粉酶催化速度较嗜温型淀粉酶更快，低温微生物及其产生的淀粉酶还可替代化学方法，这些特点可以使废水处理费用降到最低程度。另外在一些季节性变化幅度大的地区，温度变化很大，这就使微生物分解有机污染物如大分子碳水化合物和类脂的效率降低。将能够分泌低温淀粉酶等酶类的低温微生物接种到这种环境里去，则有助于提高对难处理化学物质的生物降解能力。这些微生物具有高催化活性酶及它们在较低温度下的特殊专一性，使得低温微生物及其产生的低温淀粉酶成为生物治理的理想工具。另外，由于低温淀粉酶在0-20℃的温度范围内具有高活性的特点，因此，其在饲料、纺织和洗涤工业的应用方面同样具有较大的潜力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的能产低温淀粉酶的来自海洋的亚罗酵母FA2-3。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述来自海洋的亚罗酵母FA2-3产低温淀粉酶的方法及其所产低温淀粉酶。
本发明的特征包括来自海洋的亚罗酵母（Yarrowiasp.）FA2-3菌株本身（以下称菌株FA2-3），以及利用该菌株发酵生产低温淀粉酶的方法。
本发明所涉及的菌株FA2-3是在中国江苏省连云港海域的海泥中分离到的菌株，该菌株已于2015年1月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 10377；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355。
以下对本发明进行详细的阐述。
一、本发明菌株FA2-3的形态特征与生理生化特征。
1.1形态特征：
菌株FA2-3为长椭圆形，单个分散，出芽生殖(见图1)。菌落呈白色，边缘整齐。
1.2菌株FA2-3的序列的扩增和分析：
用酵母基因组DNA提取试剂盒提取得到FA2-3的基因组，18SrDNA序列扩增引物，扩增大小约1.8k，NS1 5-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3，NS8 5-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3。反应总体系-30ul，PCR mix（26μL），上下游引物（各1μL），DNA模板（2μL）。反应程序：95℃变性4min；94℃变性20S，55-60℃退火45S，72℃延伸120S，35个循环；72℃2min。将PCR电泳纯化回收并构建克隆载体，选阳性克隆子提取质粒送至南京思普金生物科技有限公司测序，将测得序列互补反相拼接后，获得的1441bp碱基片段序列，根据测序结果，在NCBI中将所得序列分别与Genbank数据库中其它酵母菌的18S rDNA序列用BLASTN进行同源性比对，并构建系统发育树（见图2），结果发现与亚罗酵母(Yarrowia）最接近。
二、本发明菌株FA2-3的生长特性
本发明提供的菌株FA2-3，对其生长特性进行了细致的研究，基本摸清不同条件下该菌的生长情况。
2.1本发明中涉及的培养基：
YPD培养基：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂2%，陈海水配制，pH 7.0；
所述的产酶培养基为：马铃薯淀粉0.5%，花生粕0.5%，NaCl 0.5%，pH 7.0。
2.2种子液的制备：将菌株FA2-3斜面种子接种到YPD培养基中, 30℃, 150 r/min, 装液量20%，培养12 h。
2.3培养时间对菌株FA2-3生长的影响：
将种子液4%接种至YPD培养基中，30℃，150r/min培养48h，每隔4h取一次样，于OD600下测定其菌浓度。菌株8h进入对数期，在20h进入稳定期，见图3。
2.4温度对菌株FA2-3生长的影响：
分别在不同温度(15 ℃、20℃、25℃、30℃、35℃)下，150r/min培养12h，测定OD值。该菌株生长温度范围为15-35℃，最适生长温度为30℃，见图4。
2.5 培养基pH对菌株FA2-3生长的影响：
培养基pH范围4.0−10.0，30℃，150r/min培养12h，测定OD值。生长pH范围为5-10，最适生长pH为7.0，见图5。
2.6 NaCl浓度对菌株FA2-3生长的影响：
培养基用自来水配制, NaCl浓度为0%-8%，30℃，150r/min培养12h，测定OD值。菌株在NaCl浓度为0%-8%范围内能生长，最适生长的NaCl浓度为0.5%，见图6。
三、菌株FA2-3发酵生产低温淀粉酶的方法
发明人对菌株FA2-3发酵生产低温淀粉酶的方法进行了研究。
3.1培养时间对菌株FA2-3产酶影响：
将种子液以4%的接种量接种至产酶培养基液体培养基内，30℃、150r/min摇床培养40h，每隔4h取一次样，测定酶活力。产酶时间为20h时间，产酶量达最高，见图7。
3.2温度对菌株FA2-3产酶影响：
在不同温度(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃)下培养20h，其余条件同3.1，分别测酶液的活力，FA2-3最佳产酶温度为25℃，结果见图8。
3.3培养基pH对菌株FA2-3产酶的影响：
将产酶液体培养基的pH调节至5-10，在25℃、150 r/min下振荡培养20h，测酶活，该菌株在pH5.0-10.0范围内产酶良好，最适产酶pH为7.0，见图9。
3.4 NaCl浓度对菌株FA2-3产酶的影响：
培养基用自来水配制, NaCl浓度0%-8%, 在最适温度和pH下培养, 其余条件同3.1，测酶活，该菌株在NaCl浓度0%-4%产酶较好，最适产酶NaCl浓度为0.5%，见图10。
3.5 碳源对菌株FA2-3产酶的影响：
0.5%的碳源（酵母粉，玉米淀粉，蔗糖，麦芽糖，山芋淀粉，马铃薯淀粉，麸皮，糊精，淀粉糖，甘油，葡萄糖，绿豆淀粉，乳糖），分别替换产酶培养基中的酵母膏，其余条件同3.1，测酶活。结果见表1，酵母菌在以甘油为碳源的培养基中产酶最多，蔗糖次之，葡萄糖和马铃薯淀粉也能使菌株产酶，从应用角度马铃薯淀粉考虑作为适宜碳源。
表1 碳源对产酶的影响
3.6 氮源对菌株FA2-3产酶的影响：
0.5%的氮源（0.5%，硫酸铵，硝酸钠，豆粕粉，鱼粉蛋白胨，胰蛋白胨，干酪素，鱼粉，花生粕，尿素）分别替换产酶培养基中的蛋白胨，其余条件同3.1，测酶活。结果见表2，酵母菌在以花生粕为氮源的培养基中产酶最多。
表2 氮源对菌株产酶的影响
四、低温右旋糖苷酶的性质
4.1 粗酶液的制备：
将种子液4%接种至产酶培养基中，25℃，150r/min培养20h，10000r/min离心10min，取上清液即为低温淀粉酶粗酶液。
4.2 酶作用温度对酶活性的影响：
将低温淀粉酶置于不同温度（0℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）下与底物发生反应，测定酶活力。酶的最适作用温度为30℃，在0℃下仍有酶活力，说明该酶是低温酶。结果见图11。
4.3酶的热稳定性：
取适量酶液分别在不同温度（30℃、40℃和50℃）下保温1-5h，每隔1h取出一组样品，迅速置于4℃冰箱内，待保温结束后统一在标准条件下测定残余酶活，以未处理酶液的酶活设为100%。该酶在30℃下具有很好的热稳定性，在5h仍有85.8%的酶活力，见图12。
4.4酶的作用pH对酶活性的影响 ：
用不同pH（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0）的伯瑞坦-罗宾森（Britton-Robinson）缓冲溶液配置含1%的淀粉溶液作为底物，在30℃的水浴中测定不同pH下的淀粉酶酶活力。pH8.0该酶的活性最高，见图13。
4.5 酶的pH稳定性：
将酶液与不同pH的伯瑞坦-罗宾森（Britton-Robinson）缓冲溶液混合，pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，在30℃水浴锅中保温1h 取出测定残余酶活，将未处理酶液的酶活设为100%。在pH4.0-9.0之间酶都能保持80%以上的较高酶活力，见图14。
4.6金属离子、化学试剂对酶的作用：
将各种金属离子与酶液混合，使其最终浓度达到5.0mM，然后在30℃下测酶活，Ba2 +、Ca2+、Mg2+和Sr2+对酶有激活作用。NH4+、Cu2+、Co2+对酶有不同程度的抑制作用，见表3。
表3 金属离子对酶活力的影响
4.7 低温淀粉酶活测定：
将50μL酶液加入到150 μL 1%的可溶性淀粉Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH8.0)中，在30℃水浴中反应15 min，用DNS法测定还原糖量。酶活力单位定义(U/mL)：在一定温度和pH下，每分钟催化产1umoL还原糖的酶量为一个活力单位。
与现有技术相比，本发明提供了一种新的来自海洋的亚罗酵母（Yarrowia sp.）FA2-3，该菌株可以产低温淀粉酶，所产酶性质稳定，酶活性好，可以用于现有技术常规低温淀粉酶的应用场合，包括食品行业、饲料行业和环境治理行业。
附图说明
图1为菌株FA2-3形态(×10 000)图；
图2为菌株FA2-3系统进化树图；
图3为时间对菌株FA2-3生长的影响图；
图4为温度对菌株FA2-3生长的影响图；
图5为pH对菌株FA2-3生长的影响图；
图6为NaCl浓度对菌株FA2-3生长的影响图；
图7为时间对菌株FA2-3发酵产酶的影响图；
图8为温度对菌株FA2-3发酵产酶的影响图；
图9为pH对菌株FA2-3发酵产酶的影响图；
图10为NaCl浓度对菌株FA2-3发酵产酶的影响图；
图11为温度对酶活力的影响图；
图12为酶的热稳定性图；
图13为pH对酶活力的影响图；
图14为酶的pH稳定性图。
具体实施方式
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1，一种来自海洋的亚罗酵母（Yarrowia sp.）FA2-3，CGMCC N0. 10377。该菌株具有以下特征：菌株FA2-3为长椭圆形，单个分散，出芽生殖(见图1)。菌落呈白色，边缘整齐。菌株FA2-3生长特性为：该菌株生长温度范围为15-35℃，最适生长温度为30℃；生长pH范围为5.0−10.0，最适生长pH为7.0；菌株在NaCl浓度为0%-8%范围内能生长，最适生长的NaCl浓度为0.5%。
实施例2，一种如实施例1所述的来自海洋的亚罗酵母FA2-3产低温淀粉酶的方法，其步骤如下：将亚罗酵母FA2-3斜面种子接种到YPD培养基中, 30℃, 150 r/min, 装液量20%，培养12 h，得种子液；将种子液以4%的接种量接种于产酶培养基中，150r/min，25℃培养20h，10000r/min离心5min，取上清液即为低温淀粉酶粗酶液。
实施例3，一种如实施例2中所述的来自海洋的亚罗酵母FA2-3产低温淀粉酶的方法所产低温淀粉酶，所述的低温淀粉酶的性质为：低温淀粉酶的最适作用温度为30℃，在0℃下仍有酶活力；最适作用pH为8.0。该酶在30℃下具有很好的热稳定性，在5h仍有85.8%的酶活力，在pH 4.0-9.0该酶稳定；Ba2+、Ca2+、Mg2+和Sr2+对酶有激活作用，NH4+、Cu2+、Co2+对酶有不同程度的抑制作用。

Claims (2)

1.一种来自海洋的亚罗酵母（Yarrowia sp.）FA2-3，其特征在于：其保藏号为CGMCCN0. 10377。
2.一种如权利要求1所述的来自海洋的亚罗酵母（Yarrowia sp.）FA2-3产低温淀粉酶的方法，其特征在于，其步骤如下：将亚罗酵母（Yarrowia sp.）FA2-3斜面种子接种到YPD培养基中, 30℃, 150 r/min, 装液量20%，培养12 h，得种子液；将种子液以4%的接种量接种于产酶培养基中，150r/min，25℃培养20h，10000r/min离心5min，取上清液即为低温淀粉酶粗酶液；所述的YPD培养基为：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，陈海水配制，pH 7.0；所述的产酶培养基为：马铃薯淀粉0.5%，花生粕0.5%，NaCl 0.5%，自来水配制，pH 7.0。
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